Maklumat

6.1: Satu Gen - Satu Teori Enzim - Biologi

6.1: Satu Gen - Satu Teori Enzim - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Neurospora crassa

Neurospora crassa ialah ascomycete, acuan roti merah. Seperti semua kulat, ia membiak dengan spora. Ia menghasilkan dua jenis spora:

  • Conidia adalah spora yang dihasilkan oleh pembiakan aseksual. Mitosis nukleus haploid kulat yang aktif dan berkembang menghasilkan konidia.
  • Ascospores, sebaliknya, terbentuk selepas pembiakan seksual. Jika dua jenis mengawan yang berbeza ("jantina") dibenarkan tumbuh bersama, mereka akan bergabung untuk membentuk zigot diploid. Meiosis zigot ini kemudiannya menimbulkan askospora haploid.

Neurospora amat sesuai untuk kajian genetik kerana

  • Ia boleh ditanam dengan cepat pada medium budaya mudah.
  • Ia menghabiskan sebahagian besar kitaran hayatnya dalam keadaan haploid jadi sebarang mutasi resesif akan muncul dalam fenotipnya.
  • Apabila zigot diploid mengalami meiosis, nukleus yang dihasilkan oleh
    • Meiosis I, diikuti oleh
    • Meiosis II, diikuti oleh
    • satu bahagian mitosis
    adalah terhad kepada tiub sempit, iaitu ascus.
  • Kerana nukleus tidak boleh melepasi satu sama lain, jika
    • nukleus zigot adalah heterozigot untuk gen (ditunjukkan di sini sebagai a dan A) dan
    • tiada persilangan berhampiran lokus itu berlaku semasa meiosis I,
    ascus akhirnya akan mempunyai empat spora pada satu hujung yang mengandungi satu alel dan empat spora di hujung yang lain mengandungi alel yang lain.

Teori Satu Gen - Satu Enzim

Sukrosa, beberapa garam, dan satu vitamin — biotin — menyediakan nutrien yang Neurospora perlukan untuk mensintesis semua makromolekul selnya.

Pakar genetik George W. Beadle dan E. L. Tatum mendedahkan beberapa konidia satu jenis Neurospora yang mengawan kepada sinar ultraungu untuk mendorong mutasi.

  • Kemudian spora penyinaran individu dibenarkan bercambah pada medium "lengkap"; iaitu, yang diperkaya dengan pelbagai vitamin dan asid amino.
  • Apabila masing-masing telah membentuk miselium, ia dibenarkan mengawan dengan jenis mengawan yang lain.
  • Ascospores yang dihasilkan telah dibedah secara individu dan setiap satu diletakkan di atas lengkap sederhana.
  • Selepas pertumbuhan telah berlaku, bahagian setiap budaya telah disubkultur sederhana minimum.
  • Kadangkala pertumbuhan berterusan; kadang-kadang tidak.
  • Apabila ia tidak ("1" dalam rajah), ketegangan tertentu kemudiannya dibekalkan dengan campuran vitamin, asid amino, dsb. sehingga pertumbuhan berlaku ("ke-2 ").
  • Akhirnya setiap strain bermutasi didapati telah memperoleh keperluan untuk satu nutrien; dalam contoh yang digambarkan di sini, vitamin tiamin ("ke-3").

Beadle dan Tatum memberi alasan bahawa sinaran telah menyebabkan gen yang membenarkan sintesis tiamin daripada bahan mudah dalam medium minimum untuk bermutasi kepada alel yang tidak. Sintesis tiamin daripada sukrosa memerlukan beberapa tindak balas kimia, setiap satu dimangkin oleh enzim tertentu.

Dengan menambahkan, satu demi satu, prekursor tiamin yang berbeza kepada medium di mana acuan mutan mereka diletakkan, mereka dapat mengecilkan kecacatan kepada ketiadaan enzim tunggal.

  • Jika mereka menambah kepada medium minimum sebarang prekursor lebih jauh dalam proses, pertumbuhan berlaku.
  • Mana-mana prekursor sebelum langkah yang disekat tidak dapat menyokong pertumbuhan.

Oleh itu, dalam contoh ini, penukaran prekursor C kepada pendahulu D disekat kerana ketiadaan enzim yang diperlukan (c).

Ini menyebabkan mereka membuat postulat satu gen - satu enzim teori: setiap gen dalam organisma mengawal penghasilan enzim tertentu. Enzim inilah yang memangkinkan tindak balas yang membawa kepada fenotip organisma.

Hari ini, kita tahu bahawa, sebenarnya, bukan sahaja enzim, tetapi semua protein lain dari mana organisma dibina dikodkan oleh gen.


Konsep Satu Gen-Satu Polipeptida

Adalah fakta bahawa watak-watak keturunan dikekalkan dan dihantar dari satu generasi ke generasi yang lain melalui molekul DNA, kerana DNA boleh menduplikasi dirinya sendiri dan molekul berganda boleh diturunkan kepada anak-anak. Aktiviti umum gen membawa ekspresi sifat keturunan dalam organisma.

Kini persoalan utama ialah bagaimana gen (molekul DNA) mengawal proses biosintetik sel dan bagaimana gen ini mengawal sifat fenotip organisma. Jawapan kepada soalan asas ini dicari dalam hubungan antara gen dan tindak balas biokimia tertentu.

Perubahan yang diwarisi yang pertama kali dikaji oleh ahli genetik semestinya yang paling mudah diperhatikan. Seorang pakar perubatan Inggeris, Sir Archibald Garrod, membuat kajian mendalam tentang beberapa penyakit keturunan yang jarang berlaku pada manusia dan mengakui bahawa kekurangan biokimia tertentu disebabkan oleh keabnormalan enzim. Berdasarkan kajiannya tentang penyakit kongenital (wujud sejak lahir) manusia.

Sir Garrod dengan selamat mencadangkan hubungan antara gen dan enzim. Idea bahawa tindakan gen berkaitan dengan pembentukan enzim tertentu telah diabaikan oleh kebanyakan ahli genetik selama kira-kira tiga puluh tahun.

James B. Summer dari Universiti Cornel dan John H. North Rop dari Institut Rockefeller antara 1926 dan 1930 menunjukkan bahawa enzim adalah protein. Idea tentang hubungan gen dan enzim telah dihidupkan semula oleh George W. Beadle dan Edward L. Tatum (1941).

Daripada kajian mengenai keabnormalan metabolik yang diwarisi kulat, Neurospora crassa, mereka menyimpulkan bahawa semua langkah biosintesis perantaraan proses metabolik dikawal oleh gen yang berbeza. Beadle dan Tatum merumuskan konsep satu gen -satu enzim pada tahun 1944. Teori ini menyatakan bahawa gen memberikan pengaruhnya ke atas fenotip melalui peranannya dalam penghasilan enzim.

Beadle dan Tatum mengkaji tindakan jin dalam neurospora crassa. Biasanya kulat boleh tumbuh pada medium kultur minimum yang mengandungi agar, sukrosa, nitrat, mineral tak organik dan satu-satunya vitamin biotin. Ini bermakna bahawa organisma ini boleh mensintesis semua vitamin dan asid amino lain yang diperlukan dalam metabolismenya.

Apabila konidia kulat ini dirawat dengan agen mutagen (katakan. X-ray), sesetengah daripada mereka menjadi tidak dapat tumbuh pada medium minimum.

Spora mutan ini kemudiannya diuji secara sistematik dengan menambahkan vitamin tertentu, asid amino, dsb. ke medium minimum untuk menentukan bahan atau bahan yang tidak dapat disintesiskan. Mutan boleh disilangkan dengan jenis normal atau liar dan produk meiosis mereka, 8 ascospores, boleh diuji secara individu untuk keperluan pemakanan mereka.

Jika arginin yang memerlukan terikan (a -) disilang dengan terikan biasa (a +), kesemua 8 ascospora boleh tumbuh dalam medium yang mengandungi arginin, tetapi hanya 4 ascospora boleh tumbuh dalam medium yang tidak mempunyai arginin. Ini menunjukkan bahawa satu gen telah bermutasi.

Arginine yang memerlukan mutan mungkin lebih kompleks kerana, seperti yang ditunjukkan dalam rantai berikut, sintesis arginin melibatkan rantaian langkah perantaraan setiap tindak balas dikawal oleh satu gen. Tiga langkah telah diperhatikan dalam penukaran asid glutamat kepada arginin dan setiap satunya didapati dikawal oleh satu gen.

Mutasi gen tunggal membawa kepada penindasan satu langkah. Ini boleh ditunjukkan dengan menumbuhkan mutan pada medium minimum dengan bahan yang tidak boleh disintesis. Dalam beberapa kajian biokimia, ekstrak neurospora telah menunjukkan bahawa tryptophan seperti arginin disintesis dalam urutan tindak balas kimia.

Mutasi dalam tryptophan memerlukan peta strain di beberapa lokasi genetik. Setiap mutan rosak dalam salah satu langkah dalam jujukan biosintetik. Mutasi dalam kawasan kromosom tertentu dicerminkan oleh kehilangan aktiviti satu enzim. Oleh itu hubungan enzim gen asas adalah jelas.

Penyelidikan terkini telah mengesahkan kesimpulan asas tentang hubungan gen-enzim. Pada masa ini konsep Beadle dan Tatum tentang satu gen-satu enzim telah disemak kepada satu rantai polipeptida gen-satu (protein) memandangkan kerumitan dalam struktur dan fungsi enzim. Penyelidikan modem telah membuktikan bahawa gen adalah DNA yang secara langsung berkaitan dengan sintesis protein tertentu.

Ekspresi gen melalui transkripsi genetik ke dalam urutan RNA percuma dan terjemahan seterusnya maklumat keturunan yang terkandung dalam mRNA ke dalam rantai polipeptida yang membentuk produk muktamad tindakan gen dipanggil tindakan gen primer.

Analisis di luar tindakan utama gen adalah sangat rumit oleh keadaan bersepadu metabolisme selular dan perkembangan, oleh keterpencilan fenotip daripada tindakan gen utama dan bilangan langkah campur tangan yang dipengaruhi oleh gen lain (interaksi gen) dan oleh faktor persekitaran ( pengaktifan gen).

Dalam prokariot transkripsi dan terjemahan maklumat genetik berlaku dalam satu petak sel manakala dalam eukariota kedua-dua proses itu dicapai ke dalam dua petak berasingan sel, iaitu nukleus dan sitoplasma. Di samping itu, beberapa maklumat genetik (DNA organel) juga terdapat dan digunakan dalam organel sitoplasma tertentu terutamanya plastid dan mitokondria.

Operasi genom nuklear dan tambahan nuklear diselaraskan oleh beberapa mekanisme yang belum difahami sepenuhnya. Peraturan genetik tindakan gen primer dalam pengertian ketat istilah berlaku hanya pada tahap transkripsi.

Keseluruhan siri proses biokimia yang membawa daripada gen kepada ekspresi fenotip yang mana ia dikenali dirujuk sebagai sistem tindakan gen (Waddington, 1962).

Oleh itu gen mempunyai dua fungsi penting:

(i) Replikasi atau pembiakan sendiri dan

(ii) Intervensi dalam mekanisme yang mana fenotip organisma dihasilkan dalam persekitaran tertentu (fenogenesis).

Tindakan Gen Primer (Sintesis Gen dan Protein):

Genotip (jumlah bahan genetik) sel menentukan jenis protein yang berpotensi dan juga menentukan jumlah relatifnya dalam sel. Protein berfungsi sebagai komponen struktur sel yang membentuk kerangka badan hidup. Jenis protein khas yang bertindak sebagai pemangkin dalam menghasilkan banyak tindak balas kimia dan mengawalnya dengan tepat dipanggil enzim.

Malah, semua fungsi sistem hidup dijalankan oleh protein. Oleh itu, dari sudut struktur dan juga fungsi protein adalah juzuk penting sel, atau dengan kata lain, protein membentuk jentera molekul asas sel.

Gen bertindak dengan mengawal struktur dan kadar penghasilan protein tertentu (enzim). Gen adalah segmen molekul DNA. DNA setiap gen membentuk untaian mRNA percuma yang melekat pada ribosom di mana ia berfungsi untuk pengekodan protein (enzim).

Urutan asid amino dalam protein (iaitu, struktur protein atau enzim) ditentukan oleh jujukan nukleotida dalam mRNA yang seterusnya ditentukan oleh jujukan nukleotida DNA (gen).

Satu siri tindak balas terkawal enzim menentukan ciri-ciri dalam organisma. Oleh kerana struktur enzim ini dikawal oleh gen, maka gen menentukan sifat.

Keseluruhan peristiwa boleh diringkaskan seperti berikut:

Blok binaan asas protein ialah asid amino. Kecuali prolin, semua asid amino lain mempunyai struktur yang sama yang terdiri daripada atom karbon pusat (a-karbon) yang dikaitkan dengan kumpulan a-amino (- NH2), α-karboksil (- COOH) dan atom hidrogen (proton). Bahagian lain asid amino dipanggil kumpulan R yang berbeza dari satu asid amino ke yang lain. Ia adalah kumpulan R yang memberikan asid amino sifat kimianya.

Formula am asid amino digambarkan di bawah:

Protein ialah molekul polimer dan terbentuk melalui gabungan banyak molekul asid amino dalam urutan linear. Asid amino bercantum antara satu sama lain melalui jenis ikatan khas, yang dipanggil kaitan peptida.

Ikatan peptida ini diwujudkan dengan penyingkiran molekul air antara karboksil (- COOH) dan amino (- NH2) kumpulan asid amino bersebelahan. Ikatan peptida adalah jenis amida (- CONH -).

Contoh pembentukan ikatan peptida diberikan di bawah:

Dengan cara ini, banyak asid amino disambung hujung ke hujung oleh ikatan peptida yang membentuk rantai panjang. Satu hujung rantai protein mengandungi amino (NH2) kumpulan (hujung amino) dan satu lagi mengandungi kumpulan karboksilik (- COOH) (hujung karboksilik).

Rantaian linear asid amino yang terbentuk dengan cara ini disebut sebagai rantai polipeptida atau protein. Pembentukan pautan polipeptida memerlukan tindakan enzim peptida polimerase dan kompaun kaya tenaga guanosin trifosfat (GTP).

Dalam sistem hidup, kira-kira 20 daripada 22 asid amino yang berbeza diketahui mengambil bahagian dalam sintesis protein. Ini disebut dalam Jadual 20.1.

Berat molekul protein bergantung kepada panjang molekul dan bilangan asid amino di dalamnya.

Protein diiktiraf oleh empat tahap struktur:

Ia adalah jujukan linear asid amino dalam rantai polipeptida. Rantai polipeptida yang baru disintesis dipanggil protein primer.

(ii) Struktur sekunder:

Apabila rantai polipeptida primer dipintal atau digelungkan menjadi heliks, ikatan elektrostatik terbentuk antara – kumpulan COOH dan NH2 ikatan kumpulan dan hidrogen berkembang antara asid amino yang berhadapan antara satu sama lain disebabkan oleh gegelung. Protein tersebut dikatakan sebagai protein sekunder. Dalam protein biologi, rantai polipeptida kekal bergelung sama ada dalam bentuk yang sama atau dalam bentuk seperti p dan oleh itu ia dipanggil heliks dan P heliks masing-masing.

(iii) Struktur tertier:

Apabila rantai polipeptida yang sangat panjang dilipat dan digulung secara meluas untuk memampatkan rantai lingkaran panjang ke dalam bentuk globular dan seterusnya ikatan rantai intra tertentu, khususnya disulfida (- S – S -) menghubungkan antara sisa-sisa sistein rantai polipeptida di atas rantaian polipeptida yang luas. permukaan untuk mencipta celahan antara rantai polipeptida, struktur tertier protein terhasil.

Struktur tertier protein sering meletakkan kumpulan hidrofobik (benci air) di luar dan kumpulan hidrofilik (mencintai air) di bahagian dalam. Contohnya ialah enzim insulin, enzim ribonuklease dan lain-lain. Protein tertier yang paling bertindak seperti pemangkin atau enzim.

(iv) Struktur sukuan:

Perkaitan lebih daripada satu rantai polipeptida untuk membentuk unit yang stabil sepadan dengan struktur kuaternari. Protein kuarterner terhasil apabila ikatan atau jambatan antara rantai diwujudkan untuk menghubungkan dua atau lebih rantai polipeptida bebas. Kebanyakan protein dengan berat molekul lebih tinggi daripada 20,000 mempunyai struktur kuaternari dan terdiri daripada lebih daripada satu rantai polipeptida.

Contoh terbaik protein kuaterner ialah hemoglobin (berat molekul 1, 00,000) yang terbentuk daripada dua rantai a dan dua P. Keperibadian kimia dan biologi protein bergantung pada susunan asid amino yang dikaitkan di dalamnya. Jadi dalam rantaian protein tertentu asid amino disusun mengikut urutan yang betul.

Tetapi bolehkah asid amino ini disusun dengan tepat? Ya, memang begitu, dan ketepatan dalam urutan asid amino semasa sintesis protein dikawal oleh molekul DNA yang tidak terlibat secara langsung dalam sintesis. Sebenarnya molekul DNA menghantar mesej mereka ke tapak sintesis protein melalui jenis RNA khas yang dipanggil messenger RNA atau mRNA.

Maklumat untuk struktur polipeptida (protein) disimpan dalam rantai polinukleotida. Urutan bes dalam rantai polinukleotida menentukan urutan asid amino dalam polipeptida tertentu.

Pemindahan maklumat daripada DNA kepada wRNA dan kemudian daripada wRNA kepada protein (jujukan asid aminoa) adalah satu arah mengikut Francis Crick (1956) dan ia tidak mengalir dalam arah songsang iaitu, daripada protein kepada RNA kepada DNA.

Molekul DNA dibekalkan dengan maklumat untuk replikasinya sendiri. Francis Crick menamakan aliran maklumat ini daripada DNA ke RNA kepada molekul protein sebagai dogma pusat. Ini ditunjukkan dalam Rajah 20.1.

Dogma pusat biologi molekul, oleh itu, melibatkan tiga proses utama berikut untuk pemeliharaan dan penghantaran maklumat genetik:

Proses yang ditunjukkan oleh anak panah yang mengelilingi DNA yang menandakan bahawa DNA adalah templat untuk replikasi diri.

Anak panah antara DNA dan RNA menunjukkan bahawa semua RNA selular disintesis pada templat DNA.

Ini adalah proses di mana semua protein ditentukan oleh templat RNA pada ribosom.

Dalam sel tertentu yang dijangkiti virus RNA, cth., TMV, φMS2, φR17 dsb., RNA virus menghasilkan salinan baharu dirinya dengan bantuan replika RNA. RNA genetik sesetengah virus, contohnya, RSV, kadangkala bertindak sebagai templat untuk penghasilan untaian DNA pelengkap (transkripsi terbalik).

Atas dasar ini Barry Commoner (1968), walau bagaimanapun, mencadangkan bahawa aliran maklumat haruslah kitaran dan bukannya dalam satu cara, tetapi pembalikan aliran normal maklumat tersebut adalah kejadian yang jarang berlaku.


CH450 dan CH451: Biokimia - Mentakrifkan Kehidupan di Peringkat Molekul

6.1 Sifat dan Klasifikasi Enzim

6.2 Nama dan Pengelasan Enzim

6.3 Struktur Enzim dan Pengikatan Substrat

6.4 Enzim dan Keseimbangan Tindak Balas

6.5 Sifat dan Mekanisme Tindakan Enzim

6.6 Enzim Terpengaruh oleh pH dan Suhu

6.7 Enzim Sensitif kepada Perencat

6.8 Pengawal Selia Alosterik dan Kawalan Aktiviti Enzim

6.9 Asal, Pembersihan, dan Kegunaan Enzim

6.10 Enzimologi Perindustrian

6.11 Rujukan

6.1 Sifat dan Klasifikasi Enzim

Enzim ialah pemangkin biologi (juga dikenali sebagai biomangkin) yang mempercepatkan tindak balas biokimia dalam organisma hidup. Ia juga boleh diekstrak daripada sel dan kemudian digunakan untuk memangkinkan pelbagai proses penting secara komersial. Sebagai contoh, mereka mempunyai peranan penting dalam pengeluaran agen pemanis dan pengubahsuaian antibiotik, mereka digunakan dalam serbuk pencuci dan pelbagai produk pembersih, dan mereka memainkan peranan penting dalam peranti analisis dan ujian yang mempunyai aplikasi klinikal, forensik dan alam sekitar. Perkataan 'enzim' pertama kali digunakan oleh ahli fisiologi Jerman Wilhelm Kühne pada tahun 1878, apabila beliau menerangkan keupayaan yis untuk menghasilkan alkohol daripada gula, dan ia berasal daripada perkataan Yunani en (bermaksud 'dalam') dan zume (bermaksud 'yis').

Pada akhir abad kesembilan belas dan awal abad kedua puluh, kemajuan ketara telah dibuat dalam pengekstrakan, pencirian dan eksploitasi komersial banyak enzim, tetapi tidak sampai tahun 1920-an enzim telah dihablurkan, mendedahkan bahawa aktiviti pemangkin dikaitkan dengan molekul protein.Untuk 60 tahun akan datang atau lebih dipercayai bahawa semua enzim adalah protein, tetapi pada tahun 1980-an didapati bahawa beberapa molekul asid ribonukleik (RNA) juga mampu memberikan kesan pemangkin. RNA ini, yang dipanggil ribozim, memainkan peranan penting dalam ekspresi gen. Dalam dekad yang sama, ahli biokimia juga membangunkan teknologi untuk menjana antibodi yang mempunyai sifat pemangkin. Apa yang dipanggil 'abzim' ini mempunyai potensi besar baik sebagai pemangkin industri baru dan dalam terapeutik. Walau apa pun pengecualian yang ketara ini, kebanyakan enzimologi klasik, dan baki esei ini, tertumpu pada protein yang mempunyai aktiviti pemangkin.

Sebagai pemangkin, enzim hanya diperlukan dalam kepekatan yang sangat rendah, dan ia mempercepatkan tindak balas tanpa sendiri dimakan semasa tindak balas. Kami biasanya menerangkan enzim sebagai mampu memangkinkan penukaran molekul substrat kepada molekul produk seperti berikut:

Enzim adalah pemangkin yang kuat.

Aktiviti pemangkin enzim yang besar mungkin boleh dinyatakan dengan baik dengan pemalar, kkucing, yang pelbagai disebut sebagai kadar pusing ganti, kekerapan pusing ganti atau nombor pusing ganti. Pemalar ini mewakili bilangan molekul substrat yang boleh ditukar kepada produk oleh molekul enzim tunggal per unit masa (biasanya seminit atau sesaat). Contoh nilai kadar pusing ganti disenaraikan dalam Jadual 6.1. Sebagai contoh, satu molekul karbonik anhidrase boleh memangkinkan penukaran lebih daripada setengah juta molekul substratnya, karbon dioksida (CO2) dan air (H2O), ke dalam produk, bikarbonat (HCO3 − ), setiap saat—pencapaian yang benar-benar luar biasa.

Enzim ialah pemangkin khusus

Selain sebagai pemangkin yang sangat kuat, enzim juga mempunyai kekhususan yang luar biasa kerana ia secara amnya memangkinkan penukaran hanya satu jenis (atau paling banyak julat jenis serupa) molekul substrat kepada molekul produk. Sesetengah enzim menunjukkan kekhususan kumpulan. Contohnya, alkali fosfatase (enzim yang biasa ditemui dalam sesi makmal tahun pertama mengenai kinetik enzim) boleh mengeluarkan kumpulan fosfat daripada pelbagai substrat.

Enzim lain menunjukkan kekhususan yang lebih tinggi, yang digambarkan sebagai kekhususan mutlak. Sebagai contoh, glukosa oksidase menunjukkan hampir jumlah kekhususan untuk substratnya, β-D-glukosa, dan hampir tiada aktiviti dengan mana-mana monosakarida lain. Seperti yang akan kita lihat kemudian, kekhususan ini amat penting dalam banyak ujian analitikal dan peranti (biosensor) yang mengukur substrat tertentu (cth. glukosa) dalam campuran kompleks (cth. sampel darah atau air kencing).

Jadual 6.1 Kadar Pusing Ganti Beberapa Enzim Biasa Menunjukkan Variasi Yang Luas

Kembali ke atas

6.2 Nama dan Pengelasan Enzim

Enzim biasanya mempunyai nama biasa (sering dipanggil 'nama remeh') yang merujuk kepada tindak balas yang dimangkinkannya, dengan akhiran ‘-ase’ (cth oksidase, dehidrogenase, karboksilase), walaupun enzim proteolitik individu umumnya mempunyai akhiran & #8216-in’ (cth trypsin, chymotrypsin, papain). Selalunya nama remeh juga menunjukkan substrat di mana enzim bertindak (cth. glukosa oksidase, alkohol dehidrogenase, piruvat dekarboksilase). Walau bagaimanapun, beberapa nama remeh (cth. invertase, diastase, catalase) memberikan sedikit maklumat tentang substrat, produk atau tindak balas yang terlibat.

Disebabkan oleh kerumitan dan ketidakkonsistenan yang semakin meningkat dalam penamaan enzim, Kesatuan Biokimia Antarabangsa menubuhkan Suruhanjaya Enzim untuk menangani isu ini. Laporan Suruhanjaya Enzim yang pertama diterbitkan pada tahun 1961, dan menyediakan pendekatan sistematik untuk penamaan enzim. Edisi keenam, yang diterbitkan pada tahun 1992, mengandungi butiran hampir 3,200 enzim yang berbeza, dan suplemen yang diterbitkan setiap tahun kini telah menambah bilangan ini kepada lebih 5,000.

Dalam sistem ini, semua enzim diterangkan oleh empat bahagian nombor Suruhanjaya Enzim (EC). Contohnya, enzim dengan nama remeh laktat dehidrogenase mempunyai nombor EC 1.1.1.27, dan lebih tepat dipanggil l-laktat: NAD + oksidoreduktase. Bahagian pertama nombor EC merujuk kepada tindak balas yang dimangkinkan oleh enzim (Jadual 6.2). Digit baki mempunyai makna yang berbeza mengikut sifat tindak balas yang dikenal pasti oleh digit pertama. Sebagai contoh, dalam kategori oksidoreduktase, digit kedua menandakan penderma hidrogen (Jadual 6.3) dan digit ketiga menandakan penerima hidrogen (Jadual 6.4). Oleh itu laktat dehidrogenase dengan nombor EC 1.1.1.27 ialah oksidoreduktase (ditunjukkan oleh digit pertama) dengan kumpulan alkohol molekul laktat sebagai penderma hidrogen (digit kedua) dan NAD + sebagai penerima hidrogen (digit ketiga), dan adalah enzim ke-27 untuk dikategorikan dalam kumpulan ini (digit keempat).

Jadual 6.2 Pengelasan Enzim: Kelas Utama Enzim dalam Sistem EC

Jadual 6.3 Pengelasan Enzim: Kelas Sekunder Oksidoreduktase dalam Sistem EC

Jadual 6.4 Pengelasan Enzim: Kelas Tertiari Oksidoreduktase dalam Sistem EC

Nasib baik, kini sangat mudah untuk mencari maklumat ini untuk mana-mana enzim individu menggunakan Pangkalan Data Nomenklatur Enzim (tersedia di http://enzyme.expasy.org)

Kembali ke atas

6.3 Struktur Enzim dan Pengikatan Substrat

Enzim berasaskan asid amino ialah protein globular yang mempunyai saiz daripada kurang daripada 100 hingga lebih daripada 2,000 sisa asid amino. Asid amino ini boleh disusun sebagai satu atau lebih rantai polipeptida yang dilipat dan dibengkokkan untuk membentuk struktur tiga dimensi tertentu, menggabungkan kawasan kecil yang dikenali sebagai tapak aktif (Rajah 6.1), di mana substrat sebenarnya mengikat. Tapak aktif mungkin hanya melibatkan sebilangan kecil (kurang daripada 10) asid amino konstituen. Ia adalah bentuk dan sifat caj tapak aktif yang membolehkannya mengikat kepada satu jenis molekul substrat, supaya enzim dapat menunjukkan kekhususan yang besar dalam aktiviti pemangkinnya.

Hipotesis bahawa kekhususan enzim terhasil daripada sifat pelengkap substrat dan tapak aktifnya pertama kali dicadangkan oleh ahli kimia Jerman Emil Fischer pada tahun 1894, dan dikenali sebagai 'hipotesis kunci dan kunci' Fischer, di mana hanya kunci saiz yang betul dan bentuk (substrat) muat ke dalam lubang kunci (tapak aktif) kunci (enzim). Adalah mengejutkan bahawa teori ini telah dicadangkan pada masa yang tidak diketahui bahawa enzim adalah protein.

Rajah 6.1 Perwakilan Pengikatan Substrat ke Tapak Aktif Molekul Enzim.

Memandangkan lebih banyak dipelajari tentang struktur enzim melalui teknik seperti kristalografi sinar-X, menjadi jelas bahawa enzim bukanlah struktur tegar, tetapi sebenarnya agak fleksibel dalam bentuk. Berdasarkan penemuan ini, pada tahun 1958 Daniel Koshland memanjangkan idea Fischer dan membentangkan 'model muat teraruh' substrat dan pengikatan enzim, di mana molekul enzim mengubah bentuknya sedikit untuk menampung pengikatan substrat. Analogi yang biasa digunakan ialah 'model tangan-dalam-sarung tangan', di mana tangan dan sarung tangan secara amnya saling melengkapi dalam bentuk, tetapi sarung tangan itu dibentuk di sekeliling tangan semasa ia dimasukkan untuk memberikan padanan yang sempurna.

Oleh kerana tapak aktif sahaja yang mengikat substrat, adalah logik untuk bertanya apakah peranan molekul protein yang lain. Jawapan mudah ialah ia bertindak untuk menstabilkan tapak aktif dan menyediakan persekitaran yang sesuai untuk interaksi tapak dengan molekul substrat. Oleh itu tapak aktif tidak boleh dipisahkan daripada protein yang lain tanpa kehilangan aktiviti pemangkin, walaupun kajian evolusi terarah (atau paksa) berasaskan makmal telah menunjukkan bahawa kadangkala mungkin untuk menghasilkan enzim yang lebih kecil yang mengekalkan aktiviti. Kawasan lain enzim juga mungkin terlibat dalam pengawalan aktiviti enzim, yang akan dibincangkan dengan lebih terperinci dalam Bab 8.

Perlu diingat bahawa walaupun sebilangan besar enzim hanya terdiri daripada protein, banyak juga mengandungi komponen bukan protein, yang dikenali sebagai kofaktor, yang diperlukan untuk aktiviti pemangkin enzim. Kofaktor mungkin molekul organik lain, dalam hal ini ia dipanggil a koenzim, atau ia mungkin molekul bukan organik, biasanya ion logam seperti besi, mangan, kobalt, kuprum atau zink. Koenzim yang mengikat ketat dan kekal pada protein biasanya dirujuk sebagai kumpulan prostetik daripada enzim. Apabila enzim memerlukan kofaktor untuk aktivitinya, komponen protein tidak aktif biasanya dirujuk sebagai apoenzim, dan apoenzim ditambah kofaktor (iaitu enzim aktif) dipanggil a holoenzim(Rajah 6.2). Keperluan mineral dan vitamin dalam diet manusia sebahagiannya disebabkan oleh peranan mereka dalam metabolisme sebagai kofaktor dan koenzim.

Rajah 6.2 Komponen Holoenzim

Kembali ke atas

6.4 Enzim dan Keseimbangan Tindak Balas

Enzim Meningkatkan Kadar Tindak Balas

Bagaimanakah enzim berfungsi? Jawapan luas kepada soalan ini ialah mereka JANGAN mengubah keseimbangan (iaitu termodinamik) sesuatu tindak balas. Ini kerana enzim tidak secara asasnya mengubah struktur dan energetik produk dan reagen, sebaliknya mereka hanya membenarkan keseimbangan tindak balas dicapai dengan lebih cepat. Oleh itu, mari kita mulakan dengan menjelaskan konsep keseimbangan kimia. Dalam kebanyakan kes, keseimbangan tindak balas adalah jauh 'ke kanan'—iaitu, hampir semua substrat (S) ditukar kepada hasil (P). Atas sebab ini, reaksi sering ditulis sebagai

Ini adalah penyederhanaan, kerana dalam semua kes adalah lebih tepat untuk menulis reaksi ini seperti berikut:

Ini menunjukkan adanya keseimbangan. Untuk memahami konsep ini, mungkin sangat membantu untuk melihat tindak balas di mana titik keseimbangan agak pusat. Sebagai contoh:

Dalam tindak balas ini, jika kita mulakan dengan larutan 1 M glukosa dan menambah enzim, maka setelah selesai kita akan mempunyai campuran kira-kira 0.5 M glukosa dan 0.5 M fruktosa. Ini adalah titik keseimbangan bagi tindak balas tertentu ini. Walaupun mungkin hanya mengambil masa beberapa saat untuk mencapai titik akhir ini dengan kehadiran enzim, kita sebenarnya akan sampai ke titik yang sama jika kita meletakkan glukosa ke dalam larutan dan menunggu beberapa bulan untuk tindak balas berlaku tanpa kehadiran enzim. . Menariknya, kita juga boleh memulakan tindak balas ini dengan larutan fruktosa 1M, dan ia akan berjalan ke arah yang bertentangan sehingga titik keseimbangan yang sama telah dicapai.

Titik keseimbangan bagi tindak balas ini dinyatakan oleh pemalar keseimbangan, Keq, seperti berikut:

Oleh itu untuk tindak balas dengan keseimbangan pusat, Keq = 1, untuk keseimbangan 'ke kanan,' Keq ialah >1, dan untuk keseimbangan 'ke kiri,' Keqialah < 1. Oleh itu jika suatu tindak balas mempunyai a Keq nilai 10 6 , keseimbangan adalah sangat jauh ke kanan dan boleh dipermudahkan dengan menandakannya sebagai anak panah tunggal. Kita mungkin sering menggambarkan jenis tindak balas ini sebagai 'akan selesai'. Sebaliknya, jika suatu tindak balas mempunyai a Keq nilai 10 −6 , keseimbangan adalah sangat jauh ke kiri, dan untuk semua tujuan praktikal ia tidak akan benar-benar dianggap untuk meneruskan sama sekali.

Perlu diingat bahawa walaupun kepekatan bahan tindak balas tidak mempunyai kesan ke atas titik keseimbangan, faktor persekitaran seperti pH dan suhu boleh dan memang mempengaruhi kedudukan keseimbangan. Perlu diingatkan juga bahawa sebarang tindak balas biokimia yang berlaku, dalam vivo, dalam sistem hidup tidak berlaku secara berasingan, tetapi sebagai sebahagian daripada laluan metabolik, yang menjadikannya lebih sukar untuk mengkonseptualisasikan hubungan antara bahan tindak balas dan tindak balas. Dalam vivo, tindak balas tidak dibenarkan untuk meneruskan ke kedudukan keseimbangannya. Jika mereka melakukannya, tindak balas pada dasarnya akan berhenti (iaitu tindak balas ke hadapan dan sebaliknya akan mengimbangi satu sama lain), dan tidak akan ada fluks bersih melalui laluan. Walau bagaimanapun, dalam banyak laluan biokimia yang kompleks beberapa langkah tindak balas individu adalah hampir kepada keseimbangan, manakala yang lain jauh dari keseimbangan, yang kedua (dimangkin oleh enzim pengawalseliaan) mempunyai kapasiti terbesar untuk mengawal keseluruhan fluks bahan melalui laluan.

Enzim Membentuk Kompleks dengan Substratnya

Kami sering menerangkan tindak balas bermangkin enzim sebagai meneruskan melalui tiga peringkat seperti berikut:

Kompleks ES mewakili kedudukan di mana substrat (S) terikat kepada enzim (E) supaya tindak balas (apa pun ia mungkin) dibuat lebih baik. Sebaik sahaja tindak balas telah berlaku, molekul produk (P) berpisah daripada enzim, yang kemudiannya bebas untuk mengikat molekul substrat lain. Pada satu ketika semasa proses ini substrat ditukar kepada bentuk perantaraan (sering dipanggil keadaan peralihan) dan kemudian ke dalam produk. Mekanisme tepat di mana enzim bertindak untuk meningkatkan kadar tindak balas berbeza dari satu sistem ke sistem yang lain, dan merupakan topik Bab 7. Walau bagaimanapun, prinsip umum ialah dengan mengikat substrat kepada enzim, tindak balas yang melibatkan substrat menjadi lebih baik dengan menurunkan tenaga pengaktifan tindak balas.

Dari segi energetik, tindak balas boleh sama ada eksergonik (melepaskan tenaga) atau endergonik (memakan tenaga). Walau bagaimanapun, walaupun dalam tindak balas eksergonik, sejumlah kecil tenaga, dipanggil tenaga pengaktifan, diperlukan untuk memberikan tindak balas sebagai 'permulaan tendangan.' Analogi yang baik ialah perlawanan, yang kepalanya mengandungi campuran yang kaya dengan tenaga. bahan kimia (fosforus sesquisulfide dan kalium klorat). Apabila mancis terbakar ia membebaskan sejumlah besar cahaya dan tenaga haba (bertindak balas secara eksergonik dengan O2 di udara). Walau bagaimanapun, dan mungkin bernasib baik, perlawanan tidak akan menyala secara spontan, sebaliknya input kecil tenaga dalam bentuk haba yang dijana melalui geseran (iaitu pukulan pada perlawanan) diperlukan untuk memulakan tindak balas. Sudah tentu apabila perlawanan telah dipukul, jumlah tenaga yang dikeluarkan adalah besar, dan jauh melebihi input tenaga kecil semasa proses pukulan.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6.3, enzim dianggap menurunkan tenaga pengaktifan sistem dengan menjadikannya lebih mudah untuk keadaan peralihan terbentuk. Dengan adanya pemangkin enzim, pembentukan keadaan peralihan secara bertenaga lebih menguntungkan (iaitu ia memerlukan kurang tenaga untuk 'kick start'), dengan itu mempercepatkan kadar tindak balas akan diteruskan, tetapi tidak secara asasnya mengubah tahap tenaga sama ada bahan tindak balas atau produk.

Rajah 6.3 Kesan enzim ke atas mengurangkan tenaga pengaktifan yang diperlukan untuk memulakan tindak balas di mana (a) tidak bermangkin dan (b) ialah tindak balas bermangkin enzim.

Kembali ke atas

6.5 Sifat dan Mekanisme Tindakan Enzim

Kinetik Enzim

Kinetik enzim ialah kajian faktor yang menentukan kelajuan tindak balas bermangkin enzim. Ia menggunakan beberapa persamaan matematik yang boleh mengelirukan pelajar apabila mereka mula-mula menemuinya. Walau bagaimanapun, teori kinetik adalah logik dan mudah, dan adalah penting untuk membangunkan pemahaman tentang subjek ini agar dapat menghargai peranan enzim dalam metabolisme dan dalam bioteknologi.

Ujian (pengukuran) aktiviti enzim boleh dilakukan sama ada secara terputus atau berterusan. Kaedah terputus melibatkan pencampuran substrat dan enzim bersama-sama dan mengukur produk yang terbentuk selepas tempoh masa yang ditetapkan, jadi kaedah ini secara amnya mudah dan cepat dilakukan. Secara umum, kami akan menggunakan ujian terputus-putus sedemikian apabila kami mengetahui sedikit tentang sistem (dan membuat penyiasatan awal), atau sebagai alternatif apabila kami mengetahui banyak tentang sistem dan pasti bahawa selang masa yang kami pilih adalah sesuai.

Dalam ujian enzim berterusan kita secara amnya akan mengkaji kadar tindak balas pemangkin enzim dengan mencampurkan enzim dengan substrat dan secara berterusan mengukur rupa produk dari semasa ke semasa. Sudah tentu kita juga boleh mengukur kadar tindak balas dengan mengukur kehilangan substrat dari masa ke masa. Selain daripada arah sebenar (satu meningkat dan satu menurun), kedua-dua nilai adalah sama. Dalam eksperimen kinetik enzim, untuk kemudahan kita sering menggunakan substrat buatan yang dipanggil a kromogen yang menghasilkan produk berwarna terang, menjadikan tindak balas mudah diikuti menggunakan kolorimeter atau spektrofotometer. Walau bagaimanapun, kami sebenarnya boleh menggunakan mana-mana peralatan analisis yang ada yang mempunyai kapasiti untuk mengukur kepekatan sama ada produk atau substrat.

Dalam hampir semua kes kami juga akan menambah larutan penimbal kepada campuran. Seperti yang akan kita lihat, aktiviti enzim sangat dipengaruhi oleh pH, ​​jadi adalah penting untuk menetapkan pH pada nilai tertentu dan memastikannya tetap sepanjang eksperimen. Oleh itu, eksperimen kinetik enzim pertama kami mungkin melibatkan mencampurkan larutan substrat (chromogen) dengan larutan penampan dan menambah enzim. Campuran ini kemudiannya akan diletakkan dalam spektrofotometer dan rupa produk berwarna akan diukur. Ini akan membolehkan kita mengikuti tindak balas pantas yang, selepas beberapa saat atau minit, mungkin mula perlahan, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6.4.

Rajah 6.4 Pembentukan Produk dalam Tindak Balas Bermangkin Enzim, Diplot Melawan Masa.

Sebab biasa untuk memperlahankan kelajuan (kadar) tindak balas adalah bahawa substrat dalam campuran sedang digunakan dan dengan itu menjadi mengehad. Sebagai alternatif, mungkin enzim tidak stabil dan menyahtukarkan sepanjang percubaan, atau mungkin pH campuran berubah, kerana banyak tindak balas sama ada memakan atau melepaskan proton. Atas sebab-sebab ini, apabila kami diminta untuk menentukan kadar tindak balas, kami melakukannya lebih awal, sebaik sahaja enzim telah ditambah, dan apabila tiada had yang disebut di atas dikenakan. Kami merujuk kepada kadar laju awal ini sebagai halaju awal (v0). Pengukuran kadar tindak balas pada peringkat awal ini juga agak mudah, kerana kadarnya adalah linear dengan berkesan, jadi kita hanya boleh melukis garis lurus dan mengukur kecerunan (dengan membahagikan perubahan kepekatan dengan selang masa) untuk menilai tindak balas kadar sepanjang tempoh ini.

Kami kini boleh melakukan pelbagai ujian enzim yang serupa untuk menilai bagaimana halaju awal berubah apabila substrat atau kepekatan enzim diubah, atau apabila pH diubah. Kajian-kajian ini akan membantu kita untuk mencirikan sifat-sifat enzim yang dikaji.

Hubungan antara kepekatan enzim dan kadar tindak balas biasanya mudah.Jika kita mengulangi eksperimen yang baru diterangkan, tetapi menambah 10% lebih enzim, tindak balas akan menjadi 10% lebih cepat, dan jika kita menggandakan kepekatan enzim tindak balas akan berjalan dua kali lebih cepat. Oleh itu terdapat hubungan linear yang mudah antara kadar tindak balas dan jumlah enzim yang tersedia untuk memangkinkan tindak balas (Rajah 6.5). Hubungan ini terpakai kepada kedua-dua enzim dalam vivo dan kepada yang digunakan dalam aplikasi bioteknologi, di mana peraturan jumlah enzim yang hadir boleh mengawal kadar tindak balas.

Rajah 6.5 Hubungan Antara Kepekatan Enzim dan Kadar Tindak Balas Bermangkin Enzim.

Apabila kita melakukan satu siri ujian enzim menggunakan kepekatan enzim yang sama, tetapi dengan julat kepekatan substrat yang berbeza, hubungan yang sedikit lebih kompleks muncul, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6. Pada mulanya, apabila kepekatan substrat meningkat, kadar tindak balas meningkat. dengan ketara. Walau bagaimanapun, apabila kepekatan substrat ditingkatkan lagi kesan ke atas kadar tindak balas mula menurun, sehingga satu peringkat dicapai di mana peningkatan kepekatan substrat mempunyai sedikit lagi kesan ke atas kadar tindak balas. Pada ketika ini enzim dianggap hampir tepu dengan substrat, dan menunjukkan halaju maksimumnya (Vmaks). Ambil perhatian bahawa halaju maksimum ini, sebenarnya, had teori yang tidak akan benar-benar dicapai dalam mana-mana percubaan, walaupun kita mungkin mendekatinya.

Rajah 6.6 Hubungan Antara Kepekatan Substrat dan Kadar Tindak Balas Bermangkin Enzim.

Hubungan yang diterangkan di sini adalah hubungan yang agak biasa, yang mana ahli matematik akan segera mengenal pasti sebagai hiperbola segi empat tepat. Persamaan yang menerangkan hubungan sedemikian adalah seperti berikut:

Oleh itu, dua pemalar a dan b membolehkan kita menerangkan hubungan hiperbolik ini, sama seperti hubungan linear (y = mx + c), yang boleh dinyatakan oleh dua pemalar m (cerun) dan c (pintasan). Kami sebenarnya telah mentakrifkan pemalar a - ia adalah Vmaks. pemalar b adalah lebih kompleks sedikit, kerana ia adalah nilai pada paksi-x yang memberikan separuh daripada nilai maksimum y. Dalam enzimologi kita merujuk kepada ini sebagai Pemalar Michaelis (Km), yang ditakrifkan sebagai kepekatan substrat yang memberikan halaju separuh maksimum.

Persamaan akhir kami, biasanya dipanggil Persamaan Michaelis–Menten, oleh itu menjadi:

Pada tahun 1913, Leonor Michaelis dan Maud Menten pertama kali menunjukkan bahawa sebenarnya adalah mungkin untuk memperoleh persamaan ini secara matematik daripada prinsip pertama, dengan beberapa andaian mudah tentang cara enzim bertindak balas dengan substrat untuk membentuk produk. Inti kepada terbitan mereka ialah konsep bahawa tindak balas berlaku melalui pembentukan kompleks ES yang, setelah terbentuk, boleh sama ada berpisah (secara produktif) untuk melepaskan produk, atau berpisah dalam arah sebaliknya tanpa sebarang pembentukan produk. Oleh itu tindak balas boleh diwakili seperti berikut, dengan k1, k−1dan k2 sebagai pemalar kadar bagi tiga langkah tindak balas individu:

Derivasi Michaelis–Menten memerlukan dua andaian penting. Andaian pertama ialah kita sedang mempertimbangkan halaju awal tindak balas (v0), apabila kepekatan produk akan diabaikan kecil (iaitu [S] ≫ [P]), sehingga kita boleh mengabaikan kemungkinan sebarang produk kembali kepada substrat. Andaian kedua ialah kepekatan substrat sangat melebihi kepekatan enzim (iaitu [S] ≫ [E]).

Derivasi bermula dengan persamaan untuk ungkapan kadar awal, kadar pembentukan produk, sebagai kadar di mana kompleks ES berpisah untuk membentuk produk. Ini adalah berdasarkan pemalar kadar k2dan kepekatan kompleks ES, seperti berikut:

Oleh kerana ES adalah perantaraan, kepekatannya tidak diketahui, tetapi kita boleh menyatakannya dari segi nilai yang diketahui. Dalam penghampiran keadaan mantap kita boleh mengandaikan bahawa walaupun kepekatan substrat dan produk berubah, kepekatan kompleks ES itu sendiri kekal malar.

Kadar pembentukan kompleks ES dan kadar pecahannya mesti seimbang, di mana:

Kadar pembentukan kompleks ES = Kadar pecahan kompleks ES

Persamaan boleh disusun semula untuk menghasilkan [ES] seperti berikut:

Pemalar Michaelis Km boleh ditakrifkan seperti berikut:

Persamaan [ES] kemudiannya boleh dipermudahkan kepada:

Oleh kerana kepekatan substrat sangat melebihi kepekatan enzim (iaitu [S] ≫ [E]), kepekatan substrat tidak bergabung [S] hampir sama dengan jumlah kepekatan substrat. Kepekatan enzim yang tidak digabungkan [E] adalah sama dengan jumlah kepekatan enzim [E]Ttolak yang digabungkan dengan substrat [ES]. Memperkenalkan istilah ini ke dalam persamaan di atas dan menyelesaikan untuk ES memberi kita perkara berikut:

Kita kemudian boleh memperkenalkan istilah ini untuk [ES] ke dalam persamaan halaju awal di atas untuk menghasilkan:

Istilah k2[E]T sebenarnya mewakili Vmaks, halaju maksimum. Oleh itu Michaelis dan Menten dapat memperoleh persamaan akhir mereka sebagai:

Pemalar Michaelis telah ditentukan untuk banyak enzim yang biasa digunakan, dan biasanya berada dalam julat milimolar yang lebih rendah (Jadual 6.5). Perlu diingatkan bahawa enzim yang memangkinkan tindak balas yang sama, tetapi yang diperoleh daripada organisma yang berbeza, boleh mempunyai perbezaan yang meluas. Km nilai. Tambahan pula, enzim dengan pelbagai substrat boleh mempunyai agak berbeza Km nilai bagi setiap substrat.

Jadual 6.5 Julat Nilai Biasa bagi Pemalar Michaelis

A rendah Km nilai menunjukkan bahawa enzim hanya memerlukan sedikit substrat untuk menjadi tepu. Oleh itu halaju maksimum dicapai pada kepekatan substrat yang agak rendah. A tinggi Km nilai menunjukkan keperluan untuk kepekatan substrat yang tinggi untuk mencapai halaju tindak balas maksimum. Oleh itu kita secara umumnya merujuk kepada Km sebagai ukuran pertalian enzim untuk substratnya—sebenarnya ia adalah ukuran songsang, di mana yang tinggi Km menunjukkan pertalian yang rendah, dan sebaliknya.

The Km nilai memberitahu kita beberapa perkara penting tentang enzim tertentu:

  1. Enzim dengan rendah Kmnilai berbanding dengan kepekatan fisiologi substrat mungkin akan sentiasa tepu dengan substrat, dan oleh itu akan bertindak pada kadar yang tetap, tanpa mengira variasi dalam kepekatan substrat dalam julat fisiologi.
  2. Enzim dengan kadar yang tinggi Kmnilai berbanding dengan kepekatan fisiologi substrat tidak akan tepu dengan substrat, dan oleh itu aktivitinya akan berbeza-beza mengikut kepekatan substrat, jadi kadar pembentukan produk akan bergantung kepada ketersediaan substrat.
  3. Jika enzim bertindak pada beberapa substrat, substrat yang paling rendah Kmnilai sering diandaikan sebagai substrat 'semulajadi' enzim itu, walaupun ini mungkin tidak benar dalam semua kes.
  4. Jika dua enzim (dengan serupa Vmaks) dalam laluan metabolik yang berbeza bersaing untuk substrat yang sama, maka jika kita tahu Km nilai untuk dua enzim kita boleh meramalkan aktiviti relatif kedua-dua laluan. Pada asasnya laluan yang mempunyai enzim yang lebih rendah Kmnilai mungkin menjadi 'laluan pilihan', dan lebih banyak substrat akan mengalir melalui laluan itu dalam kebanyakan keadaan. Sebagai contoh, fosfofruktokinase (PFK) ialah enzim yang memangkinkan langkah komited pertama dalam laluan glikolitik, yang menjana tenaga dalam bentuk ATP untuk sel, manakala glukosa-1-fosfat uridylyltransferase (GUT) ialah enzim di awal laluan. membawa kepada sintesis glikogen (molekul simpanan tenaga). Kedua-dua enzim menggunakan heksosa monofosfat sebagai substrat, tetapi KmPFK untuk substratnya adalah lebih rendah daripada GUT untuk substratnya. Oleh itu, pada kepekatan fosfat heksosa selular yang lebih rendah, PFK akan aktif dan GUT sebahagian besarnya tidak aktif. Pada kepekatan heksosa fosfat yang lebih tinggi kedua-dua laluan akan aktif. Ini bermakna sel hanya menyimpan glikogen pada masa yang banyak, dan sentiasa memberi keutamaan kepada laluan pengeluaran ATP, yang merupakan fungsi yang lebih penting.

Selalunya tidak mungkin untuk menganggarkan Km nilai daripada plot halaju langsung terhadap kepekatan substrat (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6.6) kerana kami tidak menggunakan kepekatan substrat yang cukup tinggi untuk hampir sama dengan menganggar halaju maksimum, dan oleh itu kami tidak boleh menilai halaju separuh maksimum dan dengan itu Km. Nasib baik, kami boleh merancang data percubaan kami dengan cara yang sedikit berbeza untuk mendapatkan nilai ini. Alternatif yang paling biasa digunakan ialah plot Lineweaver–Burk (selalunya dipanggil plot timbal balik berganda). Plot ini melinearkan hubungan melengkung hiperbola, dan garisan yang dihasilkan mudah diekstrapolasi, membolehkan penilaian Vmaksdan Km.

Sebagai contoh, jika kita memperoleh hanya tujuh titik data pertama dalam Rajah 6.6, kita akan menghadapi kesukaran untuk menganggarkan Vmaks daripada plot langsung seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6.7a. Walau bagaimanapun, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6.7b, jika tujuh titik ini diplotkan pada graf 1/halaju melawan 1/kepekatan substrat (iaitu plot salingan berganda), data dilinearkan, dan garisan itu boleh diekstrapolasi dengan mudah kepada kiri untuk memberikan pintasan pada kedua-dua paksi-y dan
paksi-x, dari mana Vmaks dan Km, masing-masing, boleh dinilai.

Rajah 6.7 Michaelis Menton Kinetics. (a) Plot langsung data (b) Plot Lineweaver-Burk bagi data kinetik yang sama.

Satu kelemahan praktikal yang ketara menggunakan plot Lineweaver–Burk ialah pengaruh berlebihan yang diberikan kepada pengukuran yang dibuat pada kepekatan substrat terendah. Kepekatan ini mungkin yang paling terdedah kepada ralat (disebabkan oleh kesukaran dalam membuat berbilang pencairan), dan mengakibatkan kadar tindak balas yang, kerana ia lambat, mungkin juga paling terdedah kepada ralat pengukuran. Selalunya, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8, titik sedemikian apabila diubah pada plot Lineweaver–Burk mempunyai kesan yang ketara pada garis kesesuaian terbaik yang dianggarkan daripada data, dan oleh itu pada nilai ekstrapolasi kedua-duanya. Vmaks dan Km. Kedua-dua set titik yang ditunjukkan dalam Rajah 8 adalah sama kecuali satu titik di bahagian atas sebelah kanan, yang mencerminkan (kerana sifat dua timbal balik plot) satu titik yang diperoleh daripada kepekatan substrat yang sangat rendah dan kadar tindak balas yang rendah. Walau bagaimanapun, titik tunggal ini boleh memberi kesan yang besar pada garisan yang paling sesuai dan anggaran pemalar kinetik yang disertakan.

Rajah 6.8 Plot Lineweaver-Burk Data Kinetik Serupa, Yang Berbeza Hanya dalam Satu Titik Data (Titik data akhir (a) 1/v 0.03 pada 1/S daripada 0.2 dan (b) 1/v 0.031 pada 1/S daripada 0.18).

Malah terdapat plot kinetik lain yang boleh digunakan, termasuk plot Eadie–Hofstee, plot Hanes dan plot Eisenthal–Cornish-Bowden, yang kurang terdedah kepada masalah sedemikian. Dalam kerja rumah kinetik enzim, anda akan bereksperimen dengan jenis teknik linearisasi yang lain ini.

Kembali ke atas

6.6 Enzim Terpengaruh oleh pH dan Suhu

Pelbagai faktor persekitaran mampu mempengaruhi kadar tindak balas bermangkin enzim melalui perubahan boleh balik atau tidak boleh balik dalam struktur protein. Kesan pH dan suhu secara amnya difahami dengan baik.
Kebanyakan enzim mempunyai ciri pH optimum di mana halaju tindak balas yang dimangkin adalah maksimum, dan di atas dan di bawahnya halaju menurun (Rajah 6.9).

Rajah 6.9 Profil pH β-Glucosidase.

Profil pH bergantung kepada beberapa faktor. Apabila pH berubah, pengionan kumpulan di tapak aktif enzim dan pada substrat boleh berubah, mempengaruhi kadar pengikatan substrat ke tapak aktif. Kesan ini selalunya boleh diterbalikkan. Sebagai contoh, jika kita mengambil enzim dengan pH optimum (pHmemilih) daripada 7.0 dan letakkannya dalam persekitaran pada pH 6.0 atau 8.0, sifat cas enzim dan substrat mungkin suboptimum, sehingga mengikat dan dengan itu kadar tindak balas diturunkan. Jika kita kemudian melaraskan semula pH kepada 7.0, sifat caj optimum dan oleh itu aktiviti maksimum enzim sering dipulihkan.

Walau bagaimanapun, jika kita meletakkan enzim dalam persekitaran berasid atau beralkali yang lebih melampau (cth pada pH 1 atau 14), walaupun keadaan ini sebenarnya tidak boleh membawa kepada perubahan dalam struktur kovalen yang sangat stabil bagi struktur primer protein (iaitu konfigurasinya. ), ia mungkin menghasilkan perubahan dalam bentuk (bentuk) protein supaya, apabila ia dikembalikan kepada pH 7.0, konformasi asal dan dengan itu aktiviti pemangkin penuh enzim tidak dipulihkan. Perlu diingatkan bahawa pH optimum enzim mungkin tidak sama dengan persekitaran intrasel normalnya. Ini menunjukkan bahawa pH tempatan boleh memberi pengaruh mengawal ke atas aktiviti enzim.

Kesan suhu pada aktiviti enzim agak kompleks, dan boleh dianggap sebagai dua daya yang bertindak serentak tetapi dalam arah yang bertentangan. Apabila suhu dinaikkan, kadar pergerakan molekul dan seterusnya kadar tindak balas meningkat, tetapi pada masa yang sama terdapat ketidakaktifan progresif yang disebabkan oleh denaturasi protein enzim. Ini menjadi lebih ketara apabila suhu meningkat, supaya suhu optimum (Tmemilih) diperhatikan (Rajah 6.10).

Rajah 6.10 Kesan Suhu Terhadap Aktiviti Enzim.

Denaturasi terma bergantung pada masa, dan untuk enzim istilah 'suhu optimum' mempunyai sedikit makna sebenar melainkan tempoh pendedahan kepada suhu tersebut direkodkan. Kestabilan terma enzim boleh ditentukan dengan terlebih dahulu mendedahkan protein kepada julat suhu untuk tempoh masa yang tetap, dan seterusnya mengukur aktivitinya pada satu suhu yang menggalakkan (cth. 25°C).

Suhu di mana denaturasi menjadi penting berbeza dari satu enzim ke enzim yang lain. Biasanya ia boleh diabaikan di bawah 30°C, dan mula menjadi ketara melebihi 40°C. Lazimnya, enzim yang diperoleh daripada sumber mikrob menunjukkan kestabilan terma yang jauh lebih tinggi berbanding daripada sumber mamalia, dan enzim yang diperoleh daripada mikroorganisma yang sangat termofilik, seperti thermolysin (protease daripada Bacillus thermoproteolyticus) dan Taq polimerase (polimerase DNA daripada Thermus aquaticus), mungkin termostable sepenuhnya pada 70°C dan masih mengekalkan tahap aktiviti yang besar walaupun pada 100°C.

Kembali ke atas

6.7 Enzim Sensitif kepada Perencat

Bahan yang mengurangkan aktiviti tindak balas bermangkin enzim dikenali sebagai perencat. Mereka bertindak sama ada secara langsung atau tidak langsung mempengaruhi sifat pemangkin tapak aktif. Inhibitor boleh menjadi asing kepada sel atau komponen semula jadinya. Mereka dalam kategori terakhir boleh mewakili elemen penting dalam pengawalan metabolisme sel. Banyak toksin dan juga banyak agen aktif secara farmakologi (kedua-dua ubat haram dan preskripsi dan ubat-ubatan bebas kaunter) bertindak dengan menghalang proses pemangkin enzim tertentu.

Perencatan boleh balik

Inhibitor dikelaskan sebagai perencat boleh balik apabila ia mengikat secara balik kepada enzim. Molekul yang strukturnya serupa dengan substrat biasa mungkin boleh mengikat secara berbalik kepada tapak aktif enzim dan oleh itu bertindak sebagai perencat kompetitif. (Rajah 6.11) Contohnya, malonat ialah perencat kompetitif enzim suksinat dehidrogenase, kerana ia mampu mengikat tapak aktif enzim kerana persamaan strukturnya yang rapat dengan substrat semulajadi enzim, suksinat (lihat di bawah). Apabila malonat menduduki tapak aktif suksinat dehidrogenase ia menghalang substrat semula jadi, suksinat, daripada mengikat, dengan itu memperlahankan kadar pengoksidaan suksinat kepada fumarat (iaitu menghalang tindak balas).

Salah satu ciri perencat kompetitif ialah ia boleh dialihkan dari tapak aktif jika kepekatan substrat yang tinggi digunakan, dengan itu memulihkan aktiviti enzim. Oleh itu perencat kompetitif meningkatkan Km tindak balas kerana ia meningkatkan kepekatan substrat yang diperlukan untuk menepu enzim. Walau bagaimanapun, mereka tidak berubah Vmaks sendiri.

Dalam kes enzim tertentu, kepekatan tinggi sama ada substrat atau produk boleh menghalang. Sebagai contoh, aktiviti invertase dikurangkan dengan ketara dengan kehadiran kepekatan tinggi sukrosa (substratnya), manakala β-galactosidase daripada Aspergillus niger sangat dihalang oleh galaktosa (hasilnya). Produk tindak balas enzim adalah beberapa perencat kompetitif yang paling biasa ditemui.

Rajah 6.11 Perencatan Persaingan. Perencatan kompetitif berlaku apabila substrat (S) dan perencat (I) kedua-duanya terikat pada tapak yang sama pada enzim. Sebenarnya, mereka bersaing untuk mendapatkan tapak aktif dan terikat dengan cara yang saling eksklusif.

Jenis perencat boleh balik yang lain juga wujud. Inhibitor bukan kompetitif bertindak balas dengan enzim di tapak yang berbeza daripada tapak aktif. Oleh itu pengikatan perencat tidak menyekat tapak pengikatan substrat secara fizikal, tetapi ia menghalang tindak balas seterusnya. Kebanyakan perencat bukan kompetitif secara kimia tidak berkaitan dengan substrat, dan perencatannya tidak dapat diatasi dengan meningkatkan kepekatan substrat. Inhibitor sedemikian berkuat kuasa mengurangkan kepekatan enzim aktif dalam larutan, dengan itu mengurangkan Vmaksdaripada tindak balas. Walau bagaimanapun, mereka tidak mengubah nilai Km.

Rajah 6.12 Perencatan Bukan Kompetitif. Perencatan nonompetitif berlaku apabila perencat (I) mengikat enzim di tapak yang jauh daripada substrat. Sebenarnya, perencat bukan kompetitif mengubah bentuk enzim, sehingga ia telah mengurangkan atau mengehadkan fungsi sebagai pemangkin.

Perencatan yang tidak kompetitif agak jarang berlaku, berlaku apabila perencat hanya dapat mengikat enzim sebaik sahaja molekul substrat terikat dengan sendirinya. Oleh itu, perencatan adalah paling ketara pada kepekatan substrat yang tinggi, dan mengakibatkan pengurangan dalam Vmaks daripada tindak balas. Perencatan yang tidak kompetitif juga menyebabkan pengurangan dalam Km, yang kelihatan agak berlawanan dengan intuisi kerana ini bermakna pertalian enzim untuk substratnya sebenarnya meningkat apabila perencat hadir. Kesan ini berlaku kerana pengikatan perencat kepada kompleks ES dengan berkesan menghilangkan kompleks ES dan dengan itu menjejaskan keseimbangan keseluruhan tindak balas yang memihak kepada pembentukan kompleks ES. Walau bagaimanapun, perlu diperhatikan bahawa sejak kedua-duanya Vmaks dan Km dikurangkan kadar tindak balas yang diperhatikan dengan perencat yang hadir sentiasa lebih rendah berbanding dengan ketiadaan perencat tidak kompetitif.

Rajah 6.13 Perencatan Tidak Kompetitif. Dalam perencatan yang tidak kompetitif, perencat mengikat kompleks ES tindak balas dan menyekat keupayaan enzim untuk melengkapkan tindak balas.

Kesan perencat boleh balik boleh dikenal pasti dengan mudah menggunakan gambar rajah Lineweaver-Burk seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6.14.

Rajah 6.14 Plot Lineweaver-Burk Perencah Boleh Balik. Profil enzim yang tidak dihalang ditunjukkan dalam warna merah, manakala tindak balas di mana perencat hadir secara berperingkat ditunjukkan dalam warna hijau. (A) perencatan kompetitif, (B) perencatan bukan kompetitif, dan (C) perencatan tidak kompetitif.

Perencat dan Racun Tidak Boleh Balik

Jika perencat mengikat secara kekal kepada enzim ia dikenali sebagai perencat tak boleh balik. Banyak perencat tak boleh balik secara kovalen melekat pada enzim yang mereka halang menyebabkan strukturnya diubah secara kekal. Oleh itu, banyak perencat tak boleh balik adalah toksin yang kuat.

Sebatian organophosphorus seperti diisopropyl fluorophosphate (DFP) menghalang aktiviti asetilkolinesterase dengan bertindak balas secara kovalen dengan sisa serin penting yang terdapat dalam tapak aktif enzim. Kesan fisiologi inaktivasi ini adalah gangguan ketidakaktifan neurotransmitter pada sinaps saraf, mengakibatkan penyebaran impuls saraf yang berterusan, yang boleh menyebabkan kekejangan otot dan membawa kepada kematian. DFP pada asalnya dinilai oleh British sebagai agen perang kimia semasa Perang Dunia II, dan versi diubah suai bagi kompaun ini kini digunakan secara meluas sebagai racun perosak organofosfat, termasuk parathione dan malathione (Rajah 6.15). Terutama DFP juga merupakan perencat kuat enzim protease daripada Virus Herpes Simplex dan telah digunakan untuk mengkaji dinamik tapak aktif protein ini (Rajah 6.15). Banyak ubat juga bertindak sebagai perencat yang tidak dapat dipulihkan, termasuk antibiotik β-laktam seperti penisilin.

Rajah 6.15 Organofosfat ialah Perencat Tak Boleh Balik. (A) Struktur diisopropyl fluorophosphate (DFP), malathione dan parathione, (B) Perencatan enzim yang tidak dapat dipulihkan oleh DFP melalui pengubahsuaian kovalen residu serin tapak aktif, dan (C) Struktur kristal Protease/Inhibitor Virus Herpes Simplex (DFP) ) kompleks. Serine tapak aktif (kuning) telah mengalami fosfonilasi yang mengakibatkan perencatan tidak dapat dipulihkan. Diberikan daripada PDB 1AT3.

Kembali ke atas

6.8 Pengawal Selia Alosterik dan Kawalan Aktiviti Enzim

Setelah menghabiskan masa belajar tentang kinetik enzim dan hubungan Michaelis–Menten, selalunya agak membingungkan untuk mendapati bahawa beberapa enzim yang paling penting sebenarnya tidak memaparkan sifat sedemikian. Enzim allosterik ialah enzim pengawalseliaan utama yang mengawal aktiviti laluan metabolik dengan bertindak balas kepada perencat dan pengaktif. Enzim ini sebenarnya menunjukkan hubungan sigmoid (berbentuk S) antara kadar tindak balas dan kepekatan substrat (Rajah 6.16), dan bukannya hubungan hiperbolik biasa. Oleh itu untuk enzim alosterik terdapat kawasan di mana aktiviti lebih rendah daripada enzim 'normal' yang setara, dan juga kawasan di mana aktiviti lebih tinggi daripada enzim 'normal' setara, dengan peralihan pantas antara dua fasa ini. Ini agak seperti suis yang boleh ditukar dengan cepat daripada 'mati' (aktiviti rendah) kepada 'hidup' (aktiviti penuh).

Rajah 6.16 Profil Aktiviti/Substrat Enzim Alosterik (bulatan terbuka) dan Bukan alosterik (bulatan pepejal) dengan Pertalian dan Halaju Maksimum yang Sama.

Kebanyakan enzim alosterik adalah polimer—iaitu, ia terdiri daripada sekurang-kurangnya dua (dan selalunya banyak lagi) rantai polipeptida individu. Mereka juga mempunyai beberapa tapak aktif di mana substrat boleh mengikat. Kebanyakan pemahaman kita tentang fungsi enzim alosterik datang daripada kajian hemoglobin (Hb) yang, walaupun ia bukan enzim, mengikat oksigen dengan cara yang sama kerjasama dan dengan itu juga menunjukkan hubungan sigmoid ini. Enzim alosterik mempunyai pertalian rendah pada awalnya untuk substrat, tetapi apabila molekul substrat tunggal mengikat, ini mungkin memecahkan beberapa ikatan dalam enzim dan dengan itu mengubah bentuk protein supaya tapak aktif yang tinggal dapat mengikat dengan pertalian yang lebih tinggi. Oleh itu enzim alosterik sering digambarkan sebagai bergerak dari a keadaan tegang atau keadaan-T (pertalian rendah) di mana tiada substrat terikat, kepada a keadaan santai atau keadaan-R (pertalian tinggi) sebagai substrat mengikat. Molekul lain juga boleh mengikat enzim alosterik, di tapak pengawalseliaan tambahan (iaitu bukan di tapak aktif). Molekul yang menstabilkan protein dalam keadaan Tnya bertindak sebagai perencat alosterik, manakala molekul yang memindahkan protein ke keadaan Rnya akan bertindak sebagai pengaktif atau penganjur alosterik.

Hemoglobin ialah protein tetramerik yang terdiri daripada dua subunit alfa dan dua subunit beta. Ia homolog dengan protein pengikat oksigen monomerik, myoglobin. Seperti yang dilihat dalam Rajah 6.17, pengikatan oksigen kepada mioglobin memberikan profil hiperbolik piawai, manakala hemoglobin menunjukkan pengikatan oksigen sigmoid. Profil kinetik sigmoid hemoglobin menunjukkan bahawa pengikatan oksigen adalah koperasi atau bahawa pengikatan satu oksigen kepada satu subunit, meningkatkan kebarangkalian bahawa oksigen akan mengikat pada subunit yang lain.

Rajah 6.17 Perbandingan Struktur Mioglobin (A) dan Hemoglobin (B) dan (C) Kinetik Pengikat dengan Oksigen.

The Model Konsert, juga dikenali sebagai model simetri, hemoglobin digunakan untuk menerangkan kerjasamadalam pengikatan oksigen serta peralihan protein yang terdiri daripada subunit yang sama. Ia memberi tumpuan kepada dua keadaan Hemoglobin iaitu keadaan T dan R. Keadaan T hemoglobin lebih tegang kerana ia berada dalam bentuk deoksihemoglobin manakala keadaan R hemoglobin lebih santai kerana ia dalam bentuk oksihemglobin. Keadaan T dikekang disebabkan oleh interaksi subunit-subunit manakala keadaan R adalah lebih fleksibel kerana keupayaan mengikat oksigen. Perbezaan dalam deoxyhemoglobin dan oxyhemoglobin ialah bentuk “deoxy” tidak mempunyai oksigen dan bentuk “oxy” sangat terikat dengan oksigen. Pengikatan oksigen di satu tapak meningkatkan atau memudahkan pertalian pengikatan di tapak aktif yang lain. Oleh itu, lengkung sigmoidal diperhatikan untuk kinetik pengikat oksigen hemoglobin. Seperti yang dilihat dalam Rajah 6.18, dalam model bersepadu hemoglobin, ia menunjukkan bahawa satu oksigen yang mengikat ke tapak aktif akan meningkatkan kebarangkalian oksigen lain mengikat ke tapak aktif lain dalam hemoglobin. Kebolehan ini dikenali sebagai kerjasama atau ikatan koperasi. Secara keseluruhan, pengikatan oksigen mengalihkan keseimbangan ke arah keadaan R. Ini bermakna pada tahap oksigen yang tinggi, bentuk R akan menjadi lazim dan pada tahap oksigen yang lebih rendah, bentuk T akan menjadi lazim. Efektor alosterik hemoglobin, seperti 2,3- bisphosphoglycerate (2,3-BPG), berfungsi dengan mengalihkan keseimbangan ke arah atau menjauhi keadaan T, bergantung pada sama ada ia adalah perencat alosterik atau promoter alosterik. Model ini memaparkan kes ekstrem peralihan R dan T. Dalam sistem sebenar, sifat daripada kedua-dua model diperlukan untuk menerangkan tingkah laku hemoglobin.

Rajah 6.18 Dinamik Pengikatan Oksigen dalam Hemoglobin. Seperti yang ditunjukkan dalam (A) di atas, keadaan tegang (keadaan T) hemoglobin diutamakan apabila pengikatan oksigen rendah. Tetramer beralih daripada keadaan T kepada keadaan santai (keadaan R) dengan pengikatan oksigen. Malah, pengikatan satu oksigen dengan satu subunit meningkatkan kemungkinan pengikatan oksigen dengan subunit lain, yang dikenali sebagai kerjasama. (B) menunjukkan perwakilan grafik Hemoglobin (Hb) yang mengikat oksigen yang beralih antara keadaan T dan keadaan R.

Kesan Bohr

Kesan Bohr ialah fenomena fisiologi yang pertama kali diterangkan pada tahun 1904 oleh ahli fisiologi Denmark, Christian Bohr: pertalian pengikat oksigen hemoglobin berkait songsang dengan keasidan dan kepekatan karbon dioksida. Rajah di bawah menunjukkan kesan pH ke atas O2 mengikat Hb. Pemerhatian eksperimen ialah pada pH 7.2 dan 20 torr, lebih banyak O2 dipunggah daripada pada pH 7.6 (Rajah 6.19).

Rajah 6.19 Pengikatan Oksigen Hemoglobin Bergantung kepada pH.

Untuk memikirkan asas kesan pH ini, ingat tiga faktor penting: (1) CO2/HCO3 – wujud dalam keseimbangan dalam sistem biologi dan boleh mempengaruhi pH keseluruhan, (2) deoxyHb ialah bes yang lebih kuat daripada O2•Hb, dan (3) dalam sel darah merah (RBC), terdapat enzim yang dipanggil karbonik anhidrase, yang memangkinkan penghidratan CO.2 oleh air untuk membentuk HCO3 – .


Persamaan di atas boleh digunakan untuk menerangkan bagaimana hemoglobin memaksimumkan pemunggahan O2 dalam tisu dan memunggah CO2 dalam paru-paru.

Contoh pertama:Dalam otot semasa senaman, glukosa ditukar kepada CO2. CO2 kemudian meresap ke kapilari dan RBC dan menyeimbangkan kepada H + dan HCO3 – . Beberapa rantai sampingan Hb bertindak sebagai penampan. H + s terikat kepada deoksiHb dan dengan itu mengalihkan keseimbangan ke kanan, melepaskan lebih banyak O2.

Contoh kedua: DeoksiHb diangkut melalui sistem peredaran darah kembali ke paru-paru di mana ia mengambil O2. O2 mengalihkan keseimbangan ke kiri menjana H + . Proton kemudian bertindak balas dengan HCO3 – untuk menjana CO2 dan H2O. CO2 dihembus.

Secara keseluruhannya, analisis aktiviti biologi hemoglobin menunjukkan bahawa pengawalseliaan aktiviti protein tunggal adalah kompleks dan boleh berbeza di lokasi yang berbeza di dalam badan atau apabila terdedah kepada efektor alosterik.

Kembali ke atas

6.9 Asal, Pembersihan, dan Kegunaan Enzim

Enzim ada di mana-mana

Enzim adalah komponen penting haiwan, tumbuhan dan mikroorganisma, kerana fakta bahawa mereka memangkin dan menyelaraskan tindak balas kompleks metabolisme selular. Sehingga tahun 1970-an, kebanyakan aplikasi komersial enzim melibatkan sumber haiwan dan tumbuhan. Pada masa itu, enzim pukal secara amnya hanya digunakan dalam industri pemprosesan makanan, dan enzim daripada haiwan dan tumbuhan lebih disukai, kerana ia dianggap bebas daripada masalah ketoksikan dan pencemaran yang dikaitkan dengan enzim
asal mikrob. Walau bagaimanapun, apabila permintaan meningkat dan apabila teknologi penapaian berkembang, kos kompetitif enzim mikrob telah diiktiraf dan ia digunakan dengan lebih meluas. Berbanding dengan enzim daripada sumber tumbuhan dan haiwan, enzim mikrob mempunyai kelebihan ekonomi, teknikal dan etika, yang kini akan digariskan.

Kelebihan Ekonomi

Kuantiti enzim yang banyak yang boleh dihasilkan dalam masa yang singkat, dan dalam kemudahan pengeluaran yang kecil, sangat menyokong penggunaan mikroorganisma. Sebagai contoh, semasa penghasilan rennin (enzim pembekuan susu yang digunakan dalam pembuatan keju) pendekatan tradisional adalah menggunakan enzim yang diekstrak daripada perut anak lembu (lembu muda yang masih memakan susu ibunya). Kuantiti purata rennet yang diekstrak dari perut anak lembu ialah 10 kg, dan memerlukan beberapa bulan penternakan intensif untuk menghasilkan anak lembu. Sebagai perbandingan, penapai 1 000 liter Bacillus subtilis rekombinan boleh menghasilkan 20 kg enzim dalam masa 12 jam. Oleh itu, produk mikrob jelas lebih baik dari segi ekonomi, dan bebas daripada isu etika yang menyelubungi penggunaan haiwan. Sememangnya, kebanyakan keju yang kini dijual di pasar raya diperbuat daripada susu yang dikoagulasi
dengan enzim mikrob (jadi sesuai untuk vegetarian).

Kelebihan selanjutnya menggunakan enzim mikrob ialah kemudahan pengekstrakan. Banyak enzim mikrob yang digunakan dalam proses bioteknologi dirembeskan secara ekstraselular, yang sangat memudahkan pengekstrakan dan penulenannya. Enzim intrasel mikrob juga selalunya lebih mudah diperoleh daripada enzim haiwan atau tumbuhan yang setara, kerana ia biasanya memerlukan lebih sedikit langkah pengekstrakan dan penulenan.

Sumber haiwan dan tumbuhan biasanya perlu diangkut ke kemudahan pengekstrakan, manakala apabila mikroorganisma digunakan kemudahan yang sama biasanya boleh digunakan untuk pengeluaran dan pengekstrakan. Di samping itu, enzim haiwan dan tumbuhan yang penting secara komersil selalunya terletak dalam satu organ atau tisu sahaja, jadi bahan yang tinggal pada dasarnya adalah bahan buangan, yang mana pelupusannya diperlukan.

Akhir sekali, enzim daripada sumber tumbuhan dan haiwan menunjukkan variasi hasil yang luas, dan mungkin hanya tersedia pada masa-masa tertentu dalam setahun, sedangkan tiada masalah ini dikaitkan dengan enzim mikrob.

Kelebihan Teknikal

Enzim mikrob selalunya mempunyai sifat yang menjadikannya lebih sesuai untuk eksploitasi komersial. Berbanding dengan enzim daripada sumber haiwan dan tumbuhan, kestabilan enzim mikrob biasanya tinggi. Contohnya, kestabilan suhu tinggi enzim daripada mikroorganisma termofilik selalunya berguna apabila proses mesti beroperasi pada suhu tinggi (cth. semasa pemprosesan kanji).

Mikroorganisma juga sangat bersetuju dengan pengubahsuaian genetik untuk menghasilkan enzim baru atau diubah, menggunakan kaedah yang agak mudah seperti sisipan plasmid. Manipulasi genetik haiwan dan tumbuhan secara teknikalnya lebih sukar, lebih mahal dan masih menjadi subjek kebimbangan etika yang ketara.

Enzim Mungkin Intraselular atau Ekstraselular

Walaupun banyak enzim dikekalkan dalam sel, dan mungkin terletak dalam petak subselular tertentu, yang lain dilepaskan ke persekitaran sekeliling. Majoriti enzim dalam kegunaan industri adalah protein ekstraselular daripada sumber kulat (cth. Aspergillus spesies) atau sumber bakteria (cth. Bacillus spesies). Contoh-contoh ini termasuk α-amilase, selulase, dextranase, protease dan amyloglucosidase. Banyak enzim lain untuk kegunaan bukan industri adalah intrasel dan dihasilkan dalam jumlah yang lebih kecil oleh sel. Contoh-contoh ini termasuk asparaginase, katalase, kolesterol oksidase, glukosa oksidase dan glukosa-6-fosfat dehidrogenase.

Pembersihan Enzim

Aktiviti enzim berhubung dengan jumlah protein yang ada (iaitu aktiviti khusus) boleh ditentukan dan digunakan sebagai ukuran ketulenan enzim. Pelbagai kaedah boleh digunakan untuk membuang bahan pencemar untuk membersihkan enzim (dan dibincangkan secara terperinci dalam Bab 3). Enzim yang digunakan sebagai reagen diagnostik dan dalam terapeutik klinikal biasanya disediakan pada tahap ketulenan yang tinggi, kerana penekanan yang besar diberikan pada kekhususan tindak balas yang sedang dimangkin. Jelas sekali semakin tinggi tahap penyucian,
semakin besar kos penghasilan enzim. Dalam kes banyak enzim industri pukal, tahap penulenan adalah kurang penting, dan enzim tersebut selalunya boleh dijual sebagai penyediaan sup kultur yang sangat kasar yang mengandungi medium pertumbuhan, organisma (seluruh atau berpecah-belah) dan enzim yang diminati. Walau bagaimanapun, walaupun enzim pukal termurah digunakan (mis. protease untuk digunakan dalam serbuk pencuci), kos enzim boleh menyumbang sekitar 5–10% daripada nilai produk akhir.

Prarawatan

Pada akhir penapaian di mana mikroorganisma yang kaya dengan enzim yang diperlukan telah dikultur, kuahnya boleh disejukkan dengan cepat kepada 5°C untuk menghalang pertumbuhan mikrob selanjutnya dan menstabilkan produk enzim. pH juga boleh diselaraskan untuk mengoptimumkan kestabilan enzim. Jika organisma penghasil enzim adalah kulat, ini mungkin dikeluarkan melalui sentrifugasi pada kelajuan rendah. Jika sumber enzim adalah bakteria, bakteria sering terkumpul dengan aluminium sulfat atau kalsium klorida, yang menafikan cas pada membran bakteria, menyebabkan ia bergumpal dan dengan itu keluar dari ampaian.

Rawatan

Enzim ekstraselular terdapat dalam komponen cecair proses prarawatan. Walau bagaimanapun, enzim intrasel memerlukan rawatan yang lebih meluas. Biojisim mungkin tertumpu dengan sentrifugasi dan dibasuh untuk mengeluarkan komponen sederhana. Komponen selular kemudiannya mesti dipecahkan untuk membebaskan kandungan enzim. Ini boleh dilakukan menggunakan satu atau lebih daripada proses berikut:
• penggilingan bebola (menggunakan manik kaca)
• penyingkiran enzim dinding sel
• kitaran beku–cair
• ricih cecair melalui orifis kecil pada tekanan tinggi (cth. dalam mesin penekan Perancis)
• kejutan osmosis
• sonikasi.

Pengasingan enzim daripada larutan yang terhasil kemudiannya mungkin melibatkan pelbagai pengasingan
proses, yang sering digunakan secara berurutan, seperti yang diterangkan dalam Bab 3.

Penamat Enzim

Enzim adalah antigen, dan sejak masalah berlaku pada akhir 1960-an apabila pekerja pembuatan menunjukkan tindak balas alahan yang teruk selepas menyedut habuk enzim, prosedur kini telah dilaksanakan untuk mengurangkan pembentukan habuk. Ini melibatkan membekalkan enzim sebagai cecair di mana mungkin, atau meningkatkan saiz zarah serbuk kering daripada 10 μm kepada 200-500 μm dengan sama ada prilling (mencampurkan enzim dengan polietilena glikol dan menyediakan sfera kecil dengan pengabusan) atau marumerizing (mencampurkan enzim dengan pengikat dan air, menyemperit filamen panjang, menukarnya menjadi sfera dalam marumerizer, mengeringkannya dan menutupnya dengan
kot berlilin).

Kembali ke atas

6.10 Enzimologi Perindustrian

Walaupun banyak proses perindustrian, seperti pembuatan keju, secara tradisinya menggunakan sumber enzim yang tidak tulen, selalunya daripada haiwan atau tumbuh-tumbuhan, pembangunan kebanyakan enzim perindustrian moden telah berjalan seiring dengan eksploitasi komersial enzim mikrob. Ini diperkenalkan ke Barat pada sekitar tahun 1890 apabila saintis Jepun Jokichi Takamine menetap di A.S.A. dan menubuhkan kilang enzim berasaskan teknologi Jepun. Produk utama ialah Takadiastase, campuran amilolitik dan proteolitik
enzim yang disediakan dengan menanam kulat Aspergillus oryzae pada beras atau dedak gandum. Takadiastase berjaya dipasarkan di U.S.A. sebagai bantuan pencernaan untuk rawatan dispepsia, yang kemudiannya dipercayai akibat daripada pencernaan kanji yang tidak lengkap.

Enzim bakteria telah dibangunkan di Perancis oleh August Boidin dan Jean Effront, yang pada tahun 1913 mendapati bahawa Bacillus subtilis menghasilkan α-amilase yang stabil haba apabila ditanam dalam medium cecair yang dibuat melalui pengekstrakan malt atau bijirin. Enzim ini digunakan terutamanya dalam industri tekstil untuk penyingkiran kanji yang melindungi ledingan dalam pembuatan kapas.

Pada sekitar tahun 1930 didapati bahawa pektinase kulat boleh digunakan dalam penyediaan produk buah-buahan. Pada tahun-tahun berikutnya, beberapa hidrolase lain telah dibangunkan dan dijual secara komersial (cth.pektosanase, selulase, lipase), tetapi teknologinya masih asas.

Selepas Perang Dunia II, industri penapaian mengalami perkembangan pesat kerana kaedah untuk penghasilan antibiotik telah dibangunkan. Kaedah ini tidak lama lagi disesuaikan untuk penghasilan enzim. Pada tahun 1960-an, glukoamilase telah diperkenalkan sebagai cara menghidrolisis kanji, menggantikan hidrolisis asid. Selepas itu, pada tahun 1960-an dan 1970-an, protease telah dimasukkan ke dalam detergen dan kemudian isomerase glukosa diperkenalkan untuk menghasilkan agen pemanis dalam bentuk sirap fruktosa tinggi. Sejak tahun 1990-an, lipase telah dimasukkan ke dalam serbuk pencuci, dan pelbagai proses enzim tidak bergerak telah dibangunkan (lihat bahagian tentang imobilisasi enzim), kebanyakannya menggunakan enzim intrasel.

Pada masa ini, enzim digunakan dalam empat bidang perdagangan dan teknologi yang berbeza (Jadual 6):


SOALAN PENGINGAT BIASA BIOLOGI

1.Bentuk heliks/spiral sangat padat
2.Molekul tidak larut jadi tidak aktif secara osmotik (tidak menjejaskan potensi air)
3. Bercabang supaya glukosa mudah diakses oleh enzim untuk dipecahkan untuk pernafasan
4.Molekul besar jadi tidak boleh meninggalkan sel/permukaan sel silang
selaput

2. bergabung dengan pemeluwapan untuk membentuk ikatan glikosidik

4. "terbalikkan" molekul ganti

5. ikatan hidrogen yang menghubungkan rantai lurus yang panjang

6. selulosa menjadikan dinding sel kuat

7. boleh menahan tekanan turgor/tekanan osmotik

8. ikatan sukar putus

2. Bercantum oleh ikatan peptida

3. Yang terbentuk melalui pemeluwapan

4. Struktur primer ialah susunan asid amino

5. Struktur sekunder ialah lipatan rantai polipeptida disebabkan oleh ikatan hidrogen

6. Struktur tertier ialah lipatan 3-D kerana ikatan hidrogen dan ionik / disulfida
bon

2. Dipecahkan dalam tindak balas satu langkah yang memastikan tenaga tersedia dengan cepat

3. Fosforilat bahan untuk menjadikannya lebih reaktif

GULA TIDAK MENGURANGKAN
1. Lakukan Ujian Benedict dan kekal biru/negatif
2. Rebus dengan asid kemudian meneutralkan dengan alkali
3. Panaskan dengan Benedict dan menjadi merah/oren (mendakan)

2.(Menyebabkan) perubahan dalam urutan asid amino

3.Mutasi membina dari semasa ke semasa

4. Lebih banyak mutasi / lebih banyak perbezaan (dalam asid amino / bes / jujukan nukleotida / primer
struktur) antara spesies yang berkait jauh
ATAU
Beberapa mutasi / perbezaan (dalam asid amino / bes / urutan nukleotida / struktur primer) dalam
spesies yang berkait rapat

ION SODIUM
1. Pengangkutan bersama glukosa/asid amino (ke dalam sel)
2. (Kerana) natrium dialih keluar melalui pengangkutan aktif/pam natrium kalium
3. Mencipta kecerunan kepekatan/penyebaran ion natrium
4. Mempengaruhi osmosis/potensi air

Tapak aktif adalah fleksibel & boleh membentuk sekitar substrat

2. Tapak aktif hanya pelengkap kepada maltosa

3. Penerangan tentang kesesuaian teraruh

4. Enzim ialah mangkin yang merendahkan tenaga pengaktifan yang diperlukan untuk tindak balas

(Rencatan kompetitif),
2. Inhibitor mempunyai bentuk yang serupa dengan substrat
3. Ia mengikat tapak aktif (enzim)
4. Perencatan boleh diatasi dengan menambahkan lebih banyak substrat

Mengekalkan kepekatan natrium yang rendah dalam sel epitelium berbanding dengan
lumen

Glukosa bergerak ke dalam sel epitelium dengan natrium
Melalui protein pembawa/saluran
Glukosa bergerak ke dalam darah

2. Endopeptidase memecahkan polipeptida kepada rantai peptida yang lebih kecil

3. Eksopeptidase mengeluarkan asid amino terminal

2. Banyak mitokondria menghasilkan ATP untuk pengangkutan aktif
3. Protein pembawa hadir untuk pengangkutan aktif

4. Protein saluran / pembawa untuk penyebaran dipermudahkan

5. Pengangkutan bersama natrium dan glukosa dicapai melalui protein pembawa untuk natrium (ion) dan glukosa

2. Fosfolipid (bilayer) menghalang pergerakan/penyebaran bahan polar/tidak larut lipid

3. Protein pembawa membenarkan pengangkutan aktif

4. Protein saluran/pembawa membolehkan resapan/pengangkutan bersama dipermudahkan

5. Bentuk/Caj saluran/pembawa menentukan bahan mana yang bergerak

6. Bilangan saluran/pembawa menentukan berapa banyak pergerakan

7. Luas permukaan membran menentukan berapa banyak resapan/pergerakan

2. Molekul panjang / besar sehingga boleh menyimpan banyak maklumat

3. Helix / bergulung jadi padat

4. Urutan asas membolehkan maklumat disimpan (pembentukan protein)

5. Double terkandas supaya replikasi boleh berlaku secara separa konservatif seperti sedia ada
helai boleh bertindak sebagai templat melalui pasangan asas pelengkap

2. pasangan bes yang disatukan oleh ikatan hidrogen

3. ikatan hidrogen lemah sehingga mudah putus, yang membolehkan helaian terpisah

4. asas terdedah dan bertindak sebagai templat
5. A dengan T, C dengan G

2. Memecahkan ikatan hidrogen antara pasangan asas, mendedahkan mereka

3. Hanya satu helai DNA bertindak sebagai templat

4. RNA nukleotida tertarik kepada bes terdedah

5. (Tarikan) mengikut peraturan pasangan asas (A-U & C-G)

6. RNA polimerase bergabung dengan nukleotida RNA bersama-sama, untuk membentuk pra-mRNA

3. Molekul tRNA membawa asid amino ke ribosom

4. Molekul tRNA tertentu wujud untuk asid amino tertentu

5. Antikodon tRNA pelengkap kepada kodon pada mRNA

6. Ikatan peptida terbentuk antara asid amino bersebelahan

7. tRNA terlepas dan keluar untuk mengumpul asid amino lain

2. Perubahan dalam urutan asid amino

3. Ini mengubah kedudukan ikatan hidrogen/ion/disulfida

2. kromosom yang dibuat daripada dua kromatid yang serupa, disebabkan replikasi dalam interfasa

3. kromosom bergerak ke khatulistiwa sel

4. Kromosom melekat pada gentian gelendong individu

5. Gentian gelendong mengecut & membahagi sentromer

6. Kromatid kakak bergerak ke kutub bertentangan

7. Setiap kutub menerima semua maklumat genetik

2. Kromosom bergaul menjadi pasangan homolognya

3. Persilangan berlaku antara kromosom, melalui pembentukan chiasma

4. Kromosom bercantum kepada gentian gelendong, melalui sentromer

6. Kromosom homolog bergerak ke kutub bertentangan

2. Pelbagai bebas (pengasingan kromosom homolog) dalam meiosis I

3. Pelbagai bebas (pengasingan kromatid) dalam meiosis II

+ Mana-mana tiga daripada:
4. Menyebabkan individu mempunyai penyesuaian yang berbeza menjadikan beberapa disesuaikan dengan lebih baik

7. Ini menyebarkan gen / alel

2. Dapatkan bahagian nipis tisu tumbuhan dan letakkan di atas slaid

3. Calitkan dengan iodin dalam kalium iodida.

2. Tapis untuk membuang serpihan besar / keseluruhan sel

3. Gunakan larutan isotonik untuk mengelakkan kerosakan pada mitokondria/organel

4. Simpan sejuk untuk mengurangkan kerosakan oleh enzim/ gunakan penimbal untuk mengelakkan denaturasi enzim

5. Sentrifuge pada kelajuan yang lebih rendah untuk memisahkan nukleus / serpihan sel / organel berat

2. Molekul kecil / bukan polar / larut lipid melalui fosfolipid / dwilapisan
ATAU
Molekul besar / polar / larut air melalui protein

3. Air bergerak secara osmosis daripada potensi air tinggi kepada potensi air rendah

4. Pengangkutan aktif melawan kecerunan kepekatan

5. Pengangkutan aktif/penyebaran terfasilitasi melibatkan protein/pembawa

6. Pengangkutan aktif memerlukan tenaga / ATP

2. Tidak boleh merentas dwilapisan lipid

3. Ion klorida diangkut melalui penyebaran termudah menggunakan
protein saluran/pembawa

4. Oksigen tidak bercas/non-polar

2. Banyak mitokondria menghasilkan ATP/melepaskan atau membekalkan tenaga untuk aktif
pengangkutan

3. Protein pembawa untuk pengangkutan aktif

4. Protein saluran/pembawa untuk penyebaran dipermudahkan

5. Pengangkutan bersama ion natrium dan glukosa menggunakan protein symport / pembawa

2. Aktif melibatkan penghasilan antibodi oleh sel plasma/sel memori

3. Pasif melibatkan antibodi yang dimasukkan ke dalam badan dari luar

4. Aktif jangka panjang, kerana antibodi dihasilkan sebagai tindak balas kepada antigen

5. Jangka pendek pasif, kerana antibodi yang diberikan dipecahkan

2. Patogen ditelan / termakan

3. Dikurung dalam vakuol, membentuk fagosom

4. Vakuol bercantum dengan lisosom

5. Lisosom mengandungi enzim yang dikosongkan ke dalam vakuol

Sel plasma membuat antibodi

2 antigen mengikat kepada reseptor pelengkap pada limfosit B

3 limfosit menjadi diaktifkan

4 (B) limfosit membiak secara mitosis

2. Antigen dipaparkan pada sel pembentang antigen (makrofaj)

3. Sel T pembantu dengan protein reseptor pelengkap mengikat antigen

4. Sel T pembantu merangsang sel B

5. Dengan antibodi pelengkap pada permukaannya

6. Sel B merembeskan sejumlah besar antibodi

3. Pada pendedahan kedua sel memori menghasilkan menjadi aktif dan menghasilkan antibodi

4. Cepat menghasilkan antibodi/ menghasilkan lebih antibodi

2. Bentuk struktur tertier tapak pengikat

3. Pelengkap kepada antigen

Enzim menggunakan RNA HIV untuk membuat salinan DNA

DNA bercantum untuk menjadi tuan rumah DNA/kromosom sel

DNA yang digunakan untuk membuat salinan RNA HIV

Dan protein/enzim kapsid HIV

Pemasangan zarah virus baru

2. Ventrikel kini mempunyai tekanan yang lebih tinggi daripada atrium (akibat pengisian/penguncupan).
Ini menyebabkan injap atrioventrikular tertutup

3. Ventrikel mempunyai tekanan yang lebih tinggi daripada aorta menyebabkan injap semilunar terbuka

4. Ini membawa kepada tekanan yang lebih tinggi dalam aorta daripada ventrikel (sebagai jantung
mengendur) menyebabkan injap semilunar tertutup

2. Dinding tebal sel tunggal - mengurangkan jarak resapan

3. Sel leper (endothelial) - mengurangkan jarak resapan

4. Fenestrations - membenarkan molekul besar melalui

5. Diameter kecil/ sempit - memberikan luas permukaan yang besar kepada isipadu / pendek
jarak resapan

6. Lumen sempit - mengurangkan kadar aliran memberikan lebih masa untuk resapan

2. Molekul cecair & larut pengsan

3. Protein & molekul besar kekal di belakang

4. Ini merendahkan potensi air

5. Air bergerak kembali ke hujung vena kapilari
secara osmosis

2. lantai mulut diturunkan

3. air masuk kerana penurunan tekanan & an
peningkatan isipadu

4. mulut tertutup, injap operkulum/operkular terbuka

5. naik lantai mengakibatkan tekanan meningkat & volum berkurangan

plat insang atau lamella sekunder

bilangan kapilari yang besar --> untuk mengeluarkan oksigen / untuk mengekalkan kecerunan

epitelium nipis --> laluan resapan pendek

perubahan tekanan --> untuk membawa masuk lebih banyak air / untuk mengekalkan kecerunan

2. Dinding alveoli nipis untuk menyediakan laluan resapan pendek

3. Dinding kapilari adalah nipis di antara alveoli jadi menyediakan laluan resapan yang pendek

4. Dinding kapilari/alveoli mempunyai sel yang rata

5. Membran sel telap kepada gas

6. Banyak kapilari darah menyediakan kawasan permukaan yang besar

7. Otot intercostal & otot diafragma digunakan untuk mengalihkan paru-paru untuk mengekalkan resapan
kecerunan

8. Trakea yang luas & percabangan bronkus/bronkiol untuk aliran udara yang cekap


Interaksi Gen-Persekitaran

Gen tidak wujud dalam vakum. Walaupun kita semua adalah organisma biologi, kita juga wujud dalam persekitaran yang sangat penting dalam menentukan bukan sahaja bila dan bagaimana gen kita mengekspresikan diri mereka, tetapi juga dalam kombinasi apa. Setiap daripada kita mewakili interaksi unik antara solek genetik kita dan julat tindak balas persekitaran kita adalah satu cara untuk menerangkan interaksi ini. Julat tindak balas menegaskan bahawa gen kita menetapkan sempadan di mana kita boleh beroperasi, dan persekitaran kita berinteraksi dengan gen untuk menentukan di mana dalam julat itu kita akan jatuh. Sebagai contoh, jika solekan genetik individu menyebabkan dia mengalami potensi intelek yang tinggi dan dia dibesarkan dalam persekitaran yang kaya dan merangsang, maka dia akan lebih berkemungkinan untuk mencapai potensi penuhnya berbanding jika dia dibesarkan dalam keadaan kekurangan yang ketara. Mengikut konsep julat tindak balas, gen menetapkan had yang pasti pada potensi, dan persekitaran menentukan berapa banyak potensi itu dicapai. Ada yang tidak bersetuju dengan teori ini dan berpendapat bahawa gen tidak menetapkan had pada potensi seseorang.

Satu lagi perspektif mengenai interaksi antara gen dan persekitaran ialah konsep korelasi alam sekitar genetik. Secara ringkasnya, gen kita mempengaruhi persekitaran kita, dan persekitaran kita mempengaruhi ekspresi gen kita (Rajah 6). Bukan sahaja gen dan persekitaran kita berinteraksi, seperti dalam julat tindak balas, tetapi mereka juga mempengaruhi satu sama lain secara dua arah. Sebagai contoh, anak kepada pemain NBA mungkin akan didedahkan dengan bola keranjang sejak kecil. Pendedahan sedemikian mungkin membolehkan kanak-kanak menyedari potensi genetik dan sukannya sepenuhnya. Oleh itu, gen ibu bapa, yang dikongsi oleh kanak-kanak, mempengaruhi persekitaran kanak-kanak, dan persekitaran itu, seterusnya, sangat sesuai untuk menyokong potensi genetik kanak-kanak.

Rajah 6. Alam dan asuhan berfungsi bersama seperti kepingan teka-teki manusia yang kompleks. Interaksi persekitaran dan gen kita menjadikan kita sebagai individu. (kredit “puzzle”: pengubahsuaian kerja oleh Cory Zanker kredit “houses”: pengubahsuaian kerja oleh Ben Salter kredit “DNA”: pengubahsuaian kerja oleh NHGRI)

Dalam pendekatan lain untuk interaksi gen-persekitaran, bidang epigenetik melihat di luar genotip itu sendiri dan mengkaji bagaimana genotip yang sama boleh dinyatakan dalam cara yang berbeza. Dalam erti kata lain, penyelidik mengkaji bagaimana genotip yang sama boleh membawa kepada fenotip yang sangat berbeza. Seperti yang dinyatakan sebelum ini, ekspresi gen sering dipengaruhi oleh konteks persekitaran dengan cara yang tidak sepenuhnya jelas. Sebagai contoh, kembar seiras berkongsi maklumat genetik yang sama (kembar seiras berkembang dari satu telur yang disenyawakan yang membelah, jadi bahan genetik adalah sama dalam setiap kontras, saudara kembar berkembang daripada dua telur berbeza yang disenyawakan oleh sperma yang berbeza, jadi bahan genetik berbeza-beza seperti adik beradik bukan kembar). Tetapi walaupun dengan gen yang sama, masih terdapat jumlah kebolehubahan yang luar biasa dalam cara ekspresi gen boleh terungkap sepanjang hayat setiap kembar. Kadang-kadang, seorang kembar akan menghidap penyakit dan yang lain tidak. Dalam satu contoh, Tiffany, kembar seiras, meninggal dunia akibat kanser pada usia 7 tahun, tetapi kembarnya, kini berusia 19 tahun, tidak pernah menghidap kanser. Walaupun individu ini berkongsi genotip yang sama, fenotip mereka berbeza hasil daripada cara maklumat genetik itu dinyatakan dari semasa ke semasa. Perspektif epigenetik sangat berbeza daripada julat tindak balas, kerana di sini genotip tidak tetap dan terhad.

Pautan ke Pembelajaran

Gen mempengaruhi lebih daripada ciri fizikal kita. Sesungguhnya, saintis telah menemui kaitan genetik kepada beberapa ciri tingkah laku, dari ciri personaliti asas kepada orientasi seksual kepada kerohanian (contohnya, lihat Mustanski et al., 2005 Comings, Gonzales, Saucier, Johnson, & MacMurray, 2000). Gen juga dikaitkan dengan perangai dan beberapa gangguan psikologi, seperti kemurungan dan skizofrenia. Oleh itu, walaupun benar bahawa gen menyediakan pelan tindakan biologi untuk sel, tisu, organ dan badan kita, ia juga mempunyai kesan yang ketara pada pengalaman dan tingkah laku kita.

Mari kita lihat penemuan berikut berkenaan skizofrenia berdasarkan tiga pandangan kami tentang interaksi persekitaran gen. Pandangan manakah yang anda fikir paling sesuai untuk menerangkan bukti ini?

Dalam satu kajian ke atas orang yang menyerah diri untuk diterima pakai, anak angkat yang ibu kandungnya menghidap skizofrenia dan yang telah dibesarkan dalam persekitaran keluarga yang terganggu adalah lebih berkemungkinan untuk mengalami skizofrenia atau gangguan psikotik lain daripada mana-mana kumpulan lain dalam kajian:

  • Daripada anak angkat yang ibu kandungnya menghidap skizofrenia (risiko genetik tinggi) dan yang dibesarkan dalam persekitaran keluarga yang terganggu, 36.8% berkemungkinan menghidap skizofrenia.
  • Daripada anak angkat yang ibu kandungnya menghidap skizofrenia (risiko genetik tinggi) dan yang dibesarkan dalam persekitaran keluarga yang sihat, 5.8% berkemungkinan menghidap skizofrenia.
  • Daripada anak angkat yang mempunyai risiko genetik yang rendah (yang ibunya tidak mengalami skizofrenia) dan yang dibesarkan dalam persekitaran keluarga yang terganggu, 5.3% berkemungkinan menghidap skizofrenia.
  • Daripada anak angkat yang mempunyai risiko genetik yang rendah (yang ibunya tidak mengalami skizofrenia) dan yang dibesarkan dalam persekitaran keluarga yang sihat, 4.8% berkemungkinan menghidap skizofrenia (Tienari et al., 2004).

Kajian menunjukkan bahawa anak angkat yang mempunyai risiko genetik yang tinggi berkemungkinan besar menghidap skizofrenia hanya jika mereka dibesarkan dalam persekitaran rumah yang terganggu. Penyelidikan ini memberikan kredibiliti kepada tanggapan bahawa kedua-dua kelemahan genetik dan tekanan persekitaran adalah perlu untuk skizofrenia untuk berkembang, dan gen sahaja tidak menceritakan kisah penuh.


Abraham, M. dan A. Föppl 1921.Theorie der Elektriziteit. Berlin: B. G. Teubner.

Arrhenius, S. A. 1911a.Das Weltall. Leipzig: A Kröner.

- 1911b.Das Schicksal der Planeten. Leipzig: Akadem. Verl.-Ges.

Bartholomay, A. F. 1960. "Teori Set Molekul: Perwakilan Matematik untuk Mekanisme Tindak Balas Kimia".lembu jantan. Matematik. Biofizik,22, 285–307.

— 1965. “Teori Set Molekul: II. Satu Aspek Teori Biomatematik Set”.lembu jantan. Matematik. Biofizik,27, Terbitan Khas, 235–251.

Berg, L. 1947.Byul. Moskov. Obshchestva Tspytatelli Prirody,52 (5), 15.

Bondy, H. 1952.kosmologi. Cambridge: Monograf dalam Fizik.

Clark, F. dan R. L. M. Synge, Eds. 1959.Prosiding Simposium Antarabangsa Pertama tentang Asal Usul Kehidupan di Bumi. New York: Pergamon Press.

Johnson, M. L., Michael Abercrombie, G. E. Fogg, Editor. 1954. "Asal-usul Kehidupan",Biologi Baru,16, 12–85.

Frank, O. 1899. "Die Grundform des Arteriellen Pulses".Z.f. biol.,37, 483–526.

Gamov, G. 1952.Penciptaan Alam Semesta. New York: Buku Mentor.

Gödel, K. 1930. “Die Vollständignect der Axiome des Logischen Funktionenkalküls”.Monatshefte für Mathematik and Physik,37, 349–360.

— 1931. “Über Formal Unentscheidbare Sätze der Principia Mathematica und Verwandter Systeme I”,,38, 173–198.

Goodman, Howard M. dan Alexander Rich. 1963. "Mekanisme Tindakan Poliribosomal Semasa Sintesis Protein",alam semula jadi,199, 318–322.

Haldane, J. B. S. 1954. "Asal-usul Kehidupan",Biologi Baru,16, 12–27.

Haret, S.C. 1910.Mécanique Sociale. Paris: Gauthier-Villars.

Hoyle, F. 1955.Sempadan Astronomi. New York: Buku Mentor.

Jacob, F. dan J. Monod. 1961. "Mengenai Peraturan Aktiviti Gen",Simposium Cold Spring Harbour mengenai Biologi Kuantitatif,26, 193–211.

Johnson, M. L., M. Abercrombie, dan G. E. Fogg, Editor. 1954. "Perbincangan tentang Asal Usul Kehidupan",Biologi Baru,16, 7–85.

Kleene, S. C. 1952.Pengenalan kepada Metamatematik. Princeton, N.J.: Van Nostrand Co.

Landahl, H. D. 1941a. "Kajian dalam Biofizik Matematik Diskriminasi dan Pelaziman I".lembu jantan. Matematik. Biofizik,3, 13–26.

- 1941b. "Kajian dalam Biofizik Matematik Diskriminasi dan Pelaziman II",,3, 71–77.

Landau, L. dan E. Lifshitz. 1958.Mekanik kuantum. New York: Pergamon Press.

Lederberg, J. 1960. "Pandangan Genetik",Sains,131, 269–276.

Markov, A. A. 1961."Teori Algoritma".Program Jabatan Perdagangan, Israel untuk Terjemahan Saintifik. Washington, D.C.: Yayasan Sains Kebangsaan.

Martinez, H. M. 1964. "Ke Arah Prinsip Reka Bentuk Optimum dalam Biologi Perhubungan".lembu jantan. Matematik. Biofizik,26, 351–365.

McKinsey, J. C., A. C. Sugar, dan Patrik Juppes. 1953. “Asas Aksiomatik Mekanik Zarah Klasik”,Jl. Tikus. Mech. dan Analisis,2, 253–272.

Monod, J. dan F. Jacob 1961. "Mekanisme Teleonomik dalam Metabolisme Selular, Pertumbuhan dan Pembezaan",Simposium Cold Spring Harbour mengenai Biologi Kuantitatif,26, 389–401.

Oparin, A. I. 1957.Asal usul Kehidupan di Bumi. New York: Akhbar Akademik.

Rainich, G. Y. 1950.Matematik Relativiti. New York: John Wiley and Sons.

Rashevsky, N. 1934. "Asas Biofizik Matematik",Philos. daripada Sci.,1, 176–196.

- 1941. "Nota Mengenai Sifat Korelasi antara Ciri-ciri Berbeza Organisme",lembu jantan. Matematik. Biofizik,3, 93–95.

- 1944. "Kajian dalam Teori Fisikomatematik Bentuk Organik",,6, 1–59. I. Bentuk Tumbuhan. II. Pergerakan dan Bentuk Ular. III. Beberapa Pertimbangan Umum tentang Bentuk Berempat. IV. Teori Umum Pergerakan Berempat. V. Kehilangan Tenaga Akibat Kesan Keterlaluan Terhadap Tanah. VI. Cadangan Kaedah Penghampiran untuk Menyelesaikan Persamaan Pergerakan Rantaian Tuas Berpaut. VII. Penerbangan Burung dan Serangga Berkaitan dengan Bentuknya. VIII. Struktur Dalaman Haiwan.

— 1947.Teori Matematik Perhubungan Manusia. Bloomington, Indiana: Principia Press.

— 1951.Biologi Matematik Tingkah Laku Sosial. Chicago: Universiti Chicago Press.

— 1952. “Masalah Pertukaran antara Dua atau Lebih Individu, Didorong oleh Pertimbangan Hedonistik”,lembu jantan. Matematik. Biofizik,14, 137–140.

- 1954. "Topologi dan Kehidupan: Dalam Mencari Prinsip Matematik Umum dalam Biologi dan Sosiologi",,16, 317–348.

- 1955a. "Beberapa Catatan tentang Biologi Topologi".,17, 207–218.

- 1955b. "Kehidupan, Teori Maklumat dan Topologi",lembu jantan. Matematik. Biofizik,17, 229–235.

- 1956a. "Geometrisasi Biologi",,18, 31–56.

- 1956b. "Geometrisasi Biologi: Satu Pembetulan",,18, 233–235.

— 1958. “Sumbangan kepada Pencarian Prinsip-Prinsip Matematik Am dalam Biologi”,,20, 71–93.

- 1959a.Biologi Matematik Tingkah Laku Sosial. Edisi Semakan. Chicago: Universiti Chicago Press.

- 1959b. "Cadangan untuk Pendekatan yang Mungkin untuk Biologi Molekul",lembu jantan. Matematik. Biofizik,21, 309–326.

- 1960a.Biofizik Matematik: Asas Fiziko-Matematik Biologi. Edisi Ketiga dan Semakan. Kelantangandua. New York: Dover Publications, Inc.

- 1960b. "Kehidupan, Teori Maklumat, Kebarangkalian, dan Fizik",lembu jantan. Matematik. Biofizik,22, 351–364.

- 1961a.Prinsip Matematik dalam Biologi dan Aplikasinya. Springfield, Illinois: Charles C. Thomas.

- 1961b. "Biologi Molekul Matematik Abstrak",lembu jantan. Matematik. Biofizik,23, 237–260.

— 1962. “Biologi Molekul Matematik Abstrak: II. Beberapa Akibat Hubungan Hipotesis 'Satu Gen-Satu Enzim'",,24, 327–334.

— 1963. “Prinsip Reka Bentuk Yang Mencukupi dan Sistem Kardiovaskular”,lembu jantan. Matematik. Biofizik,25, 59–74.

Rashevsky, N. 1964.Beberapa Aspek Perubatan Biologi Matematik. Springfield, Illinois: Charles C. Thomas.

— 1965. “Perwakilan Organisma dari Segi Predikat”,lembu jantan. Matematik. Biofizik,27, 477–491.

Rashevsky, N. 1966. “Perwakilan Organisma dari Segi Predikat. II”.Ibid., Lembu jantan. Matematik. Biofizik, dalam akhbar.

Rosen, R. 1958a. "Teori Perhubungan Sistem Biologi",,20, 245–260.

- 1958b. "Perwakilan Sistem Biologi dari Sudut Pandangan Teori Kategori",,20, 317–341.

— 1959. “Teori R Hubungan Sistem Biologi. II",21, 109–128.

- 1960. "Pendekatan Teori Kuantum untuk Masalah Genetik",,22, 227–255.

Rubin, H. dan P. Suppes. 1954. "Transformasi Sistem Mekanik Zarah Relativistik",Pasifik. J. Matematik.,4, 563–601.

Sager, Ruth. 1965. "Gen di Luar Kromosom",Amerika saintifik,212, 70–81.

— dan F. J. Rayon. 1961.Keturunan Sel. New York: John Wiley and Sons.

Warner, Jonathon A., Alexander Rich, dan Cecil A. Hall. 1962. "Kajian Miskroskop Elektron Kluster Ribosom Mensintetik Hemoglobin",Sains,138, 1399–1403.


ZAMAN MOLEKUL

Tidak sampai kemunculan penjujukan pada akhir 1970-an barulah teknik molekul menjadi cukup halus untuk memberi penerangan tentang mekanisme pleiotropik tulen. Ia dengan cepat mendapati bahawa satu lokus boleh menghasilkan produk utama yang berbeza. Produk utama yang berbeza ini didapati berlaku pada semua peringkat ekspresi gen dan pemprosesan protein. Tinjauan yang baik tentang mekanisme molekul pleiotropi boleh didapati dalam P yeritz (1989) dan H odgkin (1998).

Tidak lama selepas penjujukan pertama, didapati bahawa lokus boleh mempunyai bingkai bacaan berbilang atau bertindih (B arrell et al. 1976 S kemarahan et al. 1977). Iaitu, untaian boleh dibaca bermula pada titik yang berbeza supaya satu lokus boleh menghasilkan mRNA yang berbeza dan protein yang berbeza. Penemuan ini telah terbukti agak biasa dalam genom bakteria. Walaupun bingkai bacaan bergantian kadangkala dirujuk sebagai gen yang berbeza, hakikat bahawa maklumat untuk dua produk utama terkandung dalam satu lokus dan kedua-dua produk itu tidak boleh dipisahkan melalui penggabungan semula boleh dikatakan sesuai dengan kriteria untuk pleiotropi.

Terdapat dua cara transkrip ganti boleh dihasilkan dari satu lokus: penyambungan alternatif dan kodon mula/henti alternatif. Mekanisme ini ditemui dalam masa yang singkat selepas beberapa bingkai bacaan dan menyediakan mekanisme untuk pleiotropy pada tahap pemprosesan mRNA. Kodon mula/henti ganti wujud dalam lokus, dan transkripsi ini boleh mengakibatkan bentuk protein terpotong dengan fungsi yang diubah. Penyambungan alternatif membolehkan ekson berbeza dipilih daripada satu lokus (W eber et al. 1977 D enoto et al. 1981). Adalah diketahui bahawa helai mRNA mesti melalui peringkat pemprosesan sebelum ia boleh menghasilkan protein. Intron mesti disambung keluar, hanya meninggalkan ekson (B erget et al. 1977). Seluruh helai kemudian diberi topi dan ekor (F uruichi et al. 1975). Walau bagaimanapun, peringkat penyambungan untuk mRNA dari satu lokus boleh disambung dengan cara yang berbeza untuk menghasilkan helai mRNA yang diproses yang berbeza. Setiap laluan penyambungan alternatif ini akan membawa kepada protein yang berbeza. Melalui pemprosesan RNA, sel boleh menghasilkan pelbagai protein daripada satu lokus DNA. Penyambungan alternatif memainkan peranan dalam banyak aspek penyelenggaraan dan pembangunan sel dan terdapat di mana-mana dalam eukariota yang lebih tinggi (B lack 2003 R eddy 2007).

RNA yang ditranskripsi boleh diubah suai lagi melalui penyuntingan mRNA, pertama kali diterangkan pada tahun 1986 (B enne et al. 1986). Melalui proses ini sel dapat membuat penggantian nukleotida sebenar dalam mRNA, membawa kepada perbezaan asid amino yang boleh menjejaskan fungsi protein. Walaupun perubahan ini boleh menjadi sedikit, kesan ke atas fungsi protein boleh menjadi ketara. Malah satu penggantian boleh memberi kesan kepada komposisi asid amino, struktur sekunder RNA, atau lain-lain bentuk pemprosesan transkrip (M aydanovych dan B eal 2006). Penyuntingan berlaku dalam tisu yang berbeza atau semasa ekspresi berbeza dan mungkin memainkan peranan yang diabaikan dalam penyesuaian (G ommans et al. 2009).

Protein pelbagai fungsi adalah contoh terakhir mekanisme molekul pleiotropi. Dalam kes ini, produk gen tunggal digunakan untuk dua atau lebih fungsi atau mempunyai fungsi yang berbeza dalam tisu yang berbeza. Mekanisme ini telah disemak dan dikelaskan oleh H odgkin (1998). Satu mekanisme, khususnya, melibatkan kelas khas protein pelbagai fungsi (“protein cahaya bulan”) yang baru-baru ini mendapat banyak perhatian. Contoh klasik protein "cahaya bulan" ialah kristal kanta, yang bukan sahaja berfungsi dalam fungsi struktur dalam kanta mata tetapi juga mempunyai sifat enzimatik. Contoh ini terdapat di bawah "pleiotropi angkat" Hodgkin. Walau bagaimanapun, dalam ulasan baru-baru ini (H uberts dan V an D er K lei 2010), penulis menyatakan bahawa protein cahaya bulan tidak boleh dianggap pleiotropik kerana ia ditakrifkan sebagai protein pelbagai fungsi dengan fungsi bebas seperti mutasi dalam kawasan pengekodan untuk protein tidak perlu menjejaskan lebih daripada satu fungsi. Memandangkan ini sebagai definisi semasa, saya tidak akan memasukkan cahaya bulan protein dengan protein pelbagai fungsi lain sebagai mekanisme pleiotropi.


Peraturan Laluan C4

Richard C. Leegood, Robert P. Walker, dalam C4 Plant Biology, 1999

F Fosfoenolpiruvat Karboksikinase

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEP-CK) memangkinkan nukleotida adenine dan pertukaran bergantung Mn 2+ bagi oksaloasetat dan PEP. Walaupun tindak balas ini boleh diterbalikkan secara bebas secara in vitro ( Kayu et al., 1966), kemungkinan tindak balas karboksilasi adalah terhad di bawah keadaan fisiologi kerana pertalian rendah enzim untuk CO.2 (Ray and Black, 1976 Urbina dan Avilan, 1989). PEP-CK terdiri daripada subunit yang, dalam C4 tumbuhan, dalam julat saiz dari 67 hingga 74 kDa ( Finnegan dan Burnell, 1995 Walker dan Leegood, 1996 Walker et al., 1997). Dalam C3 dan tumbuhan CAM enzim mengalami fosforilasi boleh balik dalam kegelapan atau pada waktu malam. Kesan fosforilasi ini tidak jelas, tetapi nampaknya mungkin melibatkan perubahan dalam sifat enzim (Walker et al., 1997). Walau bagaimanapun, PEP-CK hanya terfosforilasi dalam C4 tumbuhan dengan bentuk enzim yang lebih besar (71 kDa)—contohnya, panik maksimum (Walker dan Leegood, 1996). Di sini, enzim difosforilasi dalam daun yang gelap dan dinyahfosforilasi dalam daun yang diterangi, menunjukkan bahawa enzim yang dinyahfosforilasi aktif. Walau bagaimanapun, dalam banyak lagi C4 tumbuhan nampaknya sambungan terminal-N telah dipotong dan tapak fosforilasi telah hilang. Perbandingan jujukan kawasan terminal N PEP-CK daripada timun dan jenis PEP-CK C4 rumput U. panicoides (di mana PEP-CK tidak berfosforilasi) menunjukkan bahawa motif pemfosforilasi yang diduga tidak terdapat pada motif yang terakhir (Finnegan dan Burnell, 1995). Sebaliknya, bentuk 74 kDa PEP-CK, yang terdapat dalam beberapa spesies NADP-ME seperti jagung, tidak terfosforilasi dalam daun jagung yang gelap atau bercahaya (Walker et al., 1997), mencadangkan sama ada perubahan kecil telah berlaku dalam sambungan terminal-N atau aktiviti PEP-CK-kinase tidak hadir.

Sebab PEP-CK tidak terfosforilasi dalam kebanyakan C4 tumbuhan mungkin berkaitan dengan peranannya dalam C4 fotosintesis. Sebagai contoh, dalam C4 tumbuhan, PEP-C dan PEP-CK terletak dalam jenis sel fotosintesis yang berbeza, masing-masing mesofil dan sarung berkas, manakala dalam C3 dan tumbuhan CAM, kedua-dua enzim terletak dalam sitosol sel yang sama. Oleh itu, potensi kurang untuk operasi kitaran sia-sia dengan PEP-C. Walau bagaimanapun, boleh jadi apa sahaja perubahan yang dibawa oleh fosforilasi dan nyahfosforilasi adalah sangat perlahan (rujuk. PEP-C) dan ia memberi kekangan pada fotosintesis dalam, sebagai contoh, persekitaran cahaya yang berubah-ubah. Mungkin penting bahawa kedua-dua dekarboksilase lain dalam C4 fotosintesis dikawal oleh pengubahsuaian kovalen.

Mesti ada mekanisme alternatif dalam C4 tumbuhan yang boleh mengaktifkan enzim dalam cahaya dan menyahaktifkan enzim dalam kegelapan [ia mungkin mengalirkan sitosol OAA ( Carnal et al., 1993) atau ATP]. Bahagian N-terminal PEP-CK tertakluk kepada proteolisis pantas, yang boleh menjejaskan sifat pengawalseliaan seperti kepekaan terhadap efektor. Burnell (1986) memurnikan bentuk PEP-CK yang dibelah daripada julat C4 tumbuhan (U. panicoides, Chloris gayana, dan P. maksimum) dan menunjukkan bahawa enzim itu dihalang oleh beberapa metabolit, termasuk gliserat-3-P, fruktosa-6-P, dan fruktosa 1,6-bifosfat, pada kepekatan fisiologi. Jika metabolit ini adalah perencat yang sama berkesan bagi enzim asli, mereka boleh bertindak untuk menyelaraskan pengangkutan elektron dan metabolisme karbon dengan aktiviti PEP-CK Oleh itu jika ATP menjadi mengehad sama ada dalam mesofil atau sarung berkas, contohnya dalam cahaya malap, ini akan mengehadkan pengurangan gliserat-3-P, yang akan terkumpul dan menghalang PEP-CK. Walau bagaimanapun, jika kapasiti maksimum untuk sintesis sukrosa dicapai, ini akan membawa kepada pengumpulan fruktosa-1,6-bifosfat dan fosfat heksosa, dan sekali lagi menghalang PEP-CK. PEP-CK memangkinkan tindak balas boleh balik secara bebas dan sangat sensitif terhadap perubahan dalam nisbah ATP/ADP ( Walker et al., 1997 lihat juga Kobr dan Beevers, 1971). Oleh kerana bekalan ATP dijana oleh NAD-ME, akan ada gandingan rapat antara kedua-dua enzim (lihat kemudian bab ini). Walau bagaimanapun, sifat pengawalseliaan ini tidak mencukupi untuk merumuskan teori pengawalseliaan PEP-CK yang memuaskan kerana ia gagal menjelaskan bagaimana enzim boleh dimatikan dalam gelap ( Carnal et al., 1993) .


6.1: Satu Gen - Satu Teori Enzim - Biologi

a Jabatan Biokimia, Kolej Perubatan Carver, Universiti Iowa, Iowa City, IA 52242, Amerika Syarikat, dan b TAS, Institut Biologi Sel Stem dan Perubatan Regeneratif, GKVK POST, Bangalore 560 065, India
* E-mel surat-menyurat: [email protected]

Rieske nonheme iron oxygenases (RO) ialah kelas enzim yang dikaji dengan baik. Naftalena 1,2-dioksigenase (NDO) digunakan sebagai model untuk mengkaji RO. Kerja sebelum ini telah menunjukkan bagaimana pengikatan oksigen secara sampingan kepada besi mononuklear menyediakan enzim ini dengan keupayaan untuk memangkinkan stereospecific dan regiospecific. cis -tindak balas dihidroksilasi. Telah didokumentasikan dengan baik bahawa RO memangkinkan pelbagai tindak balas lain, termasuk mono-oksigenasi, penyahjenuhan, O- dan N-dealkilasi, sulfoksidasi dan lain-lain . NDO sendiri memangkinkan pelbagai tindak balas ini. Struktur NDO dalam kompleks dengan beberapa substrat yang berbeza menunjukkan bahawa orientasi substrat dalam tapak aktif mengawal bukan sahaja regiospecificity dan stereospecificity, tetapi juga jenis tindak balas yang dimangkinkan. Adalah dicadangkan bahawa dioksigen diaktifkan besi mononuklear menyerang atom substrat yang paling proksimal dengannya. Pergaulan bebas menyampaikan dua produk (nampaknya melalui dua tindak balas yang berbeza) dari substrat yang sama boleh dijelaskan oleh kemungkinan pengikatan substrat dalam orientasi yang sedikit berbeza dibantu oleh fleksibiliti sisa yang diperhatikan dalam poket pengikat.

1. Pengenalan

Rieske nonheme iron oxygenase memangkinkan pelbagai jenis tindak balas hidroksilasi (Barry & Challis, 2013 Ferraro et al. , 2005 Parales et al. , 2002). Mereka adalah sistem enzim berbilang komponen daripada dua atau tiga komponen protein yang terdiri daripada rantai pengangkutan elektron dan oksigenase. Protein pengangkutan elektron memindahkan dua elektron dari NAD(P)H ke tapak pemangkin oksigenase. Reduktase, dan selalunya feredoxin, bertindak sebagai sistem pengangkutan elektron. Reduktase mengandungi flavin adenine dinucleotide (FAD) dan selalunya gugusan [2F𔃀S] yang bertindak sebagai pusat redoks (Ensley & Gibson, 1983). Komponen oksigenase adalah sama ada α 3 atau α 3 β 3 , di mana subunit α mengandungi gugusan besi jenis Rieske–sulfur dan pusat besi mononuklear (Iwata et al. , 1996). Telah ditunjukkan bahawa oksigen molekul, substrat bersama, mengikat kepada besi mononuklear dan menyerang substrat untuk menghasilkan produk (Bugg & Ramaswamy, 2008).

Naftalena 1,2-dioksigenase daripada Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4 (NDO) ialah salah satu dioxygenases Rieske yang paling dikaji ia adalah α 3 β 3 heksamer dan merupakan oksigenase besi bukan heme Rieske pertama yang mana struktur tiga dimensi ditentukan (Kauppi et al. , 1998). Subunit α NDO mengandungi pusat Rieske [2Fe𔃀S] yang menerima elektron daripada komponen feredoxin, yang berasal daripada NAD(P)H pada komponen reduktase, dan memindahkannya ke besi mononuklear bukan heme di tapak aktif . Domain pemangkin oksigenase terminal ialah pusat 2-His/karboksilat yang diterangkan dengan baik terdiri daripada besi mononuklear yang diselaraskan oleh dua histidin dan satu asid aspartik di dalam tapak aktif hidrofobik yang besar. NDO mempunyai kekhususan substrat yang santai dan memangkinkan dioksigenasi banyak sebatian aromatik dua cincin dan tiga cincin kepada masing-masing. cis -dihidrodiol (Hudlicky et al. , 1999). NDO juga memangkinkan pelbagai tindak balas pengoksidaan lain, termasuk monohidroksilasi, penyahtutuan, O- dan N-dealkilasi, dan sulfoksidasi (Resnick & Gibson, 1996 Resnick et al. , 1996). Julat substrat yang sangat luas dan regioselektiviti tinggi dan enantioselektiviti NDO dan sistem enzim yang berkaitan menjadikan enzim ini penting bukan sahaja dalam degradasi bahan pencemar alam sekitar, tetapi juga dalam pembentukan biokatalitik synthon kiral untuk pengeluaran bahan kimia dan farmaseutikal biologi aktif (Resnick). et al. , 1996 Boyd & Sheldrake, 1998). Baru-baru ini, enzim RedG daripada Streptomyces coelicolor yang memangkinkan carbocyclization oksidatif undecylprodigiosin untuk membentuk strepto­rubin B telah ditunjukkan sebagai Rieske oxygenase (Sydor et al. , 2011). Enzim ini kini juga telah dikenal pasti dalam eukariota dan memainkan peranan dalam metabolisme kolesterol dan biosintesis hormon steroid (Yoshiyama-Yanagawa et al. , 2011 ).

Rieske oxygenases juga menjalankan monohidroksilasi (Capyk et al. , 2009 ) dan demetilasi (Jiang et al. , 2013 ) reaksi dan ini telah disemak baru-baru ini. Mekanisme molekul tindak balas dihidroksilasi yang dimangkinkan oleh NDO telah diterangkan sebelum ini (Karlsson et al. , 2003). Adalah dicadangkan bahawa oksigen diaktifkan melalui pengurangan oleh satu elektron luar, menghasilkan perantaraan besi(III)–(hidro)peroxo (Neese & Solomon, 1998). Mutasi dalam enzim ini yang mengubah regioselektiviti dan stereoselektiviti pembentukan produk menunjukkan bahawa enzim ini boleh diubah suai untuk menghasilkan produk yang berbeza daripada yang dihasilkan oleh jenis liar (Ferraro et al. , 2006). Ringkasan kajian tentang NDO mencadangkan bahawa dioksigen yang diaktifkan, terikat sebelah-on, menyerang substrat secara bersepadu untuk memangkinkan tindak balas dihidroksilasi. Chakrabarty dan rakan sekerja telah menunjukkan bahawa mekanisme itu mungkin diteruskan melalui perantaraan radikal (Chakrabarty et al. , 2007 ).

Untuk merasionalkan cara enzim menentukan jenis tindak balas yang dimangkinkan, kami telah menentukan struktur bagi satu siri kompleks substrat NDO–.Substrat ialah indan, indena, stirena, etilbenzena, fenetole, tio­anisole, etilfenilsulfida dan 1-chloronaphthalene. Untuk mengkaji perencatan aktiviti NDO oleh sebatian perencatan, kami juga kompleks NDO dengan perencat yang diketahui indole-3-acetate dan benzamide dan menentukan struktur kompleks ini.

Kajian yang dilaporkan dalam manuskrip menyediakan asas molekul untuk hipotesis bahawa orientasi pengikatan ligan bukan sahaja mengawal regiospecificity dan stereospecificity pembentukan produk tetapi juga jenis tindak balas yang Rieske oxygenases memangkinkan pada substrat tertentu (Kovaleva & Lipscomb, 2008).

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Ekspresi dan penulenan protein

Protein dihasilkan menggunakan kaedah yang diterangkan dalam Lee et al. (1997 ). Escherichia coli Sel ekspresi protein Bintang DE3 (Invitrogen, Carlsbad, California, Amerika Syarikat) telah diubah dengan plasmid pDTG121 (Wen-Chen & Gibson, 1994). Sel-sel itu kemudiannya ditanam dalam medium garam mineral (Stanier et al. , 1966 ) ditambah dengan 10 m M glukosa, 150 µg ml 𕒵 ampicillin dan 0.6 m M tiamin dalam kelompok 1.5 l pada 37°C sehingga ketumpatan optik pada 600 nm 0.5𔂾.7 dicapai. Sel telah dibawa ke 15°C dan ekspresi protein diinduksi dengan 0.4 m M IPTG. Pada induksi, sel telah ditambah dengan 15 ml 1  M glukosa dan 0.25 m M ferus ammonium sulfat. Sel-sel telah ditanam selama 16 j dengan goncangan pada 150 rev min 𕒵 pada 15°C. Selepas 16 h, sel-sel telah dituai dengan sentrifugasi. Pelet sel telah digantung semula dalam penimbal 1 ml BTGD [50 m M bis-tris, 10%( v / v ) gliserol, 1 m M DTT, pH 6.8] setiap gram pelet dan dibekukan pada 󔽘°C.

Protein telah disucikan seperti yang diterangkan sebelum ini (Lee et al. , 1997). Sel-sel itu dilisiskan menggunakan mesin penekan Perancis dan kemudian disentrifugasi pada �� g selama 30 min untuk membuang serpihan selular. Lysate yang telah dijelaskan telah dimuatkan pada lajur Q Sepharose FF 600 ml (GE Amersham, Piscataway, New Jersey, Amerika Syarikat) dan 0𔃀  M kecerunan kalium klorida dalam BTGD digunakan untuk elusi. Pecahan yang mengandungi protein perang kemerahan dikumpulkan dan ditumpukan menggunakan penumpu Amicon dengan membran YM-100. 4  M ammonium sulfat telah ditambah kepada protein pekat untuk memberikan kepekatan akhir 1  M ammonium sulfat. Protein telah dimuatkan pada lajur Octyl Sepharose FF (GE Amersham) 150 ml dan dicairkan dengan 1.0𔂾.0  M kecerunan ammonium sulfat. Pecahan berwarna coklat kemerah-merahan sekali lagi dikumpulkan dan ditumpukan. Protein pekat telah ditukar penimbal menjadi 1 m M kalium fosfat pH 6.8. Protein telah dimuatkan pada lajur pertukaran ion hidroksiapatit 40 µm Type 1 5 ml (Bio-Rad, Hercules, California, Amerika Syarikat) dan dielusi menggunakan 0.001𔂿.0  M kecerunan kalium fosfat. Pecahan yang mengandungi NDO ditumpukan dan kemudian ditukar penimbal menjadi 50 m M MES, pH 6.8. Protein telah ditumpukan kepada 60 mg ml 𕒵 menggunakan unit penapis emparan Amicon Ultra dengan potongan berat molekul 100 kDa. Titisan protein (kira-kira 1 µl isipadu penurunan) dibekukan kilat dalam nitrogen cecair dan disimpan pada 󔽘°C sehingga digunakan untuk penghabluran.

2.2. Penghabluran protein dan pembentukan kompleks

Protein telah dihablurkan dengan kaedah gantung-drop. Larutan protein 2 µl telah ditambahkan pada larutan penghabluran 2 µl pada slip penutup kaca silikon dan diletakkan di atas perigi yang mengandungi larutan takungan 0.5 ml. Kristal terbentuk dalam titisan yang terdiri daripada 1.9𔃀.2  M ammonium sulfat, 4𔃄% dioksana, 100 m M MES, pH 5.0𔃃.8. Titisan telah diinkubasi pada 6°C dan kristal terbentuk selepas 48󈞴 h. Substrat direndam ke dalam kristal dengan cara yang serupa dengan yang dilaporkan sebelum ini untuk kompleks protein–naphthalene (Karlsson et al. , 2003). 1 µl etanol tepu dengan substrat telah ditambah kepada 19 µl larutan penghabluran dan kristal dipindahkan ke larutan rendaman selama sekurang-kurangnya dua minggu untuk membenarkan substrat mengikat.

2.3. Pengumpulan data, pemprosesan, penyelesaian struktur dan penghalusan

Data pembelauan sinar-X daripada kompleks NDO jenis liar dikumpulkan pada jalur pancaran IMCA-CAT 17-ID di Sumber Foton Lanjutan, Makmal Kebangsaan Argonne menggunakan pengesan ADSC Quantum 210 CCD atau pada jalur pancaran MBC 4.2.2 di Advanced Sumber Cahaya di Makmal Kebangsaan Lawrence Berkeley menggunakan pengesan CCD NOIR-1. Pengumpulan data dan statistik pemprosesan dilaporkan dalam Jadual 1. Data diproses menggunakan d*TREK (Pflugrath, 1999). Struktur NDO jenis liar sebelumnya (entri PDB 1o7w Karlsson et al. , 2003 ) digunakan secara langsung sebagai model permulaan untuk penghalusan. Penapisan pada mulanya dilakukan menggunakan REFMAC 5 (Murshudov et al. , 2011 ) dalam PKC 4 suite perisian v.6.0.0 (Winn et al. , 2011). Program visualisasi molekul Coot (Emsley & Cowtan, 2004) digunakan untuk pembinaan model dan visualisasi. Ligan telah dimodelkan ke dalam ketumpatan elektron dan kedudukannya telah ditapis bersama-sama dengan protein dalam PHENIX suite perisian (Adams et al. , 2011). Kedudukan molekul pelarut telah disahkan menggunakan peta OMIT komposit dengan SOLVENT-OMIT perisian (Brown, 2008), dan molekul pelarut baru telah dimodelkan di mana ketumpatan elektron hadir. Imej telah diberikan dan r.m.s.d. pengiraan dilakukan menggunakan PyMOL (DeLano, 2000).

Jadual 1
Data kristalografi untuk struktur yang dilaporkan

Nilai dalam kurungan adalah untuk shell resolusi tertinggi.

3. Keputusan

3.1. Kompleks dengan indene (masukan PDB 4hm5) dan indan (masukan PDB 4hm4)

NDO memangkinkan tindak balas monohidroksilasi apabila indene atau indan adalah substrat. Indan bertindak balas membentuk ( S )-1-indanol/( R )-1-indanol. Monohidroksilasi inden menghasilkan pembentukan ( S )-1-indenol/( R )-1-indenol (Gibson et al. , 1995 Wackett et al. , 1988). Indan juga mengalami tindak balas desaturasi untuk membentuk indene. Inden juga membentuk produk dihidroksilasi, dengan (1 R ,2 S )-indenediol sebagai jumlah surih isomer utama isomer lain juga dihasilkan. Struktur kristal indan dan indene dalam kompleks dengan NDO telah diperhalusi kepada resolusi 1.6 dan 1.5 Å, dan statistik yang terhasil diringkaskan dalam Jadual 1. Orientasi substrat dalam tapak aktif adalah serupa dengan indole (Rajah 1). Penilaian ketumpatan elektron pengikatan substrat hanya menunjukkan kemungkinan cincin lima anggota diletakkan ke arah pusat besi. Cincin enam anggota terikat di antara Val209 dan Leu307, sisa yang dipercayai menambat cincin kedua substrat di tapak aktif. Kedudukan indole dalam entri PDB 1o7n diwakili oleh atom C biru. Besi mononuklear dan dioksigen model berdasarkan kompleks terner dengan indole dan dioksigen juga ditunjukkan. Walau bagaimanapun, dalam struktur yang dilaporkan di sini tidak ada dioksigen terikat, hanya molekul air yang terikat pada besi mononuklear. Atom C1 dan C2 substrat terikat paling hampir dengan dioksigen yang dimodelkan. Eksperimen biotransformasi juga menunjukkan bahawa semua produk yang terbentuk terbentuk melalui serangan oksigen radikal pada atom C1 dan C2.


Rajah 1
NDO jenis liar dalam kompleks dengan indan (magenta) ( a ) dan dengan indene (hijau) ( b ) bertindih dengan itu dengan indole (biru tua). Sisa tapak aktif NDO diwakili oleh kayu dengan atom C hijau dan cyan. Kedudukan indole, dari kemasukan PDB 1o7n, diwakili oleh atom C biru. Besi mononuklear (sfera oren bertindih menunjukkan kedudukan Fe dalam struktur berbeza yang dilaporkan di sini untuk menggambarkan pergerakan kecil dalam kedudukan Fe) dan dioksigen model (daripada kemasukan PDB 1o7n sfera merah kecil) juga ditunjukkan.

3.2. Kompleks dengan stirena (masukan PDB 4hm7) dan etilbenzena (masukan PDB 4hm3)

NDO memangkinkan tindak balas dihidroksilasi kumpulan vinil dengan stirena untuk menghasilkan 1-fenil-1,2-ethanediol, di mana pembentukan R isomer diutamakan berbanding S isomer dalam nisbah kira-kira 3:1 (Lee & Gibson, 1996 a ). Etilbenzena mengalami monohidroksilasi atom C benzilik untuk membentuk 1-fenetil alkohol dan penyahjenuhan untuk membentuk stirena (Rajah 2 Lee & Gibson, 1996 b ). Struktur NDO dalam kompleks dengan stirena dan etilbenzena kedua-duanya ditentukan pada resolusi 1.6 Å. Pengumpulan data kristalografi dan statistik pemurnian dilaporkan dalam Jadual 1. Untuk kedua-dua etilbenzena (Gamb. 2 a dan 2 b ) dan stirena (Gamb. 2 c dan 2 d ), ligan ditemui di tapak aktif dalam pelbagai orientasi berdasarkan kepadatan elektron. Salah satu orientasi yang boleh dimodelkan termasuk cincin aromatik pada kedudukan yang serupa dengan atom C terhidroksilasi naftalena dan mencadangkan bahawa produk dihidroksilasi akan terbentuk (Tambahan Rajah S1 a dan S1 b ). Walau bagaimanapun, produk dihidroksilasi tidak diperhatikan dalam ujian biotransformasi.


Rajah 2
( a , c ) Produk yang terbentuk dengan etilbenzena ( a ) dan stirena ( c ) sebagai substrat. Nisbah anggaran produk yang dikesan dalam ujian biotransformasi ditunjukkan dalam huruf condong di bawah produk. ( b , d ) NDO jenis liar dalam kompleks dengan stirena (hijau) bertindih dengan NDO dengan naftalena (ungu) ( d ) dan yang dengan etilbenzena (merah) bertindih dengan yang dengan stirena ( b ). Sisa tapak aktif diwakili oleh kayu dengan atom C oren. Besi mononuklear (sfera oren besar) dan dioksigen model daripada kemasukan PDB 1o7n (sfera merah kecil) juga ditunjukkan.

3.3. Kompleks dengan phenetole (masukan PDB 4hm6), tioanisole (masukan PDB 4hm8) dan etilfenilsulfida (masukan PDB 4hm2)

Phenetole dipilih sebagai sebatian perwakilan untuk analisis struktur tindak balas dealkylation. Ia membentuk fenol pada dealkylation. Walau bagaimanapun, pada penyahtutuan kumpulan etil ia membentuk vinyloxybenzene (Rajah 3 Resnick & Gibson, 1993). Begitu juga, thioanisole dan ethylphenylsulfide dipilih sebagai sebatian perwakilan yang menjalani sulfoksidasi untuk pembentukan kompleks dan analisis kristalografi seterusnya. NDO memangkinkan sulfoksidasi kedua-dua sebatian ini untuk membentuk sulfoksida masing-masing (Rajah 3 Kerridge et al. , 1999 Lee et al. , 1995). Struktur phenetole, thioanisole dan ethylphenylsulfide dalam kompleks dengan NDO telah diselesaikan masing-masing kepada 1.6, 1.4 dan 1.5 Å, dan butiran kristalo­grafik diringkaskan dalam Jadual 1. Rajah 3 ( b ) menunjukkan tioanisole terikat dalam tapak aktif NDO. A 1.0 σ (2 F oF c ) peta ketumpatan elektron menunjukkan dua kedudukan atom S yang timbul daripada dua kemungkinan orientasi pengikatan (Tambahan Rajah S1 c ). Satu kedudukan meletakkan sulfur berhampiran besi mononuklear pada jarak 𕙜.3 Å, yang cukup dekat untuk pengoksidaan oleh enzim (Gamb. 3 b ). Dalam kompleks etilfenilsulfida, atom S dan C (S—CH 2 ) masing-masing adalah 2.8 dan 3.9 Å daripada oksigen molekul (Rajah 3 f ), manakala dalam kompleks fenetole terdapat atom O dan C (O—CH 2 ) masing-masing adalah 2.6 dan 3.0 Å daripada oksigen molekul (Rajah 3 d ), yang menunjukkan bahawa tindak balas penyahtepuan dan de­alkilasi tidak mungkin berlaku untuk etilfenilsulfida, dan ini tidak diperhatikan dalam ujian biotransformasi.


Rajah 3
Produk yang dibentuk oleh NDO dengan thioanisole ( a ), fenetole ( c ) dan etilfenilsulfida ( e ). Nisbah anggaran produk yang dikesan dalam ujian biotransformasi ditunjukkan dalam huruf condong di bawah produk. NDO jenis liar dalam kompleks dengan phenetole (hijau) ( d ), dengan etilfenilsulfida (hijau) bertindih dengan naftalena (ungu) ( f ) dan dengan tioanisol (hijau) ( b ), dengan sisa tapak aktif NDO diwakili oleh kayu dengan atom C hijau. Besi mononuklear (sfera oren besar) dan dioksigen model daripada kemasukan PDB 1o7n (sfera merah kecil) juga ditunjukkan.

3.4. Kompleks dengan 1-chloro­naphthalene (kemasukan PDB 4hjl)

Dalam kes 1-chloronaphthalene, NDO dihidroksilasi cincin tidak berhalogen. Atom C pada sisi molekul yang sama dengan atom Cl berada dalam jarak yang paling dekat dengan dioksigen yang dimodelkan. Ini mengakibatkan pembentukan (1 R ,2 S )-8-chloro-1,2-dihydro­naphthalene-1,2-diol sebagai produk utama dan (1 R ,2 S )-5-chloro-1,2-dihydronaphthalene-1,2-diol sebagai hasil kecil (Rajah 4). Struktur NDO dalam kompleks dengan 1-choloronaphthalene ditentukan kepada resolusi 1.5 Å. Pengumpulan data kristalografi dan statistik pemurnian dilaporkan dalam Jadual 1. 1-Chloronaphthalene didapati mengikat dalam kedudukan yang serupa dengan naftalena, berinteraksi dengan Val209 dan Leu307 di atas dan di bawah substrat (Rajah 4). Atom Cl didapati duduk berhampiran pintu masuk tapak aktif di kawasan yang agak terbuka.


Rajah 4
Produk yang dibentuk oleh NDO dengan kloronaftalena. Nisbah anggaran produk yang dikesan dalam ujian biotransformasi ditunjukkan dalam huruf condong di bawah produk. NDO jenis liar dalam kompleks dengan kloronaftalena ditunjukkan dalam warna hijau. Sisa tapak aktif NDO diwakili oleh kayu dengan atom C hijau. Besi mononuklear (sfera oren besar) dan dioksigen model daripada kemasukan PDB 1o7n (sfera merah kecil) juga ditunjukkan.

3.5. Kompleks dengan benzamide (masukan PDB 4hkv) dan indole-3-acetate (masukan PDB 4hm0)

Struktur NDO dalam kompleks dengan benzamide ditentukan pada resolusi 1.65 Å. Pengumpulan data kristalografi dan statistik pemurnian dilaporkan dalam Jadual 1. Inhibitor mengikat di tapak aktif dalam satu orientasi (Rajah 5 a ). Atom N substrat membentuk ikatan hidrogen kepada air/hidroksida yang terikat pada besi mononuklear. Atom O perencat berinteraksi dengan atom N rantai sisi Asn201, yang berjarak 3.6 Å, dan atom N rantai sisi Asn297, yang berjarak 4.0 Å. Ini juga meletakkan cincin aromatik di antara Val209 dan Leu307, sisa yang telah ditunjukkan untuk menambat cincin kedua aromatik di tapak aktif NDO dan RO lain yang serupa (Rajah 5). a ).


Rajah 5
( a ) Sisa tapak aktif NDO dengan benzamide (kuning) terikat diwakili oleh kayu dengan atom C hijau. Besi mononuklear (sfera oren besar) dan dioksigen model daripada kemasukan PDB 1o7n (sfera merah kecil) juga ditunjukkan. ( b ) Sisa tapak aktif NDO terikat kepada indole-3-asetat. Besi mononuklear (sfera oren besar) dan dioksigen model daripada kemasukan PDB 1o7n (sfera merah kecil) juga ditunjukkan.

Struktur NDO dalam kompleks dengan indole-3-acetate ditentukan kepada resolusi 1.8 Å. Pengumpulan data kristalografi dan statistik pemurnian dilaporkan dalam Jadual 1. Inhibitor (analog produk) mengikat di tapak aktif dalam satu orientasi, berdasarkan kepadatan elektron (Rajah 5). b ). Kedua-dua atom O kumpulan karboksilat perencat menyelaraskan logam pemangkin, dengan jarak 2.3 dan 2.1 Å daripada besi mononuklear. Untuk ketekalan, Rajah 5 ( b ) juga menunjukkan dioksigen yang dimodelkan. Walau bagaimanapun, adalah jelas bahawa atom karboksilat menduduki kedudukan yang sangat dekat dengan atom O dioksigen dalam kompleks substrat. Asn201 juga membentuk ikatan hidrogen kepada salah satu atom karboksilat O, menstabilkan orientasi. Cincin aromatik enam anggota substrat juga berada di antara Val209 dan Leu307, kawasan tapak aktif yang dipercayai menstabilkan peletakan cincin aromatik substrat. Atom N indole-3-acetate berinteraksi dengan atom O tulang belakang Asp205 dan rantai sisi Asn297, seterusnya menstabilkan orientasi (Rajah 5). b ).

4. Perbincangan

Dalam kajian ini, kami telah melaporkan struktur NDO dalam kompleks dengan sepuluh ligan berbeza. Ligan ini (substrat dan perencat) tergolong dalam kelas yang berbeza: lapan adalah substrat dan dua adalah perencat. Banyak sebatian seperti indan, seperti indene, indole dan indanol, telah ditentukan sebagai substrat NDO. Tindak balas dihidroksilasi, monohidroksilasi dan penyahtepuan semuanya telah terbukti dimangkinkan oleh NDO pada set sebatian ini (Gibson et al. , 1995). Struktur yang dilaporkan di sini menunjukkan bahawa indole berlabuh di tapak aktif dengan interaksi antara atom N substrat dan dinding tapak aktif. Dalam kes bentuk produk indena, monohidroksilasi dan dihidroksilasi telah dikesan dalam ujian biotransformasi. Naftalena hanya membentuk hasil dihidroksilasi, manakala indena dan indan membentuk hasil yang berbeza. Walaupun tidak kelihatan dalam struktur kristal kami, ruang goyang tambahan yang tersedia membolehkan substrat mengalami perubahan kecil dalam orientasi. Ada kemungkinan perubahan kecil dalam orientasi ini akan mengakibatkan pembentukan produk monohidroksilasi atau dihidroksilasi. Seperti dalam laporan terdahulu, kerja ini juga mencadangkan bahawa regioselektiviti dan stereoselektiviti pembentukan produk dikawal oleh orientasi. Begitu juga, dengan indan, pilihan sama ada monooksigenasi atau desaturasi mungkin merupakan gabungan kedua-dua orientasi dan energetik. Atom C yang sama diletakkan berhampiran besi mononuklear dalam kedua-dua kes. Nisbah produk yang terbentuk berkemungkinan besar ditentukan oleh energetik tindak balas.

Struktur NDO yang dikomplekskan dengan stirena, etil­benzena, tioanisol, fenetole dan etilfenilsulfida juga mencadangkan bahawa orientasi sahaja mengawal selektiviti dan stereoselektiviti wilayah produk. Semua struktur ini menunjukkan substrat yang dimodelkan dalam pelbagai kedudukan. Dalam setiap kes sekurang-kurangnya satu daripada kedudukan yang dimodelkan mencadangkan produk yang akan dibentuk, biasanya cincin dihidrodiol, yang tidak diperhatikan dalam ujian biotransformasi. Dalam keadaan ini, atom berpotensi berbeza dalam kereaktifan, dan dalam hampir semua kes produk yang terbentuk adalah hasil daripada atom yang lebih reaktif teroksida. Ia juga mungkin bahawa kehadiran cincin aromatik adalah penting di tapak yang lebih jauh untuk pengaktifan dioksigen. Teori ini disokong oleh kajian Lee, di mana penambahan benzena kepada protein menghasilkan pengaktifan oksigen diikuti dengan pembentukan radikal, tetapi kekurangan sebarang pembentukan produk: fenomena yang penulis gambarkan sebagai pembongkaran pengangkutan elektron daripada pengikatan. daripada substrat berhampiran dengan besi mononuklear (Lee, 1999).

Benzamide mengikat dalam satu orientasi di tapak aktif NDO. Telah dihipotesiskan bahawa sebatian ini harus mengikat rapat dengan heteroatom berhampiran besi mononuklear kerana cincin aromatik boleh diletakkan di antara Val209 dan Leu307. Di samping itu, kumpulan amida akan dapat berinteraksi dengan sisa bercas pada dinding tapak aktif, sambil membentuk ikatan hidrogen kepada air/hidroksida yang terikat pada besi mononuklear. Struktur sinar-X mengesahkan hipotesis ini. Tiada contoh NDO yang memangkinkan pengoksidaan sebatian yang mengandungi kumpulan amida dan tidak mungkin, berdasarkan bukti struktur, NDO akan dapat memangkinkan pengoksidaan substrat dengan kumpulan amida yang bebas berinteraksi dengan besi mononuklear dengan sangat cekap. . Sebaliknya, NBDO-O JS765 berkemungkinan akan dapat mengoksidakan substrat ini (Lessner et al. , 2002 Friemann et al. , 2003 ).

Struktur NDO dalam kompleks dengan produk telah menunjukkan bahawa besi mononuklear mampu mengikat terus kepada substrat dihidroksilasi melalui interaksi dengan kedua-dua kumpulan hidroksil (Karlsson). et al. , 2003). Berdasarkan maklumat ini, kami membuat hipotesis bahawa besi mononuklear harus menyelaraskan kumpulan karboksilat secara langsung, dengan itu mengawal orientasi substrat. Struktur dengan indole-3-asetat menunjukkan ini berlaku. Tiada data biotransformasi tersedia untuk sebatian ini walau bagaimanapun, sebatian serupa, asid 2-napthoik, adalah substrat NDO (Brilon et al. , 1981). Ini adalah satu-satunya sebatian yang mengandungi karboksilat yang dilaporkan telah diuji sebagai substrat, dan ia adalah unik berkenaan dengan regioselektiviti pembentukan produk: mengoksidakan karbon cincin dengan substituen karboksilat bersama-sama dengan karbon cincin bersebelahan.

Dalam kes bifenil dioksigenase, kajian dok telah menunjukkan bahawa ligan boleh mengikat dalam pelbagai konformasi dan juga bahawa ligan mengikat terlebih dahulu untuk membentuk produk dan mengikat semula untuk menjalani tindak balas kedua (Pham & Sylvestre, 2013 Pham et al. , 2012). Ada kemungkinan bahawa dalam kes NDO produk satu tindak balas mengikat semula sebagai substrat berlaku. Nisbah berbilang produk berbeza yang terbentuk daripada substrat yang sama menunjukkan bahawa dalam poket besar NDO pelbagai kitaran tindak balas boleh berlaku apabila substrat yang lebih kecil terlibat: contohnya, indan boleh ditukar kepada indena dan kemudian kepada monohidroksilasi atau dihidroksilasi. hasil daripada indine. Walau bagaimanapun, memandangkan keupayaan untuk pelbagai mod pengikatan, produk yang berbeza juga boleh dibentuk. Ini menyokong idea yang dicadangkan oleh Kovelva dan Lipscomb bahawa pengikatan substrat memulakan pembentukan hidroperoksida, yang kemudiannya menyerang substrat (Kovaleva & Lipscomb, 2008). Menariknya, pada superposisi semua kompleks yang berbeza antara satu sama lain dan melihat saiz poket yang mungkin (Rajah 6), adalah jelas bahawa dalam semua kes poket adalah sangat rata dan kebanyakan ligan mengikat dengan sisihan yang sangat sedikit. . Konformasi yang ditunjukkan dalam Rajah 6 adalah daripada karya yang diterbitkan sebelum ini serta daripada kajian ini. Walaupun sesetengah substrat boleh dimodelkan dalam berbilang orientasi dalam kajian kami (Tambahan Rajah S1), hanya orientasi yang mungkin menghasilkan produk yang telah disahkan dalam kajian bio­transformasi dibentangkan. Kami berpendapat bahawa orientasi lain adalah pengikatan yang tidak produktif dan oleh itu secara fungsional tidak relevan. Lebih menarik, superposisi semua struktur yang berbeza untuk memahami kemungkinan fleksibiliti asid amino dalam poket pengikat substrat juga mendedahkan bahawa Leu253 dan Phe224 menunjukkan fleksibiliti maksimum (Rajah 7). Ini mengesahkan idea bahawa dengan menukar beberapa sisa dalam poket pengikat seseorang boleh mengawal selektiviti substrat yang boleh mengikat serta orientasi, seperti yang telah ditunjukkan oleh kami untuk NDO dan seperti yang telah ditunjukkan untuk carbazole dioxygenase (Inoue). et al. , 2014 Nojiri et al. , 1999). Kerja baru-baru ini juga telah menunjukkan bahawa ia juga mungkin untuk mencapai selektiviti dengan mengawal kemasukan ke tapak aktif (Escalante et al. , 2017 ).


Rajah 6
Gambarajah stereo superposisi semua ligan yang dibincangkan dalam manuskrip dari dua pandangan berbeza: ( a ) berserenjang dengan satah gelang aromatik dan ( b ) selari dengan satah gelang aromatik.

Rajah 7
Gambarajah stereo superposisi (dari semua struktur yang dibincangkan dalam manuskrip ini) sisa dalam tapak aktif, menggambarkan perubahan dalam bentuk sisa yang mengikat besi mononuklear dan substrat. Atom Fe, Phe202 dan Leu253 dilabelkan.

Sangat menggoda, berdasarkan struktur ini dan struktur lain Rieske oxygenases yang memangkinkan tindak balas yang bergantung kepada oksigen pada pelbagai substrat, untuk mencadangkan bahawa peranan pemangkin utama enzim ialah penghasilan radikal oksigen apabila substrat mengikat, jika oksigen molekul dan elektron tersedia. Sisa-sisa yang menambat gugusan Rieske dan yang memegang pusat besi mononuklear (triad 2-His/karboksilat) dan sambungan antara kedua-dua pusat dipelihara, manakala sisa-sisa yang memegang substrat di tapak aktif tidak dipelihara dan menentukan jenis substrat (selektiviti) dan orientasi substrat yang mengikat ke tapak aktif. Sisa-sisa ini kemudiannya memainkan peranan dalam sifat orientasi substrat yang tepat terhadap spesies radikal oksigen yang dihasilkan dan dengan itu menentukan pembentukan produk. Memandangkan kebanyakan enzim ini telah berkembang untuk mengaktifkan bahan pencemar alam sekitar lengai untuk digunakan sebagai sumber karbon, strategi evolusi ini mengoptimumkan pemeliharaan fungsi teras (penjanaan spesies radikal bertenaga tinggi) namun membenarkan penyesuaian kepada pelbagai sumber karbon yang mungkin perlu direndahkan.


Peraturan Gen Prokariotik di Tempat Kerja

Seperti yang baru kita pelajari, terdapat tiga jenis molekul pengawalseliaan yang boleh menjejaskan ekspresi operon: penindas, pengaktif dan induser.

  • Penekan adalah protein yang menyekat transkripsi gen sebagai tindak balas kepada rangsangan luar. Dalam erti kata lain, penindas menyimpan gen “off.”
  • Penggerak adalah protein yang meningkatkan transkripsi gen sebagai tindak balas kepada rangsangan luar. Dalam erti kata lain, pengaktif menghidupkan gen “.”
  • Inducers adalah molekul kecil yang sama ada mengaktifkan atau menekan transkripsi bergantung pada keperluan sel dan ketersediaan substrat. Inducers pada asasnya membantu mempercepatkan atau memperlahankan “on” atau “off” dengan mengikat pada penindas atau pengaktif. Dalam erti kata lain: mereka tidak bekerja sendiri.

Dalam interaktif di bawah, kami akan menumpukan pada perbezaan antara pengaktif dan penindas:


Tonton video: REPRODUKSI SEKSUAL BAKTERI: KONJUGASI, TRANSDUKSI DAN TRANSFORMASI (Disember 2022).