Maklumat

Had Pengecualian dan kebolehtelapan membran luar

Had Pengecualian dan kebolehtelapan membran luar


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Menurut buku teks ini:

P aeruginosa, sebagai contoh, yang sangat tahan terhadap agen antibakteria, membran luar adalah 100 kali kurang telap daripada E coli.[ms.no 27]

dan kemudian pada halaman yang sama:

Porin spesies yang berbeza mempunyai had pengecualian yang berbeza, daripada berat molekul kira-kira 600 dalam E coli dan S typhimurium kepada lebih daripada 3000 dalam P aeruginosa.

Bagaimanakah P. aeruginosa boleh mempunyai kebolehtelapan yang lebih rendah daripada E. coli, jika had pengecualiannya lebih besar daripada E.coli?


Percubaan saya:

Sumber ini mendakwa bahawa

OprF menyediakan membran luar P. aeruginosa dengan had pengecualian 500 Da.

Ini (500 Da.) lebih dekat daripada E. coli 600 Da., jadi bagaimanakah ia sangat tahan?


Menolak Sampul Bakteria

4.2.4 Vesikel Membran Luar dan Hantu Bakteria

Vesikel membran luar (OMV) dan hantu bakteria (BGs) adalah terbitan aselular sampul gram-negatif yang mengandungi protein yang diekspresikan permukaan sel induk [77-79]. OMV terdiri daripada vesikel bilamellar terbitan membran luar, diameter 50–250 nm, yang dihuraikan secara berterusan oleh bakteria gram-negatif yang semakin meningkat [77]. Paparan permukaan yang cekap pada OMV telah dicapai dengan menggabungkan protein penumpang ke E coli toksin ClyA, yang menjadi tertumpu pada struktur ini semasa vesikulasi [80] . OMV mempunyai utiliti tertentu sebagai kenderaan penghantaran vaksin kerana ia stabil semasa penyimpanan berpanjangan [81], dan sangat imunogenik (berdasarkan banyak komponen imunostimulasi OM yang disimpan oleh vesikel ini), tetapi tidak memberikan bahaya keselamatan alam sekitar yang sama seperti sel utuh kerana mereka tidak dapat membiak (lihat Kotak 4.1 ) [82–84] .

Sebaliknya, BG adalah sampul bakteria gram-negatif lengkap yang dihasilkan melalui ekspresi heterolog gen lisis yang berasal dari bakteriofaj. E (Rajah 4.2). Apabila diungkapkan, Protein E dimasukkan ke dalam IM melalui N-terminusnya, manakala domain terminal-C merentasi IM (Rajah 4.2A) dan bercantum ke dalam OM (Rajah 4.2B), mendorong percantuman kedua-dua membran. Oligomerisasi Protein E membawa kepada pembentukan "terowong lisis" (Rajah 4.2C), di mana sitoplasma dilepaskan secara ekstraselular. Walau bagaimanapun, disebabkan sifat terkawal kejadian litik dan meterai berkesan antara IM dan OM, morfologi sampul sel dan kandungan periplasmik dikekalkan [78]. Lazimnya, penambat protein asing pada BG dicapai melalui gabungan penumpang dengan protein membran luar, OmpA. Akhirnya, seperti OMV, BG adalah kenderaan yang sangat baik untuk penghantaran vaksin kerana sifat imunostimulasi yang kuat dan ketidakupayaan untuk mereplikasi [85,86].

Rajah 4.2 . Perwakilan skematik lisis akibat Protein E dan penjanaan BG. (A) Domain N-terminal Protein E dimasukkan ke dalam IM dan terminal-C translokasi ke dalam periplasma. (B) Terminal-C kemudiannya bergabung ke dalam OM untuk mendorong percantuman dengan IM. (C) Akhirnya, Protein E oligomerisasi untuk membentuk terowong lisis.

Sumber: Diadaptasi daripada Langemann et al. [78] .


Had Pengecualian dan kebolehtelapan membran luar - Biologi

JURNAL BAKTERIOLOGI, Ogos 1992, hlm. 5196-5203

0021-9193/92/165196-08$02.00/0 Hak Cipta © 1992, American Society for Microbiology

Penilaian Semula, Menggunakan Sel Utuh, Had Pengecualian dan Peranan Porin OprF dalam Kebolehtelapan Membran Luar Pseudomonas aeruginosa FRANCIS BELLIDO, NANCY L. MARTIN, RICHARD J. SIEHNEL, DAN ROBERT E. W. HANCOCK*

Jabatan Mikrobiologi, Universiti British Columbia, 300-6174 University Boulevard, Vancouver, Bnitish Columbia, Kanada V6T 1Z3 Diterima 25 Mac 1992/Diterima 9 Jun 1992

Kajian terdahulu yang menggunakan kaedah pembentukan semula membran model telah mencapai kesimpulan yang berbeza mengenai had pengecualian membran luar Pseudomonas aeruginosa dan sama ada OprF ialah protein pembentuk saluran utama dalam membran luar. Dalam kajian ini, serpihan Sall 6.2-kbp, mengekodkan hanya dua enzim sitoplasma, a-galactosidase dan hidrolase sukrosa, dan permease raffinose membran dalam, telah diklon di belakang promoter tol m-toluate-inducible vektor pNM185 untuk mencipta plasmid pFB71. Strain P. aeruginosa yang mengandungi pFB71, apabila ditanam dengan inducer, menghasilkan kedua-dua enzim yang dikodkan oleh sisipan dan telah memperoleh keupayaan untuk tumbuh pada melibiose disakarida dan rafinosa trisakarida. Kadar pertumbuhan adalah bergantung kepada kepekatan dan saiz sakarida dan dikurangkan tiga hingga lima kali ganda dengan ketiadaan OprF, seperti yang diperiksa dengan mengukur pertumbuhan pada melibiose dan rafinosa derivatif sisipan Q kekurangan OprF isogenik, H636(pFB71 ). Pada kepekatan tinggi, di-, tri-, dan tetrasakarida boleh melepasi membran luar untuk plasmolyze P. aeruginosa, seperti yang diukur oleh penyerakan cahaya dan disahkan oleh mikroskop elektron. Kinetik kadar awal perubahan penyebaran cahaya adalah bergantung kepada saiz sakarida yang digunakan. Tambahan pula, kadar perubahan dalam penyerakan cahaya akibat pengambilan rafinosa dan stakiosa merentasi membran luar untuk terikan H636 adalah lima kali ganda atau lebih rendah daripada induknya yang cukup OprF H103. Data ini konsisten dengan kajian membran model yang menunjukkan bahawa OprF ialah lucah yang paling dominan untuk sebatian yang lebih besar daripada disakarida dalam P. aeruginosa dan mencadangkan bahawa had pengecualian untuk porin ini dan membran luar adalah lebih besar daripada saiz tetrasakarida. Di samping itu, data ini mengesahkan kewujudan porin lain dengan fungsi utama dalam pengambilan monosakarida dan fungsi yang lebih kecil dalam pengambilan sakarida yang lebih besar.

Membran luar bakteria gram-negatif seperti Pseudomonas aeruginosa adalah penghalang kebolehtelapan yang dilubangi oleh saluran berisi air yang menentukan had saiz pengecualian untuk sebatian hidrofilik (9, 22). Saluran ini dibentuk oleh kelas protein transmembran yang dipanggil porin (9, 22). Protein porin F (selepas itu dinamakan semula OprF) P. aeruginosa telah diasingkan dan disusun semula menjadi liposom dan ditunjukkan dalam ujian keseimbangan (yang mana kadar resapan tidak dipertimbangkan) untuk membentuk saluran yang telap kepada dextrans dengan diameter sehingga 2 nm (11). Sebaliknya, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium di bawah keadaan yang sama didapati mempunyai porin yang tidak termasuk tetrasakarida (diameter, 1.17 nm) (11, 16). Data untuk P. aeruginosa porin OprF pada mulanya kelihatan bercanggah dengan data yang menunjukkan bahawa bakteria ini mempunyai tahap rintangan intrinsik yang tinggi terhadap antibiotik berbanding dengan E. coli dan S. typhimuium (11) serta data berikutnya yang menunjukkan bahawa P. aeruginosa mempunyai kebolehtelapan membran luar yang rendah (2, 17, 37). Memandangkan OprF merupakan protein yang banyak dalam P. aeruginosa, dicadangkan walaupun had pengecualian salurannya yang besar, OprF berfungsi dengan lemah dalam pengambilan substrat seperti antibiotik (5, 11). Keputusan yang konsisten dengan cadangan ini telah disediakan oleh kedua-dua kajian membran model membran lipid hitam (5) dan pembengkakan liposom (19, 38). Dua hipotesis berasingan telah dicadangkan untuk menjelaskan fungsi saluran OprF yang lemah. Ini adalah heterogeniti molekul, dengan molekul OprF individu *

mempunyai sama ada saluran besar (frekuensi 99%) (32), dan geometri khusus saluran OprF (19). Sejak tahun 1986, Nakae dan rakan usaha sama telah menghasilkan satu siri kertas kerja yang menyimpulkan bahawa membran luar P. aeruginosa menghalang pengambilan disakarida sekata (8, 33-36), bahawa OprF bukan porin (8, 36), dan yang sebenarnya porin P. aeruginosa ialah tiga protein bernama C, D, dan E (36). Metodologi yang digunakan untuk mencapai kesimpulan ini melibatkan kedua-dua metodologi pembengkakan liposom (8, 35, 36) dan eksperimen plasmolisis (25, 26). Walaupun setiap kajian ini telah dikritik secara khusus berdasarkan metodologi yang cacat (18, 19, 27), adalah membimbangkan bahawa teknik yang sama, iaitu, pembengkakan liposom, di tangan dua kumpulan yang berbeza, boleh menimbulkan perbezaan yang sedemikian. keputusan (36, 38). Di samping itu, strain kekurangan OprF yang dihasilkan oleh bahan kimia (8, 17) atau genetik molekul (30) tidak mempunyai perubahan atau perubahan kecil dalam kerentanan antibiotik dan dengan itu gagal menyokong kesimpulan bahawa OprF ialah protein porin utama P. aeruginosa . Sebaliknya, kekurangan perubahan dalam kerentanan antibiotik ini dicadangkan disebabkan oleh perubahan besar dalam kebolehtelapan sel, bentuk, dan ciri-ciri pertumbuhan yang terhasil daripada peranan OprF dalam

membran luar dan struktur sel (8, 31). Oleh itu, kami memutuskan untuk mengkaji semula masalah ini dengan menggunakan protokol eksperimen in vivo untuk menghapuskan artifak berpotensi yang disebabkan oleh kajian membran model. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa membran luar P. aeruginosa membenarkan resapan molekul gula sebesar raffinose (trisakarida) atau

stachyose (tetrasaccharide) dan seterusnya mencadangkan bahawa OprF

Pengarang sama. 5196

adalah saluran utama tetapi tidak semestinya satu-satunya saluran yang terlibat dalam pengambilan sakarida ini. BAHAN DAN KAEDAH Strain bakteria, plasmid, dan keadaan pertumbuhan. P. aeruginosa PAO1 strain auxotrophic H103 (30) telah digunakan sebagai strain jenis liar yang mengandungi OprF. P. aeruginosa H636 ialah terbitan oprF::fQ bagi terikan H103 yang dicipta oleh penggantian gen dengan gen oprF bermutasi serpihan fl (30). E. coli DH5a F' [F' end41 hsdRl7 (rK- mK+) supE44 thi-1 recAl gyrA96 reAl X- +80dlacZAM15 A(lacZYA argF) U169] (30) telah digunakan untuk pengklonan primer, manakala E. coli SM10 (28 ), yang mengandungi plasmid RP1 bermutasi yang disepadukan ke dalam kromosom, telah digunakan untuk mengawan dua ibu bapa plasmid daripada E. coli kepada P. aeruginosa. E. coli DS25-91 (lacY melB metB rpsL raf?) (3) yang mengandungi penggunaan raffinose, 130-kbp plasmid pRSD2-1 dengan mutasi konstitutif diperoleh daripada R. Schmitt (Lehrstuhl fuir Genetik, Universitat Regensburg, Regensburg, Jerman ). Serpihan SalI 6.2-kb daripada pRSD2-1 (rafR [RafC] Tra+ InI) telah dijujukan sepenuhnya (nombor akses GenBank, M27273) dan ditunjukkan untuk mengekod hanya tiga gen struktur, rafA (oagalactosidase), rafB (peresapan raffinose membran dalam) , dan rafD (sukrosa hidrolase), dan gen terpenggal, rakit (gen penindas) (3). Serpihan ini dikeluarkan daripada pRSD2-1 dan dimasukkan ke dalam tapak SalI bagi vektor ekspresi terkawal m-toluate atau benzoate pNM185 (Kmr Smr pmTOL mob' tra +) (15) untuk mencipta pFB71. Untuk mencipta tapak SalT yang unik dalam plasmid pNM185, penyesuai EcoRI-SalI perlu dimasukkan ke dalam tapak EcoRI unik plasmid ini. Plasmid pFB71 digunakan untuk mengubah E. coli SM10, dengan pemilihan penanda rintangan antibiotik khusus plasmid dan pertumbuhan pada rafinosa, dan kemudian dipindahkan ke strain H103 dan H636 melalui konjugasi, menggunakan fungsi mob yang dikodkan pada vektor (3, 7) dan gen tra dimasukkan ke dalam kromosom SM10 (28). Terikan secara rutin ditanam pada medium sup Luria (0.8% Bacto Tryptone, 0.5% ekstrak yis), mengandungi 150 mM NaCl, dipejalkan apabila sesuai dengan 2% (berat/vol) agar Bacto (30). Untuk eksperimen yang melibatkan pertumbuhan pada sumber karbon tertentu, strain E. coli ditanam pada medium minimum AB (6) manakala strain P. aeruginosa ditanam pada medium minimum BM2 (2). Untuk eksperimen pertumbuhan, bakteria yang tumbuh ke fasa pertengahan eksponen pada medium minimum dengan glukonat (P. aeruginosa) atau gliserol (E. coli) sebagai sumber karbon telah disubkultur 1 dalam 50 ke dalam medium segar prapanas yang mengandungi paras sakarida yang ditentukan dan ditanam dengan bergegar pada 37°C. Sampel (1 ml setiap satu) diambil pada selang masa yang tetap untukA6. ukuran. Untuk pengukuran pertumbuhan Km (iaitu, kepekatan sumber karbon yang menghasilkan separuh daripada kadar pertumbuhan maksimum), timbal balik kadar pertumbuhan awal telah diplotkan terhadap timbal balik kepekatan sakarida untuk memberikan garisan dengan pekali korelasi r melebihi 0.92 (mesti dinyatakan bahawa data ini mencerminkan resapan membran luar hanya jika peristiwa ini menghadkan kadar untuk pertumbuhan, seperti yang dihujahkan dalam rujukan 20 dan 37 dan ke bawah). Nilai Km Pertumbuhan dikira daripada pintasan pada paksi ordinat (-l/Km). Raffinose dan melibiose (>99.5% tulen) diperoleh daripada Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.). Kekurangan pencemaran ketara oleh sakarida yang lebih kecil didedahkan oleh ketidakupayaan strain P. aeruginosa dan E. coli untuk tumbuh pada paras tinggi sakarida ini melainkan ia mengandungi plasmid.

pFB71. Eksperimen penyebaran cahaya. Sel yang tumbuh dalam medium BM2

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

yang mengandungi 10 mM glukonat dikumpul melalui sentrifugasi pada 3,000 x g dan digantung semula secara perlahan-lahan dalam penimbal 10 mM MOPS (asid morpholinepropanesulfonic) (pH 6.5) yang mengandungi 5 mM MgCl2 dan 300 mosM kepekatan pelbagai gula. Pengukuran penyebaran cahaya dilakukan dengan meletakkan 1 ml sel ke dalam pemegang kuvet Spektrofluorimeter Perkin-Elmer 650-1OS dengan panjang gelombang pancaran dan pengujaan ditetapkan pada 600 nm dan lebar celah ditetapkan pada 2 nm. Penyerakan cahaya dalam unit sewenang-wenangnya direkodkan secara berterusan sehingga 60 minit. Mikroskopi elektron. Sel-sel telah diinkubasi dalam 300 mosM glukosa, melibiose, raffinose, atau stacchyose dengan dan tanpa 10 mM KCN ​​selama 30 minit, selepas itu glutaraldehid ditambah kepada kepekatan akhir 2.5%. Eksperimen kawalan mendedahkan bahawa KCN tidak mempengaruhi kadar plasmolisis, seperti yang ditunjukkan oleh eksperimen penyebaran cahaya. Selepas 3 jam, sel-sel telah dibasuh dan diperbaiki dalam 1% osmium tetroksida selama 2 jam, dehidrasi dalam siri etanol (25, 50, 80, 95, dan 100%), dan kemudian dibenamkan dalam Araldite. Bahagian nipis dipotong dengan Ultracut Reichert Ultramicrotome OM U4, dikumpulkan pada grid kuprum bersalut karbon, dan dicemari dengan uranil asetat dan plumbum sitrat. Semua sampel telah diperiksa dengan mikroskop elektron penghantaran Zeiss EM 10C yang beroperasi pada 60 kV. Ujian enzim. Tahap aktiviti sukrosa hidrolase dan a-galactosidase telah ditentukan dalam sel yang tumbuh secara eksponen dalam medium minimum yang sesuai (Jadual 1) dengan atau tanpa induser (0.1 dan 5 mM m-toluate untuk E. coli dan P. aeruginosa, masing-masing). Ekstrak mentah telah disediakan dengan menyonikasikan sel tiga kali selama 30 s pada 0°C dengan kuar kecil penyekat sonik Fisher (model 300) pada tahap keluaran relatif 35%. Aktiviti sukrosa hidrolase dan a-galactosidase diukur seperti yang diterangkan di tempat lain (24, 25). KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN Pertumbuhan pada rafinosa. Woodruff dan Hancock (30, 31) sebelum ini mencadangkan bahawa kecacatan struktur utama dalam membran luar P. aeruginosa, akibat kehilangan OprF dalam ketegangan H636::Q, menghalang kesimpulan muktamad mengenai peranan OprF dalam kerentanan antibiotik. Beberapa antibiotik, termasuk 13-laktam, telah dicadangkan untuk dapat melalui membran luar dengan menggunakan laluan nonporin (10) yang boleh mengimbangi sebahagiannya untuk kehilangan laluan porin (30). Kami beralasan, bagaimanapun, bahawa oligosakarida hidrofilik tidak akan dapat melalui membran luar dengan menggunakan laluan nonporin. Oleh itu, jika OprF benar-benar merupakan porin utama P. aeruginosa, kehilangannya akan menyebabkan perubahan dalam pertumbuhan Km untuk sakarida. Malangnya, P. aeruginosa tidak dapat tumbuh pada mana-mana sakarida yang lebih besar daripada monosakarida, hasil yang boleh mencerminkan had pengecualian monosakarida untuk membran luar, seperti yang dicadangkan oleh Yoneyama et al. (33, 34), atau boleh mencerminkan kekurangan enzim yang sesuai. Oleh itu, kami cuba menyediakan keupayaan metabolik yang sesuai dengan mengklonkan operon penggunaan raffinose daripada plasmid E. coli pRSD2-1 ke dalam P. aeruginosa. Serpihan SalI 6.2-kb telah diklon sepenuhnya dan mengandungi hanya sebahagian daripada penindas yang dikodkan rafR sebagai tambahan kepada gen untuk dua enzim sitoplasma, cx-galactosidase dan sukrosa hidrolase, dan satu permease membran dalaman integral (7). Pada asalnya serpihan itu diklonkan ke dalam vektor ekspresi pVDtac (6) di belakang promoter tac dalam plasmid pFB15. Walaupun keputusan yang serupa dengan yang diterangkan di bawah telah diperolehi (seperti yang disemak secara ringkas dalam rujukan 4), ungkapan tac yang lemah

JADUAL 1. Aktiviti sukrosa hidrolase dan a-galactosidase E. coli DH5a(pFB71) dan P. aeruginosa H103(pFB71) dan H636(pFB71) aktiviti a-Galactosidase (,umol ofp-nitrophenol liberated/min/mg protein)C

Aktiviti hidrolase sukrosa

(1tmol glukosa terbebas/min/mg protein)

Raffinose Melibiose Terkawal

. toluat sebagai inducer. Kultur P. aeruginosa H103(pFB71) dan H636(pFB71) mengandungi 5 mM m-toluate

sebagai inducer, kerana 0.1 mM m-toluate gagal mendorong tahap yang boleh dikesan bagi mana-mana enzim. Untuk E. coli DH5a(pFB71), 5 mM m-toluate adalah toksik. Kepekatan sumber karbon yang digunakan ialah 50 mM glukonat, gliserol, dan melibiose atau 100 mM rafinosa. I Bermaksud ± sisihan piawai bagi tiga ujian bebas aktiviti khusus yang dinyatakan sebagai mikromol glukosa yang dibebaskan seminit setiap miligram protein pada 3rC. Memandangkan ekstrak menggunakan kesemua glukosa yang diperoleh daripada sel, kepekatan latar belakang (kira-kira 30 hingga 40% daripada nombor yang diberikan) dalam kultur bebas plasmid atau tidak diinduksi telah ditolak. C Bermakna ± sisihan piawai bagi tiga ujian aktiviti khusus yang dinyatakan sebagai mikromol p-nitrophenol yang dibebaskan seminit setiap miligram protein pada 37°C. Aktiviti d a-Galactosidase diukur selepas pertumbuhan pada glukonat, kerana ini adalah sumber karbon kawalan yang digunakan dalam eksperimen pertumbuhan. Walau bagaimanapun, glukonat mengganggu ujian hidrolase sukrosa, jadi ini dilakukan selepas pertumbuhan gliserol (E. coli) atau suksinat (P. aeruginosa).

promoter dalam P. aeruginosa dalam sederhana minimum (14) menghasilkan pertumbuhan yang sangat perlahan pada gula dan masa jeda yang panjang (10 hingga 24 jam). Oleh itu, kami menyusun semula serpihan SalI 6.2-kb yang diterangkan di atas di belakang promoter tol yang boleh diinduksi m-toluate dalam plasmid pNM185. Plasmid pFB71 yang terhasil membenarkan E. gegelung DHSa untuk mengekspresikan a-galactosidase dan sukrosa hidrolase di bawah keadaan induksi (Jadual 1) dan berkembang pada rafinosa (Jadual 2). Selepas pemindahan plasmid pFB71 ke dalam P. aeruginosa H103, paras besar kedua-dua sukrosa hidrolase dan ot-galactosidase telah diinduksi apabila strain ini ditanam dalam suksinat atau glukonat dengan 5 mM m-toluate ditambah (Jadual 1). Paras toluat yang lebih rendah (iaitu, 0.1 mM) gagal mendorong enzim berkod plasmiden ini. Strain H103 yang mengandungi plasmid telah memperoleh keupayaan untuk berkembang pada disaccharides melibiose dan raffinose (Rajah 1), manakala strain H103 yang kurang plasmid (Rajah 1) atau strain H103 yang mengandungi vektor pNM185 (data tidak ditunjukkan) tidak. Sebaliknya, plasmid pFB71 tidak mempengaruhi pertumbuhan pada glukonat (Rajah 1). Selaras dengan pemerhatian ini, terikan H103(pFB71) yang tumbuh pada raffinose atau melibiose dengan kehadiran 5 mM m-toluate, sebagai inducer, menghasilkan paras tinggi kedua-dua sukrosa hidrolase dan a-galactosidase (Jadual 1). Pemerolehan keupayaan H103(pFB71) untuk tumbuh pada melibiose dan rafinosa menunjukkan bahawa kedua-dua di- dan trisakarida boleh melepasi membran luar, kerana sisipan dalam pFB71 hanya mengandungi permease membran dalam dan dua enzim sitoplasma. Selaras dengan tafsiran ini, kami tidak dapat mengenal pasti sebarang aktiviti enzim dalam supematan sel. Tambahan pula, pada kepekatan tetap sakarida (50 mM), terikan H103(pFB71) JADUAL 2. Pertumbuhan Km pada sumber karbon berbeza untuk sumber strain E. coli dan P. aeruginosa

Glukonat Melibiose Raffinose

berkembang lebih cepat pada disakarida melibiose daripada pada trisakarida rafinosa (Rajah 1), satu penemuan yang ditafsirkan sebagai hasil sebahagian daripada saiz sakarida ini berbanding dengan saiz saluran porin dalam membran luar. Untuk menguji peranan OprF dalam pengangkutan gula, plasmid pFB71 telah diperkenalkan ke dalam terikan H636, mutan sisipan Qt yang kekurangan OprF bagi terikan H103. H636(pFB71), ditanam dengan kehadiran 5 mM m-toluate sebagai inducer, menyatakan tahap sukrosa hidrolase dan a-galactosidase yang tidak dapat dibezakan daripada strain H103(pFB71) (Jadual 1). Strain H636(pFB71) berkembang pada kadar yang sama seperti strain H103(pFB71) pada medium glukonat minimum pada julat kepekatan glukonat 50 kali ganda (lihat Rajah 3). Ini mencadangkan bahawa porin selain OprF adalah dominan dalam laluan glukonat merentasi membran luar. Sebaliknya, H636 (pFB71) berkembang lebih perlahan daripada H103(pFB71) pada kedua-dua raffinose (Rajah 2 dan 3) dan melibiose (Rajah 3). Pada kepekatan menghadkan kadar pertumbuhan, kadar pertumbuhan mutan OprFdeficient hanya 20% (untuk raffinose) hingga 33% (untuk melibiose) berbanding strain induknya yang mengandungi OprF, dan

a Km Pertumbuhan. ditakrifkan dalam rujukan 20, ialah kepekatan sumber karbon yang menghasilkan kadar pertumbuhan maksimum 50%, diambil daripada keputusan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. b Kerana kesan toksik pada pertumbuhan P. aenrginosa kepekatan rafinosa >200 mM, adalah tidak mungkin untuk menentukan dengan tepat Km pertumbuhan dalam kes ini, yang mana hanya tiga titik datum tersedia (Rajah 3).

Masa (jam) FIG. 1. Pertumbuhan P. aeruginosa H103 dengan (garisan pepejal) atau tanpa (garisan putus) plasmid penggunaan raffinose pFB71. Substrat pertumbuhan (pada 50 mM) adalah glukonat (bulatan), melibiose (segi tiga), dan rafinosa (segi empat).

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

0.1 R_Q) 0 20 40 60 80 100 120 140

Masa (jam) FIG. 2. Pertumbuhan terikan H103(pFB71) (garisan pepejal) dan oprF::fl mutant H636(pFB71) (garis putus) pada 100 mM rafinosa.

perbezaan ini adalah ketara secara statistik (P 3MB Saiz 0 Muat Turun 0 Paparan


Bidang mata pelajaran ASJC Scopus

  • APA
  • Pengarang
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standard
  • RIS
  • Vancouver

Dalam: Journal of bacteriology , Vol. 136, No 1, 01.12.1978, hlm. 381-390.

Hasil penyelidikan : Sumbangan kepada jurnal › Artikel › semakan rakan sebaya

T1 - Membran luar bakteria gram-negatif. XIX. Pengasingan daripada Pseudomonas aeruginosa PAO1 dan penggunaan dalam penyusunan semula dan definisi halangan kebolehtelapan

N2 - Satu kaedah untuk mengasingkan membran luar dan dalam P. aeruginosa PAO1 tanpa ketiadaan asid etilenadiaminetetraacetic tambahan telah dicipta. Kaedah ini menghasilkan dua pecahan membran luar yang menunjukkan corak protein yang sama pada elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida, tetapi berbeza dengan ketara dalam kandungan relatifnya fosfolipid. Salah satu daripada pecahan membran luar dan pecahan membran dalam adalah kurang daripada 4% tercemar silang, seperti yang dinilai oleh kandungan penanda membran dalam dan luar biasa. Membran luar mengandungi empat jalur protein utama dengan berat molekul ketara 37,000, 35,000, 21,000, dan 17,000. Vesikel yang dibentuk semula daripada lipopolysaccharide dan fosfolipid adalah tidak telap kepada semua sakarida yang termasuk dalam vesikel semasa pembentukan vesikel. Apabila vesikel mengandungi protein membran luar, mereka hanya mengekalkan sepenuhnya sakarida yang mempunyai berat molekul lebih daripada 9,000, menunjukkan bahawa had pengecualian membran luar P. aeruginosa untuk sakarida adalah jauh lebih besar daripada angka (500 hingga 600 dalton) yang diperolehi untuk bakteria enterik tertentu. Kelebihan dan potensi kelemahan mempunyai membran luar dengan had pengecualian yang lebih tinggi untuk bahan hidrofilik dibincangkan.

AB - Kaedah untuk mengasingkan membran luar dan dalam P. aeruginosa PAO1 tanpa penambahan asid etilenadiaminetetraasettik telah dicipta. Kaedah ini menghasilkan dua pecahan membran luar yang menunjukkan corak protein yang sama pada elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida, tetapi berbeza dengan ketara dalam kandungan relatifnya fosfolipid. Salah satu daripada pecahan membran luar dan pecahan membran dalam adalah kurang daripada 4% tercemar silang, seperti yang dinilai oleh kandungan penanda membran dalam dan luar biasa. Membran luar mengandungi empat jalur protein utama dengan berat molekul ketara 37,000, 35,000, 21,000, dan 17,000. Vesikel yang dibentuk semula daripada lipopolisakarida dan fosfolipid tidak telap kepada semua sakarida yang termasuk dalam vesikel semasa pembentukan vesikel. Apabila vesikel mengandungi protein membran luar, mereka hanya mengekalkan sepenuhnya sakarida yang mempunyai berat molekul lebih daripada 9,000, menunjukkan bahawa had pengecualian membran luar P. aeruginosa untuk sakarida adalah jauh lebih besar daripada angka (500 hingga 600 dalton) yang diperolehi untuk bakteria enterik tertentu. Kelebihan dan potensi kelemahan mempunyai membran luar dengan had pengecualian yang lebih tinggi untuk bahan hidrofilik dibincangkan.


Perbincangan

Bahagian yang paling menarik dalam struktur CymA ialah terminal N, yang membentuk elemen mudah alih yang boleh bergerak masuk dan keluar dari lumen saluran. Apakah peranan terminal N, memandangkan data kami menunjukkan ia boleh diketepikan untuk mengikat substrat (Rajah 6)? Dengan menyempitkan saluran, residu N-terminal ~ 15 berkemungkinan mengekalkan kebolehtelapan OM, yang mungkin terjejas. Unsur penyempitan yang terdiri daripada gelung ekstraselular yang dilipat ke dalam untuk mengurangkan diameter berkesan tong terdapat dalam saluran OM yang terdiri daripada 16 atau lebih helai β seperti OmpF (Rajah S1) (1). Gelung tersebut cenderung untuk menjadi sangat stabil kerana ia membuat banyak interaksi dengan permukaan dalaman tong atau dengan gelung lain. Dalam kes CymA, segmen yang agak pendek (terminal N) dimasukkan ke dalam saluran dari sisi periplasmik dan berinteraksi dengan dinding tong. Untuk mendapatkan gambaran tentang energetik interaksi ini, kami melakukan potensi satu dimensi pengiraan daya min terminal N dalam CymA jenis liar menggunakan metadinamik (14). Keputusan menunjukkan bahawa kedudukan terminal N dalam kristal sepadan dengan minimum tenaga bebas (Rajah S8). Selain itu, pergerakan terminal N ke dalam ruang periplasmik memerlukan beberapa halangan tenaga. Oleh itu, untuk menjana saluran terbuka, interaksi terminal N dengan tong perlu diganggu. Memandangkan fakta bahawa hanya sebilangan terhad sisa terminal N yang berinteraksi dengan dinding tong (Rajah 3).B), kami mencadangkan bahawa substrat CD yang bergerak turun dari tapak kemasukan boleh memberikan daya penggerak untuk pembukaan saluran, mungkin dengan melibatkan sisa berasid dinding saluran yang berinteraksi dengan residu penting Arg5 (Rajah 8). Oleh itu, CymA boleh dianggap sebagai saluran penyebaran OM berpagar ligan. Eksperimen masa depan dan simulasi dinamik molekul yang lebih terperinci akan diperlukan untuk mendapatkan pandangan tentang mekanisme anjakan terminal N oleh CD dan sama ada molekul lain boleh membuka saluran.

Model skematik untuk pengangkutan siklodekstrin oleh CymA. (i) Hujung N CymA (magenta) terletak di dalam lumen tong. Arg5 dalam terminal N (+) berinteraksi dengan kumpulan karboksilat sisa asid glutamat (-) dalam dinding saluran. (ii) Selepas tangkapan substrat oleh tapak kemasukan, molekul CD berputar untuk merendahkan pertalian untuk saluran dan meresap lebih jauh. Terminal N diusir dari tong dengan gangguan interaksi terminal N dengan dinding tong. (iii) Selepas pengusiran terminal N, molekul CD meresap ke dalam ruang periplasmik.

Profil tenaga bebas satu dimensi (PMF) terminal N di sepanjang paksi saluran ditentukan menggunakan metadinamik yang baik (14) yang dilaksanakan dalam PLUMED 2 (30). Jarak koordinat tindak balas ditakrifkan sebagai perbezaan COM (pusat jisim) antara terminal N (Cα atom sisa 1–13) dan tong (Cα atom sisa 26–324) di sepanjang paksi saluran. Tiga gambar perwakilan protein ditunjukkan, termasuk keadaan terhablur terminal N yang sepadan dengan keadaan tenaga terendah.

Saluran resapan OM yang membenarkan resapan molekul yang lebih besar daripada had pengecualian saiz OM telah dikenal pasti sebelum ini. Walau bagaimanapun, dalam semua kes, substrat mempunyai struktur yang membolehkan mereka melalui saluran secara linear, contohnya, laluan maltooligosaccharide melalui E coli Lamb (11). Kajian kami kini menunjukkan bahawa molekul besar seperti CD juga boleh memasuki sel dengan cekap melalui saluran resapan OM. Ini kemudiannya menimbulkan persoalan mengapa sel membelanjakan tenaga yang berasal dari PMF untuk mengambil substrat besar melalui pengangkut yang bergantung kepada TonB. Seperti yang digambarkan oleh CymA, saiz substrat bukanlah faktor penentu yang memerlukan pengangkutan aktif. Sebaliknya, kemungkinan besar keperluan untuk mengikat substrat dengan sangat ketat kerana ia adalah terhad dan/atau berharga. Input tenaga luaran diperlukan untuk menjana perubahan konformasi besar yang diperlukan untuk pelepasan substrat. Dalam kes TBDT, pelepasan substrat digabungkan dengan pembentukan saluran sementara ke dalam ruang periplasmik. Sebaliknya, domain penyempitan terminal N mudah alih CymA berkemungkinan disesarkan oleh substrat yang masuk, memberikan cara yang elegan untuk sel mengambil substrat besar tanpa menjejaskan halangan kebolehtelapan OM.


Kesimpulan

Secara ringkasnya, boleh dikatakan bahawa gambaran hitam putih pori-pori membran luar—daripada bakteria kepada mitokondria dan kloroplas—sebagaimana pori-pori resapan bukan selektif yang terbuka secara amnya harus diisi dengan warna: membran luar mengekalkan potensi kawalan kasar ke atas metabolisme. dengan kewujudan protein pembentuk saluran terkawal khusus. Walaupun dalam vitro eksperimen tentang kesan perubahan voltan adalah berguna dalam mengkaji saluran ion, sistem tersusun semula tersebut memberikan terlalu memudahkan apa yang sebenarnya berlaku dalam sel. Walau bagaimanapun, dalam vivo Nampaknya bahan terlarut, metabolit dan faktor protein bertanggungjawab untuk gerbang saluran—membuatkan atau menahan bahan terlarut dengan menekan butang komunikasi pintu. Model kerja pengangkutan merentasi membran luar ditunjukkan dalam Rajah 1.


Kaedah

Kultur sel

Musculus sel kanser kelenjar susu (4 T1) telah ditanam pada 37 °C 5% CO2, dalam media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ditambah dengan 10% v/v Fetal Bovine Serum, 100 U/mL penicillin dan 100 μg/mL streptomycin (ThermoFisher). Sel-sel telah dituai dengan 0.5 ml/10cm 2 trypsin secara sentrifugasi pada 180 x g, dibasuh dengan Phosphate Buffer Saline (PBS), dan dikira dengan NucleoCounter® NC-100™ (chemometect, Copenhagen) mengikut arahan pengilang. Sel-sel telah ditetapkan dalam 40 ml 4% w/v buffered formalin selama 24 jam pada suhu bilik (RT).

Keadaan pertumbuhan bakteria

Escherichia. coli K12 MG1655 yang membawa plasmid P16Lux [39] telah ditanam secara aerobik pada 37 °C kepada OD600 daripada 0.8 dalam medium Luria-Bertani (LB) ditambah dengan 300 μg/ml Erythromycin dan dituai melalui sentrifugasi pada 3000 xg, selama 10 minit pada 4 ° C, terampai kepada kepekatan 2X dalam 4% w/v formalin penimbal selama 24 jam pada RT.

Mengira sel bakteria tetap

Suspensi sel bakteria dikira mengikut arahan kit pengiraan bakteria (Invitrogen). In brief, after fixation, a 10% aliquot was taken from this suspension and serially diluted (100X) with filtered sterilised 0.15 M NaCl solution to obtain a cell density of approximately 1 × 10 6 cells in 989 μl of NaCl. Bacterial cells were stained with 1 μl of Syto® BC and 10 μl (1X 10 6 ) of counting beads were added to the suspension. Cells were counted in an LSR II Flow Cytometer (BD Biosciences, NJ, USA). The acquisition trigger was set to side scatter and set to 800.

Membrane permeabilisation assay

After fixation, 8 × 10 7 4 T1 cells were harvested at 180 x g for 10 min, washed once with 20 ml of Tris Buffer Saline (TBS) (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6), and suspended to a final density of 2.5 × 10 6 cells per ml in TBS. Similarly, 5 × 10 9 E coli cells, were harvested at 300 x g for 10 min, washed once with 20 ml of TBS and suspended to a final density of 2.5 × 10 7 cell per ml in TBS. 500 μl of the cell suspensions were aliquoted into 1.5 ml tubes and treated with a permeabilisation agent. Permeabilisation agents tested were: Triton X-100 (0.1% v/v), Tween-20 (0.2% v/v), Saponin (from Quillaia bark) (0.1% w/v) (S4521), Digitonin (D141) (0.5% w/v). All were acquired from Sigma-Aldrich. Concentrations used were derived from several protocols [6].

The cells were permeabilised for 25 min, at 25 °C, shaking at 500 rpm. Permeabilised cells were washed once with TBS (centrifugation speeds as above) and blocked on ice with TBS + 1% w/v Bovine Serum Albumin (BSA) for 30 min. Blocked cells were exposed to 0.75 μg of Cyanine-5 (Cy5) or Phycoerythrin (PE) labelled Streptavidin (SAv-Cy5, MW = 60 KDa or SAv-PE, MW = 360 KDa) (Biolegend, CA, USA) for 30 min at 25 °C, shaking at 280 rpm. Cells were washed with 1 ml of 0.15 M NaCl solution and resuspended in 350 μl of the same solution for analysis. Bacterial cells were also labelled with 1 μl of Syto® BC (Invitrogen) for 5 min and analysed by flow cytometry in a BD LSRII. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and E coli cells were detected using the 488–1 (Fluorescein isothiocyanate - FITC), 525/50 filter for Syto® BC and gated using the side scatter. Cy5 positive cells were detected with the red 670/14 filter. PE positive cells were detected with the yellow/green 780/60 filter. For each experimental replicate, 3 × 10,000 events were recorded for 4 T1 cells and 3 × 100,000 for bacteria.

DNase screening

A screen to identify the DNase with the highest DNA depleting activity in a reaction buffer containing Qb-Saponin was performed. DNases tested were as follows: Recombinant DNase I [1-2 U, 1 μl] (Sigma-Aldrich), Turbo DNase [2 U, 1 μl] (Thermo-Fisher), Molysis DNase [2 μl] (Molzyme GmbH & Co, Bremen, Germany), RQ1 DNase [20 U, 20 μl] (Promega), Benzonase [75 U, 0.3 μl] (Sigma-Aldrich). 5 × 10 6 4 T1 cells, FF for 48 h were treated with 0.2% w/v Qb-Saponin and the DNases tested. Reactions were set in reaction buffers provided or suggested by the supplier for 20 min at 37 °C. The reaction was stopped by either: the addition of Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for Benzonase, the supplied reaction Stop Buffer, or by incubating at 75 °C (DNAse I). Cells were then subject to DNA purification with the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). DNA yield was measured with Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). All reactions were performed in triplicate. A no-DNAse control was included. This was incubated under the same conditions with buffer supplied for DNAse I, but without the nuclease.

Quillaja bark Saponin titration

Different w/v concentrations (0.1, 0.25, 0.5, 1%) were tested in 1 × 10 6 E. coli cells that were fixed, washed, permeabilised, blocked and imaged as described for membrane permeabilisation assay.

DNA depletion assay

Cells were fixed, washed and permeabilised as described for the membrane permeabilisation assay. 2.5 × 10 5 4 T1 or 2.5 × 10 6 E coli cells were permeabilised, blocked with 500 μl of 1% w/v BSA in TBS+ MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 8) for 30 min on ice. Blocked cells were treated with 1.5 μl (≥ 375 units) of Benzonase nuclease (Sigma-Aldrich) for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm. Treatment was stopped by the addition of 100 mM EDTA. The cells were washed once with TBS and suspended in 0.15 M NaCl, where they were stained with 10 μM CytoPhase Violet (Biolegend) for 1 h at RT, shaking at 200 rpm in the dark. Bacterial cells were labelled with 100 μM of BacLight red (Invitrogen) for 15 min at RT, shaking at 200 rpm and analysed by flow cytometry. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and E coli cells were detected using the 561 laser (Yellow/Green) 660/20 filter for BacLight red and gated using the side scatter. CytoPhase+ cells were detected with the 355 (UV) laser and 450/50 filter.

Confirmation of host depletion (HD) strategy

The efficacy of the combined treatment was verified by qPCR in DNA purified from a mixed cell suspension, consisting of 1 × 10 7 E coli cells and 1 × 10 4 4 T1 cells. Cells were incubated for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm in TBS or the optimised HD buffer (0.2%w/v Qb-saponin, in TBS + MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2), pH 8) with or without 500 U of Benzonase. The treated cells were then processed for DNA purification following instructions of the QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) and the purified DNA analysed by qPCR.

Quantitative PCR (qPCR)

Reactions were prepared using LUNA Universal qPCR master mix (NEB, USA) and 0.25 μM of each primer (Table 1). The thermal profile included an initial denaturation of 1 min at 95 °C, followed by 40 cycles of denaturation at 95 °C × 10 s, annealing for 15 s at the temperature specified by NEB’s annealing temperature (Ta) calculator for Hot Start Taq, followed by 20–40 s of extension at 68 °C. For each assay, a 5-point standard curve was made from log10 dilutions of gene blocks corresponding to species-specific genetic regions (Table 1), using an initial concentration of 10 7 copies. Primers and gene-blocks were acquired from IDT (Coralville, USA). Efficiency between 95 and 105% and R-square values > 0.995 were deemed as acceptable. All samples were run in triplicate.

Statistical analyses

Flow cytometry data was exported and analysed in FlowJo (BD, UK) and raw data exported to R. All statistical testing and visualisation were performed in the R environment (v3.6.3). Tests of normality were performed using the Shapiro-Wilk test. Tests of means were performed using paired samples T-Tests and Wilcoxon Signed Rank Tests as appropriate. The false discovery rate was controlled using the Bonferroni procedure. Data visualisation was performed using GGplot2 package (v3.2.1).


Structural basis for maintenance of bacterial outer membrane lipid asymmetry

The Gram-negative bacterial outer membrane (OM) is a unique bilayer that forms an efficient permeation barrier to protect the cell from noxious compounds 1 , 2 . The defining characteristic of the OM is lipid asymmetry, with phospholipids comprising the inner leaflet and lipopolysaccharides comprising the outer leaflet 1,2,3 . This asymmetry is maintained by the Mla pathway, a six-component system that is widespread in Gram-negative bacteria and is thought to mediate retrograde transport of misplaced phospholipids from the outer leaflet of the OM to the cytoplasmic membrane 4 . The OM lipoprotein MlaA performs the first step in this process via an unknown mechanism that does not require external energy input. Here we show, using X-ray crystallography, molecular dynamics simulations and in vitro and in vivo functional assays, that MlaA is a monomeric α-helical OM protein that functions as a phospholipid translocation channel, forming a

20-Å-thick doughnut embedded in the inner leaflet of the OM with a central, amphipathic pore. This architecture prevents access of inner leaflet phospholipids to the pore, but allows outer leaflet phospholipids to bind to a pronounced ridge surrounding the channel, followed by diffusion towards the periplasmic space. Enterobacterial MlaA proteins form stable complexes with OmpF/C 5,6 , but the porins do not appear to play an active role in phospholipid transport. MlaA represents a lipid transport protein that selectively removes outer leaflet phospholipids to help maintain the essential barrier function of the bacterial OM.

Three systems are known to maintain OM lipid asymmetry: the OM phospholipase A2 PldA 7 , the lipopolysaccharide (LPS) palmitoyl transferase PagP 8 and the Mla (maintenance of outer membrane lipid asymmetry) system. Only the Mla system maintains asymmetry directly via phospholipid extraction, while PldA and PagP both generate lysophospholipids in the outer leaflet that still require removal. The Mla system is conserved in Gram-negative bacteria and plant chloroplasts 9,10 , consisting of the inner membrane (IM) ABC transporter MlaBDEF, the periplasmic protein MlaC and the OM lipoprotein MlaA 4,6,11 . Phenotypes from defects in the Mla system are mild under laboratory conditions and require small-molecule OM stressors such as SDS/EDTA or antibiotics 4,5,6,11 . However, MlaA has been identified as a virulence factor in various bacteria 12,13,14,15 . In addition, the Mla system was recently shown to regulate outer membrane vesicle formation 16 . The deleterious effects of Mla knockouts probably result from phospholipid accumulation in the OM outer leaflet, forming bilayer patches that are portals for entry of lipophilic small molecules 17 . So far, structural information on Mla components is available only for MlaC and MlaD 5 . MlaC probably accepts a phospholipid from MlaA and shuttles it to the ABC transporter for ATP-dependent plasma membrane insertion 5 . MlaA is the most enigmatic Mla component, particularly since its identity as a periplasmically exposed lipoprotein appears hard to reconcile with its proposed activity on outer leaflet phospholipids.


Specific callose enzymes modulate plasmodesmal callose levels

Key genes that regulate callose levels specifically at plasmodesmata include members of the A. thaliana β-1,3-glucanase, AtBG_ppap (Levy et al., 2007) and PdBGs, serta A. thaliana callose synthase (CalS) family, encoded by CalS10/GSL8/CHORUS, CalS3/GSL12, CalS1/GSL6 atau CalS8/GSL4. Mutasi dalam PdBG1 atau PdBG2 genes increase callose accumulation and perturb normal lateral root formation (Benitez-Alfonso et al., 2013). Dalam cals10 mutants, callose deposition at the cell plate is abolished, causing seedling lethality and pleiotropic phenotypes that range from defects in cell division and guard cell patterning, to alterations in phototropic response and plasmodesmal permeability (Guseman et al., 2010 Han et al., 2014). Gain-of-function mutations in CalS3 increase callose levels and alter root development (Vatén et al., 2011). Mutasi dalam CalS1 abolish the hyperaccumulation of callose induced by salicylic acid or pathogenic bacterial infection, while those in CalS8 eliminate the callose deposition induced by mechanical wounding or reactive oxygen species. Tambahan pula, cals8 mutants show an increase in basal plasmodesmal permeability compared to that found in wild-type plants (Cui and Lee, 2016). These data, together with the observations on additional proteins that are found at plasmodesmata (see below, Box 2 and poster), suggest that a network of callose-regulating factors control the permeability of plasmodesmal channels.

Receptor-like protein kinases that are important for controlling growth and developmental processes are partially associated with plasmodesmata (see poster). For example, the receptor-like kinase STRUBBELIG (SUB) and C2-domain-containing receptor-like protein QUIRKY (QKY) interact at plasmodesmata, which is thought to promote movement of unidentified intercellular factors needed for tissue morphogenesis (Vaddepalli et al., 2014). Similarly, the receptor kinases ARABIDOPSIS CRINKLY 4 (ACR4) and CLAVATA 1 (CLV1) interact at plasmodesmata in the root meristem to restrict root meristematic activity to only a few designated cells (Stahl et al., 2013).

A number of transcription factors move from cell to cell through plasmodesmata, including those that play important roles in cell type specification (see poster). KNOTTED 1 (KN1) moves from inner shoot apical meristem (SAM) tissue layers into overlying layers to establish meristematic cell identity and maintain the stemness of this tissue (Kim et al., 2002). LEAFY moves from the outermost SAM layer into inner layers to control the differentiation of vegetative cells into floral meristem cells (Sessions et al., 2000). WUSCHEL (WUS) moves from the SAM-organizing center into the central zone, where it maintains stem cell fate and number (Yadav et al., 2011). CAPRICE (CPC) is expressed in all non-hair root epidermal cells, but moves into the cells that will become root hairs to promote their differentiation (Kurata et al., 2005). SHORT ROOT (SHR) moves from root stele into neighboring endodermal cells to promote differentiation of the ground tissues (Nakajima et al., 2001). Signaling molecules that move through plasmodesmata also include those involved in defense signal propagation (see poster). For example, the lipid transfer protein AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1) not only interacts with the plasmodesmal regulators PDLP5 and PDLP1, but also triggers systemic acquired resistance (SAR) in response to pathogen exposure. This in turn leads to symplasmic transport of the SAR signaling molecules azelaic acid (AzA) and glycerol-3-phosphate (G3P) (Lim et al., 2016). Another lipid transfer protein, DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1 (DIR1), has been found to move symplasmically into systemic tissue (Champigny et al., 2013). Taken together, these factors exemplify the variety of cellular signaling events that employ plasmodesmal communication.


Transport Across the Membrane

Semua bahan yang bergerak melalui membran berbuat demikian dengan salah satu daripada dua kaedah umum, yang dikategorikan berdasarkan sama ada tenaga diperlukan atau tidak. Passive (non-energy requiring) transport is the movement of substances across the membrane without the expenditure of cellular energy. During this type of transport, materials move by simple diffusion or by facilitated diffusion through the membrane, down their concentration gradient. Air melalui membran dalam proses resapan yang dipanggil osmosis. Osmosis is the diffusion of water through a semi-permeable membrane down its concentration gradient. It occurs when there is an imbalance of solutes outside of a cell versus inside the cell. The solution that has the higher concentration of solutes is said to be hypertonic and the solution that has the lower concentration of solutes is said to be hypotonic. Water molecules will diffuse out of the hypotonic solution and into the hypertonic solution (unless acted upon by hydrostatic forces).

Rajah (PageIndex<1>): Osmosis: Osmosis is the diffusion of water through a semipermeable membrane down its concentration gradient. Jika selaput telap kepada air, walaupun tidak kepada bahan terlarut, air akan menyamakan kepekatannya sendiri dengan meresap ke bahagian kepekatan air yang lebih rendah (dan dengan itu bahagian kepekatan bahan terlarut yang lebih tinggi). Dalam bikar di sebelah kiri, larutan di sebelah kanan membran adalah hipertonik.

In contrast to passive transport, active (energy-requiring) transport is the movement of substances across the membrane using energy from adenosine triphosphate (ATP). The energy is expended to assist material movement across the membrane in a direction against their concentration gradient. Pengangkutan aktif mungkin berlaku dengan bantuan pam protein atau melalui penggunaan vesikel. Another form of this type of transport is endocytosis, where a cell envelopes extracellular materials using its cell membrane. The opposite process is known as exocytosis. This is where a cell exports material using vesicular transport.