Maklumat

Adakah saya perlu menggunakan individu WT C57BL yang sama untuk melintasi belakang atau bolehkah saya menggunakan yang baharu untuk setiap generasi?

Adakah saya perlu menggunakan individu WT C57BL yang sama untuk melintasi belakang atau bolehkah saya menggunakan yang baharu untuk setiap generasi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya baru sahaja menerima tikus heterozigot C57BL daripada COMP dan saya perlu mula menyeberanginya. Saya telah membaca banyak protokol pengurusan koloni, tetapi tidak dapat memahami sama ada saya perlu menggunakan tetikus WT yang sama untuk semua ~10 generasi lintasan belakang atau menggunakan yang baharu untuk setiap generasi. Terima kasih!


Adakah saya perlu menggunakan individu WT C57BL yang sama untuk melintasi belakang atau bolehkah saya menggunakan yang baharu untuk setiap generasi? - Biologi

Model haiwan telah menjadi alat kritikal sejak zaman awal penemuan saintifik. Hari ini ia amat diperlukan dalam penyelidikan bioperubatan yang menyumbang kepada pemahaman kita tentang fungsi gen, etiologi dan mekanisme penyakit yang berbeza, serta keberkesanan dan ketoksikan ubat-ubatan dan bahan kimia. Genom organisma model utama telah dijujukan, mengesahkan tahap pemuliharaan genetik yang tinggi di kalangan organisma model dan manusia.

Labome meninjau literatur untuk instrumen dan reagen. Labome telah meninjau penerbitan rasmi yang memetik model haiwan untuk memberikan gambaran keseluruhan model haiwan dalam penerbitan (Jadual 1). Hasil tinjauan menunjukkan bahawa tetikus adalah haiwan makmal yang paling digemari. Tikus dan strain tikus yang paling banyak digunakan ialah tikus C57BL/6, tikus BALB/c, tikus Sprague-Dawley dan tikus Wistar. Strain lain, seperti tikus A / J, tikus CD1, dan tikus ICR, juga digunakan. Majoriti haiwan ini dibekalkan oleh empat pembekal utama, The Jackson Laboratory, Charles River Laboratories, Taconic Biosciences dan Harlan Laboratories. Model haiwan yang disebutkan di atas digunakan untuk penyelidikan dalam imunologi, onkologi, fisiologi, patologi, dan semakin banyak, neurosains. Beberapa model tetikus yang menarik dibincangkan kemudian dalam artikel ini.

haiwan ketegangan pembekal bilanganrujukan
tetikus C57BL/6 Makmal Jackson 101 [1, 2]
Sungai Charles 30 [3]
Biosains Taconic 17 [4, 5]
Makmal Harlan 10
BALB/CMakmal Jackson 15 [6, 7]
Sungai Charles 12 [8]
Biosains Taconic 5
Makmal Harlan 3
CD-1 14 [9, 10]
SCID 10 [11, 12]
A/J 4
tikus Sprague-Dawley 16 [2, 13]
Wistar 9 [14, 15]
Long Evans 3 [14, 16]

Albinisme tikus makmal: Majoriti tikus makmal adalah albino, disebabkan oleh mutasi biasa dalam gen tyrosinase dalam semua strain tikus makmal albino [17] dan sekurang-kurangnya beberapa strain tikus albino [18]. Tyrosinase ialah enzim pengehad kadar dalam penghasilan pigmen melanin. Kelaziman albinisme dalam kalangan tikus makmal adalah kerana kebanyakan strain terawal yang ditubuhkan adalah albino, dan juga albinisme adalah penanda pemilihan yang mudah pada hari-hari awal.

taip 2018 2015 2010 2000
Tikus, strain inbred 30192 29504 24403 11739
Tikus, transgenik 13781 15653 14380 5739
Tikus, kalah mati 8876 9742 9182 3400
Tikus, congenik 18 28 111 44
Tikus, tiada satu pun di atas * 33085 34528 30080 16308

Tikus adalah model haiwan yang paling kerap disebut dalam penerbitan bioperubatan (Jadual 1). Kebanyakan penerbitan yang ditinjau oleh Labome memetik pelbagai jenis tikus (bersama-sama dengan tikus, dan kadangkala arnab, ferret, guinea pig dan rhesus macaque). Jadual 2 dan 3 menyenaraikan bilangan artikel yang diberi penjelasan dengan tajuk subjek perubatan tertentu (MeSH) atau parameter carian yang berkaitan dengan tikus dalam pangkalan data PUBMED. Adalah jelas bahawa penyelidikan yang dijalankan ke atas model tetikus terus menjadi bahagian penting dalam usaha dan pengetahuan penyelidikan kolektif kami, walaupun dengan usaha berterusan untuk menggantikan ujian haiwan dengan model kultur sel atau ramalan pengiraan, terutamanya untuk kajian toksikologi [19].

Kelaziman model tetikus dalam penyelidikan bioperubatan tidak menghairankan memandangkan tikus memerlukan penjagaan yang agak murah, membiak dengan cepat, dan mempunyai persamaan genetik yang tinggi dengan manusia. Teknologi, seperti kaedah transgenik, telah dibangunkan dengan sangat baik dalam model tetikus untuk mengkaji genetik dan fungsi gen tertentu. Model tetikus bagi banyak penyakit manusia juga telah dibangunkan untuk memajukan kajian patogenesis penyakit, dan untuk menilai keberkesanan dan ketoksikan pelbagai ubat calon. Walau bagaimanapun, tikus makmal biasanya dibesarkan dalam kemudahan kebersihan luar biasa yang berbeza daripada persekitaran yang kaya dengan patogen bagi populasi tikus yang hidup bebas dan/atau tikus kedai haiwan peliharaan. Tikus yang terakhir lebih menyerupai manusia dari segi sifat imun [20]. Rosshart SP et al menanam embrio C57BL/6 ke dalam tikus liar untuk menghasilkan koloni baru tikus C57BL/6 ("liar") yang mengekalkan mikrobiota dan patogen semulajadi [21]. Walaupun begitu, variasi rendah dan sifat berguna yang diterangkan di atas telah menjadikan model tetikus sebagai alat yang tidak ternilai untuk memajukan kemajuan bioperubatan.

ketegangan 2018 2015 2010 2000
C57BL 19807 18944 14961 5437
BALB/c 8186 7913 7052 4230
ICR 1411 1476 1258 709
angguk 1047 1207 651 247
C3H 258 402 642 862
DBA 280 362 457 496
CBA 156 225 349 566
Tanpa rambut 93 110 127 87
MRL lpr 60 77 70 115
NZB 17 30 56 55
AKR 8 19 46 79
A 9 25 65 103
CFTR 3 15 21 5
SENCAR 0 1 6 18

Strain baka, tikus transgenik dan kongenik dengan latar belakang baka adalah model tetikus yang biasa digunakan. Strain inbred ditakrifkan sebagai strain yang telah melalui sekurang-kurangnya 20 generasi sib-mating (atau yang setara), menjadikan haiwan daripada strain inbred yang sama secara berkesan serupa secara genetik. Tikus transgenik dengan mutasi tertentu yang diminati agak mudah dihasilkan dengan kaedah kejuruteraan genetik moden seperti suntikan vektor penyasaran atau CRISPR. Sebaik sahaja dihasilkan mutasi yang diminati ini dengan kerap mesti dibiakkan ke dalam garis konggenik. Strain konggenik, yang memperkenalkan sifat atau mutasi tertentu ke dalam latar belakang yang kebanyakannya baka, dicapai melalui silangan belakang berulang mutasi yang diminati kepada strain latar belakang baka biasanya untuk sekurang-kurangnya 10 generasi.

Strain tetikus yang paling banyak disebut ialah C57BL/6, BALB/c, CD-1, SCID dan A/J (Jadual 4). Hanya CD-1 adalah strain baka luar. Di bawah ini kita membincangkan secara ringkas setiap strain ini.

keteganganciri utamakelebihanaplikasi utama
C57BL/6 inbred, hitam kestabilan terikan, pembiakan mudah model fisiologi atau patologi untuk dalam vivo eksperimen, ketegangan latar belakang untuk transgenik dan kongenik
BALB/c inbred, albino, immunodeficient pembiakan mudah, terdedah kepada tumor hibridoma dan pengeluaran antibodi monoklonal, model penyelidikan untuk terapi kanser dan imunologi.
CD-1 keturunan luar, albino kebolehubahan genetik pengklonan kedudukan, pemilihan genotip, ujian toksikologi (dipersoalkan)
CB17 SCID inbred, albino tiada sel T dan B, pemindahan tumor model haiwan immunodeficient untuk menguji rawatan kanser baharu dan sebagai perumah untuk tisu sistem imun manusia.

Tikus C57BL/6, juga dipanggil "C57 black 6" atau ringkasnya "Black 6" atau disingkat sebagai 'B6', mempunyai kelebihan kestabilan terikan dan pembiakan yang mudah. Ini juga merupakan strain tikus pertama yang genomnya disusun sepenuhnya pada tahun 2002, tidak lama selepas genom manusia. Konsortium Fenotaip Tetikus Antarabangsa IMPC [22], yang dilancarkan pada September, 2011, bertujuan untuk mengkatalogkan fungsi setiap gen tetikus dalam strain ini melalui teknologi kalah mati.

Penggunaan tikus C57BL/6 terdiri daripada tiga pendekatan bertindih utama. Pertama, mereka sering berfungsi sebagai model fisiologi atau patologi untuk dalam vivo pengajian. Sebagai contoh, Strickley JD et al menyiasat imuniti tikus terhadap papillomavirus komensal menggunakan C57BL/6 dan tikus lain [23]. Szőnyi A et al menggunakan tikus C57Bl/6J jenis liar dan transgenik (ChAT-iRES-Cre, CRH-iRES-Cre, vGAT-iRES-Cre, vGAT-iRES-Cre::Gt(ROSA26)SorCAG/tdTomato ) untuk mengkaji peranan nukleus batang otak incertus sel GABAergik dalam pembentukan memori kontekstual [24]. Zott B et al mengkaji kesan dimer peptida beta-amyloid pada penindasan pengambilan semula glutamat dan hiperaktivasi neuron dalam tikus jenis liar C57BL/6N dan model penyakit Alzheimer [25]. Juga, pada tahun 2015, menggunakan tikus C57BL/6, penyelidik menemui saluran limfa sistem saraf pusat [26]. Kedua, ia sering digunakan untuk membina model tetikus transgenik, seperti yang mempunyai protein pendarfluor hijau yang boleh diaktifkan foto (PA-GFP) [27]. Banyak talian transgenik sedemikian kemudiannya digunakan untuk dalam vivo kajian baru disebut. Ketiga, tikus C57BL/6 sering digunakan sebagai ketegangan latar belakang untuk penjanaan kongenitik dengan kedua-dua mutasi spontan dan teraruh. Walau bagaimanapun, penjagaan mesti diambil kerana sublines tertentu mungkin mempunyai variasi genetik, yang mungkin menimbulkan komplikasi dalam mana-mana kajian penyasaran gen, seperti yang dilaporkan dalam kes C57BL/6NHsd [28].

Disebabkan popularitinya beberapa substrain C57BL/6 telah ditubuhkan. Adalah penting untuk mengetahui dengan substrain mana anda bekerja kerana variasi genetik dan fenotip yang penting wujud di kalangan mereka [29]. Substrain C57BL/6 biasa termasuk C57BL/6J (diselenggarakan di The Jackson Laboratory) dan C57BL/6N (ditubuhkan di Institut Kesihatan Negara). IMPC memilih sel stem embrionik daripada C57BL/6N [30, 31], manakala Mouse Genome Sequencing Consortium [32] dan Allen Brain Atlas [33] menggunakan C57BL/6J. Substrain mempunyai perbezaan fenotip [34, 35], dan beberapa variasi genetik yang mendasari telah dikenalpasti [34, 36]. Sebagai contoh, mutasi bukan sinonim serine kepada fenilalanin (S968F) dalam sitoplasma FMRP berinteraksi protein 2 (Cyfip2), terdapat dalam substrain C57BL/6N dan bukan dalam substrain B57BL/6J, bertanggungjawab untuk tindak balas akut dan sensitif yang lebih rendah terhadap kokain dan methamphetamine diperhatikan dalam substrain [36].

Kebanyakan substrain C57BL/6 "dikurangkan secara genetik daripada salah satu enzim antioksidan mitokondria yang paling penting, transhidrogenase (gen NNT), disebabkan oleh penghapusan semula jadi dalam ekson gen ini yang menghalang sepenuhnya ekspresi protein [34, 37] " , dan mutasi bertanggungjawab untuk pelepasan glukosa terjejas dan tahap glukosa rehat yang lebih tinggi sedikit daripada strain dengan Nnt jenis liar seperti C57BL/6NJ [38]. Tikus C57BL/6J dengan mutasi Nnt mempunyai jangka hayat yang normal, tidak menghidap diabetes, dan mempunyai tindak balas obesiti yang disebabkan oleh diet biasa (dari Jackson Laboratories).

Tikus hibrid, seperti B6C3, kacukan antara C57BL/6J betina (B6) dan jantan C3H/HeJ (C3), semakin popular. Tikus hibrid adalah secara genetik heterozigot dan cenderung berfungsi sebagai latar belakang untuk beberapa mutasi yang merosakkan. Holth JK et al menggunakan tikus Jackson Laboratory B6C3F1/J (#100010) dan B6C3 tau P301S (# 008169) untuk mengkaji paras cecair interstisial otak tetikus semasa kitaran tidur-bangun [39].

Antara artikel yang ditinjau oleh Labome, peratusan yang ketara menyebut ketegangan tetikus C57BL/6. Berkemungkinan strain C57BL/6 akan terus menjadi strain pilihan, disebabkan oleh fakta bahawa genomnya telah dijujukan, kepada usaha bersepadu analisis fungsi gen oleh IMPC dan usaha sistematik lain seperti pembinaan connectome [40]. Walaupun kelebihan menggunakan strain "standard" dalam penyelidikan adalah jelas, isu menarik telah dibangkitkan tentang kelemahan amalan sedemikian, lihat Masalah Dengan Hitam-6.

Tikus C57BL/6 jenis liar, konggenik dan transgenik/kalah mati dari Makmal Jackson (C57BL/6J) telah digunakan untuk mengkaji, contohnya, pengurangan mikrobiota sementara [41], memori sel myeloid semula jadi kepada molekul MHC bukan diri [5] , kesan diet garam tinggi pada hiperfosforilasi tau dalam otak dan demensia [42], induksi faktor transkripsi dalam neuron melalui depolarisasi [43], peranan nukleus batang otak incertus sel GABAergik dalam pembentukan memori kontekstual [24], neurogenesis dalam prostat kanser [44], trombosis vena dan NETosis [45], hos penerima untuk pemindahan angkat [46], peranan synaptotagmin-3 dalam endositosis dan kekuatan sinaptik [47], neurodegenerasi alpha-synuclein dalam penyakit Parkinson [48]. Apabila disilangkan dengan tikus yang mempunyai gen flox, tikus nestin-Cre transgenik C57BL/6J dari makmal Jackson boleh digunakan untuk mencapai ketidakaktifan bersyarat gen dalam sistem saraf [49]. Tikus ROSA26R(EYFP) dengan latar belakang C57BL/6 biasanya digunakan untuk menunjukkan ungkapan Cre [50]. Chopra S et al menyilang balik tikus Vav1 cre dan CD11c cre dengan tikus flox lain untuk menghasilkan kalah mati bersyarat dalam leukosit atau sel dendritik, masing-masing [51]. Rosshart SP et al menggunakan tikus SPF C57BL/6 dari Makmal Jackson untuk mengkaji mikrobiota dan tindak balas imun tikus makmal yang dilahirkan kepada tikus liar [21].

Charles River Laboratories (juga usaha sama Vital River di China) ialah satu lagi pembekal utama tikus C57BL/6. Seperti C57BL/6J, tikus Charles River C57BL/6 (C57BL/NCrl) telah digunakan untuk mengkaji pelbagai subjek dalam biologi. Ini termasuk pengubahsuaian histon semasa peralihan ibu bapa-ke-zigotik manusia [52], peranan synaptotagmin-3 dalam endositosis dan kekuatan sinaptik [47], dan kemasukan cecair serebrospinal semasa iskemia [3].

C57BL/6 tikus dari Taconic (C57BL/6NTac) digunakan untuk mengkaji memori sel myeloid semula jadi kepada molekul MHC bukan diri [5], mikrobiota dan tindak balas imun tikus makmal yang dilahirkan kepada tikus liar [21], fungsi lisosom dan homeostasis makrofaj [ 53], penglibatan rapamycin melalui gangguan mTORC2 dalam rintangan insulin [54] dan mikrobiota kulit [55]. Hang S et al mengkaji tikus C57BL/6NTac dengan bakteria filamen tersegmen daripada Taconic Bioscience [56]. Ciccone R et al menggunakan Tg2576 tikus dan WT littermates dari Taconic, sebagai model penyakit Alzheimer untuk mengkaji hiperaktif neuron [57].

Harlan Laboratories C57BL/6 tikus digunakan untuk mengkaji mekanisme pengawalseliaan pembezaan sel T [58].

Wang L et al membeli tikus C57BL/6 daripada Joint Ventures Sipper BK Experimental Animal di Shanghai, China untuk mengkaji tindak balas imun semula jadi terhadap DNA virus nuklear [59]. Persson EK et al menggunakan tikus C57BL/6 (6 hingga 7 minggu) dari Janvier Labs di Saint-Berthevin, Perancis untuk menyiasat kristal Charcot-Leyden [60]. B de Laval et al memperoleh CD45.2 tikus daripada Janvier [61]. Noda S et al memindahkan sel stem pulpa gigi primer manusia ke dalam rongga tulang calvarial tikus C57BL/6JJcl yang diperolehi daripada CLEA Jepun [62]. Dominy SS et al memperoleh tikus BALB/c betina bebas patogen tertentu (SPF) dari Envigo untuk mengkaji Porphyromonas gingivalis dalam otak penyakit Alzheimer [63]. Moro A et al mengasingkan fibroblas dermal untuk ujian gel fibrin 3D daripada Envigo C57BL/6 tikus untuk mengkaji peranan mikroRNA dalam hemeostasis kekakuan tisu [64]. Kemudahan haiwan akademik atau kebangsaan juga merupakan pembekal. Tikus C57BL/6J kedua-dua jantina dari NIA Aged Rodent Colonies digunakan untuk mengkaji penglibatan retrotransposon L1 semasa penuaan selular [65].

BALB/c ialah albino, terikan tikus inbred immunodeficient. Tikus BALB/c mempunyai ciri pembiakan yang mudah dan variasi berat minimum antara jantan dan betina. Walaupun tikus BALB/c berfungsi sebagai model haiwan tujuan umum, strain ini digunakan secara meluas untuk pengeluaran antibodi hibridoma dan monoklonal, contohnya, untuk penjanaan antibodi anti-neuropilin-1 [7], antibodi anti-trptase [66], dan lain-lain [67], dan amat berguna untuk penyelidikan dalam terapi kanser dan imunologi. Perlu diperhatikan bahawa kejadian tumor susu dalam tikus BALB/c adalah rendah, tetapi mereka sangat sensitif terhadap karsinogen, dan boleh membina tumor paru-paru, neoplasma retikular, tumor buah pinggang, dan kanser lain. Di samping itu, suntikan minyak mineral dengan mudah boleh mendorong plasmacytomas dalam ketegangan BALB/c.

Contoh penyelidikan dengan tikus BALB/c termasuk pemeriksaan imuniti antiplasmodial dalam nyamuk [68], menunjukkan tindak balas perumah terhadap virus influenza A dimodulasi oleh protein novel PA-X [69], dan mengkaji keberkesanan antibodi CR8020 terhadap kumpulan 2 virus influenza dalam tikus BALB/c dari Sungai Charles [70]. Charles River BALB/c tikus digunakan untuk melakukan jangkitan parasit untuk mengkaji imuniti antiplasmodial dalam nyamuk [68].

Satu aplikasi biasa BALB/c, seperti C57BL/6, adalah untuk berfungsi sebagai ketegangan latar belakang untuk pelbagai kajian kekurangan gen/kalah mati.

Seperti yang dinyatakan di atas, tikus BALB/c memainkan peranan penting dalam penyelidikan onkologi. Sebagai contoh, Mauffrey P et al menggunakan Balb / c nu / nu dari makmal Charles River untuk mengkaji neurogenesis dalam kanser prostat [44]. Besse A et al mengkaji perencatan proteasome dalam tikus Balb/c betina yang dipadankan dengan umur dari Sungai Charles untuk mengoptimumkan rawatan pelbagai myeloma dengan perencat proteasome individu [71]. Yi W et al melakukan xenograf subkutaneus dengan menggunakan tikus athymic nude (Nu/Nu) Charles River Laboratories untuk menunjukkan bahawa gabungan FGFR-TACC berlaku pada pesakit GBM tertentu [72] dan mengkaji peranan glikosilasi PFK1 dalam pertumbuhan sel kanser menggunakan Charles River Laboratories. tikus bogel [73]. Kessler JD et al menunjukkan bahawa kanser yang bergantung kepada Myc memerlukan SUMOylation untuk tumorigenesis dengan melakukan xenograf sel kanser payudara menggunakan tikus Foxn1-nu bogel athymic betina Harlan Labs [74].

Satu lagi model tetikus yang biasa digunakan ialah tetikus CD-1 albino. Walaupun kedua-dua tikus C57BL/6 dan BALB/c adalah strain yang dibiak dalam untuk mewujudkan kehomogenan genetik, tikus CD-1 menonjol dalam kalangan tikus penyelidikan yang paling biasa digunakan sebagai stok luar (nota: tikus baka dirujuk sebagai strain, manakala tikus baka adalah dirujuk sebagai saham). Kebolehubahan genetik dalam model haiwan penyelidikan baka luar tersebut boleh menjadi kelebihan dalam pengklonan kedudukan lokus sifat kuantitatif dan pemilihan fenotip atau genotip bagi sifat tertentu. Walau bagaimanapun, penggunaan stok baka luar seperti CD-1, dalam bidang penyelidikan seperti toksikologi (ujian keselamatan dan keberkesanan), penuaan, dan onkologi telah dinilai secara kritikal dan mungkin tidak memberi manfaat dalam banyak kes [75]. Sebagai contoh, Luther A et al menjalankan kajian farmakokinetik, ketoksikan, in vivo keberkesanan antibiotik calon dalam tikus CD-1 [76].

Beberapa penerbitan menggunakan tikus CD-1, dari Charles River Laboratories [10, 77] atau Harlan [9]. Labonté B et al mengkaji peranan pengawalseliaan baru lncRAN MAALIN mengenai tingkah laku impulsif dan agresif dalam tikus CD-1 [77]. Patzke C et al memperoleh budaya hippocampal atau astrocyte primer daripada tikus jenis liar CD1 yang baru lahir dari Charles River Laboratories [78].

Tetikus CB17 SCID (SCID bermaksud kekurangan imun gabungan yang teruk) ialah strain albino dengan mutasi SCID spontan. Mutasi menghalang perkembangan dan kematangan kedua-dua sel T dan B. Walau bagaimanapun, tikus SCID mempunyai sel NK normal, makrofaj dan granulosit. Mereka berkongsi rupa yang sama seperti tikus biasa. Disebabkan oleh mutasi SCID, nisbah kejayaan pemindahan tumor manusia adalah sangat tinggi (malah lebih tinggi daripada tikus bogel), yang menjadikannya model haiwan kurang daya imun yang berharga untuk menguji rawatan kanser baharu, contohnya [11], dan sebagai perumah untuk manusia. tisu sistem imun.

Eaton JK et al menentukan sifat farmakokinetik

perencat protein GPX4, JKE-1674, dalam tikus SCID dari Janvier Laboratories [79].

Tetikus A/J ialah satu lagi model albino biasa, dengan ciri-ciri unik seperti distrofi otot progresif lewat dan hormon kortikal adrenal yang disebabkan oleh lelangit sumbing kongenital. Ia juga mempunyai insiden tinggi adenoma paru-paru spontan, yang boleh berkembang dengan mudah sebagai tindak balas kepada karsinogen.

Labome mengenal pasti 4 penerbitan menggunakan tikus A/J sebagai model haiwan (Jadual 1). Takeda K et al menggunakan tikus A/J dalam kajian mereka tentang peranan reseptor kematian 5 pengantara-apoptosis dalam penyakit hati kolestatik [80]. Tikus A/J digunakan oleh Losick VP et al untuk menyiasat peranan alel Naip5 hemidominan dalam imuniti [81], oleh Sanders CJ et al untuk menunjukkan peranan flagellin dalam imuniti adaptif [82], dan oleh Neunuebel MR et al untuk menyiasat modulasi SidD bagi de-AMPilasi Rab1 dalam L. pneumophila jangkitan [83].

Tikus ICR, juga strain albino, berasal dari Switzerland dan dipilih oleh Dr. Hauschka untuk mencipta garis tetikus yang subur. Stok baka ini dinamakan sempena Institut Penyelidikan Kanser di Amerika Syarikat [75, 84]. Tikus ICR dicirikan oleh sifat jinak, produktiviti tinggi, kadar pertumbuhan pesat dan insiden tumor spontan yang rendah [85]. Pembekal utama tikus ICR ialah Taconic dan Japan SLC. Tikus ICR ialah model tujuan umum, digunakan khususnya dalam toksikologi, neurobiologi, onkologi, epidemiologi, jangkitan, farmakologi, dan juga dalam ujian keselamatan produk. Nagamatsu G et al memperoleh ovari embrio dan baru lahir daripada tikus ICR untuk menyiasat dorman oosit tidak matang dalam folikel primordial [86]. Luther A et al menguji toleransi in vivo antibiotik calon dalam tikus ICR [76].

Strain tetikus lain seperti tikus FVB/N dari Charles River [23, 87], PWK/PhJ dari Jackson Laboratory [52], tikus bogel NMRI [88] dan tikus Swiss Webster (SW) [89, 90], juga digunakan dalam penyelidikan bioperubatan.

Tikus (dan tikus) yang ditakrifkan secara genetik dan diubah suai secara genetik digunakan secara meluas dalam penyelidikan untuk menyiasat fungsi gen tertentu, dan untuk berfungsi sebagai model eksperimen untuk penyakit manusia yang berbeza. Beribu-ribu strain sedemikian tersedia, dengan pelbagai perubahan gen, pemilihan strain, dan aplikasi yang berpotensi. Juga digunakan secara meluas adalah tikus dengan perubahan gen lain, seperti garis tetikus wartawan pendarfluor [91, 92].

Perbezaan wujud antara pelbagai model tetikus dan adalah penting untuk mengetahui variasi ini. Sebagai contoh, perbezaan tingkah laku antara strain/stok tikus adalah perkara biasa. Tikus C57BL/6 dan Swiss Webster mempunyai tahap keramahan yang berbeza [93] dan bertindak balas secara berbeza kepada kecederaan saraf tunjang yang teruk [94]. Dizocilpine maleate (MK-801) menunjukkan kesan pembezaan pada kecederaan neuron serebrokortikal dalam tikus C57BL/6J, NSA, dan ICR [95]. Perbezaan prestasi yang ketara antara dua stok albino keluaran tikus yang berkaitan, ICR dan CD1, diperhatikan dalam tugas kognitif. ICR mengalami kecacatan penglihatan yang teruk menjadikan stok ini sukar digunakan dalam labirin air Morris yang memerlukan persepsi visual yang baik. CD1 tidak mengalami gangguan penglihatan yang teruk tetapi, sama seperti ketegangan ICR, tikus CD1 mempamerkan penurunan pembekuan dalam semua fasa penyaman ketakutan yang bergantung kepada konteks [96]. Di samping itu, tikus ICR dari sumber yang berbeza mungkin menimbulkan hasil penyelidikan yang berbeza, malah bercanggah [97].

Satu lagi tikus, tikus (Rattus norvegicus), adalah model haiwan kedua yang paling banyak disebut digunakan dalam penyelidikan bioperubatan. Berbanding dengan tikus, tikus lebih besar, umumnya lebih agresif, dan lebih tahan terhadap pelbagai penyakit. Sprague-Dawley dan Wistar ialah dua model tikus yang paling kerap digunakan. Sama seperti kebanyakan model tetikus biasa, kedua-dua jenis tikus ini adalah albino. Sebaliknya, kedua-dua model tikus adalah stok baka luar manakala tikus yang paling biasa digunakan adalah strain baka.

Tikus Sprague-Dawley adalah strain albino hibrid dengan kepala sempit yang panjang. Ia mempunyai kadar pembiakan yang tinggi dan insiden tumor spontan yang rendah. Perangainya yang tenang dan pengendaliannya yang mudah merupakan ciri yang dialu-alukan oleh kedua-dua saintis dan juruteknik makmal haiwan. Kebanyakan penerbitan yang ditinjau Labome menggunakan tikus Sprague-Dawley sebagai model haiwan adalah dari Sungai Charles, sebagai contoh, [98].

Tikus Sprague-Dawley digunakan secara meluas dalam penyelidikan neurobiologi. Brigidi GS et al mengasingkan sel neuron hippocampal daripada tikus P0 Sprague-Dawley dari Sungai Charles [43].

Penyiasatan patologi adalah satu lagi kawasan yang sering digunakan tikus Sprague-Dawley. Lundby A et al menyuntik faktor pertumbuhan epidermis ke dalam tikus Sprague-Dawley dari Sungai Charles untuk mengkaji fosforilasi tirosin dalam paru-paru [99].

Tikus Wistar ialah satu lagi haiwan model albino hibrid biasa. Ia mempunyai penghormatan tersendiri untuk menjadi stok tikus pertama yang dibangunkan untuk berfungsi sebagai haiwan model. Substrain tikus Wistar: Tikus Wistar Hannover (Han/Wistart) dan Wistar Unilever (WU) adalah baka luar manakala Wistar Kyoto dan Wistar Furth adalah strain baka. Tikus Sprague-Dawley berasal daripada tikus Wistar.

MC Silva et al menyiasat penembusan CNS perencat kinase mTOR kompetitif ATP AZD2014 dalam tikus jantan Han Wistar yang dibeli dari Vital River [100]. Eaton JK et al mengasingkan hepatosit daripada tikus Han/Wistar untuk mencirikan sifat farmakokinetik perencat GPX4 [79]. Duncan A et al memperoleh tikus Wistar dari Charles River untuk mengkaji peranan habenular TCF7L2 dalam menghubungkan ketagihan nikotin kepada diabetes [15].

Makmal Jackson, yang diasaskan oleh Clarence Cook Little, yang menghasilkan strain tikus baka C57BL, antara lain, adalah pembekal haiwan murine eksperimen yang paling banyak disebut. Lebih daripada 11,000 jenis tikus boleh didapati dari Makmal The Jackson. Ia juga mengekalkan sumber maklumat tetikus bersepadu. Ia mengedarkan 3.0 juta tikus kepada lebih daripada 1900 institusi di 75 negara (laman web The Jackson Laboratory).

Makmal Jackson ialah sumber utama untuk strain tetikus biasa seperti C57BL, strain tetikus BALB/c, dan strain tikus, dan strain yang kurang biasa seperti FvB/NJ [101], dan 129 X1/SvJ [70].

Selain itu, banyak strain tetikus congenik dan transgenik juga datang dari Makmal Jackson, seperti hAPP-J20 [102], Nlrp3−/− dan Casp1−/− [103], tikus APP/PS1 [104], tikus NSG ( NOD-SCID-IL2R kekurangan rantai gamma [6, 105, 106], Rag1-/- [107], model sindrom Down Ts65Dn [108], pengesanan keturunan R26YFP [109], Rag2-/- [110], Xpc −/− dan Cd8−/− [23], Rosa26LSL-spCas9-eGFP (026175), ChAT-Cre (006410), ChATDW167 TRAP (030250), BAT-GAL (00531) dan ROSA-tdTom (0) [1791]4) , NSG-SGM3 tikus [66], garisan wartawan pendarfluor Rosa26 LSL-N1ICD-IRES-nEGFP, Rosa26LSL-ZsGreen (Ai6), Rosa26LSL-tdTomato (Ai9) [91], garisan tetikus wartawan Ai9 dan Ai96 [92], Apoe− /− tikus [111], TLR2−/−, mtCATtg, dan Duox2−/− tikus [112], Syt3 dan Syt6 knock-out dan Syt5 dan Syt10 knock-in quadruple sasaran mutasi tikus (nombor stok 008413) [47] .

Charles River telah menyediakan haiwan penyelidikan selama lebih daripada 70 tahun. Ia adalah pembekal kedua-dua model tetikus dan tikus, serta model mamalia lain. Ia merupakan pembekal penting untuk strain biasa seperti Rag1−/− [113], FVB [23], C57BL [47, 113], BALB/c [44, 113], dan strain lain seperti tikus Swiss-Webster [90], Tikus bogel NMRI [88]. Di samping itu, ia menyediakan kebanyakan CD-1 tikus dan stok tikus, contohnya, Sprague Dawley hamil bermasa [13], Long Evans [114] dan Wistar [15], antara penerbitan yang ditinjau.

Taconic Biosciences telah menyediakan tikus dan tikus yang ditentukan secara genetik selama 60 tahun. Sebagai tambahan kepada strain biasa seperti C57BL, Taconic menyediakan tikus Tg2576 [102], tikus LysMgfp/gfp [115], 129S6.Cg-Tg(APPSWE)2576Kha N20+ tikus [42], tikus Swiss Webster bebas kuman [116] dan Tikus Long Evans [16].

Kemudahan pembiakannya yang terkenal, ladang Sprague-Dawley di Madison, Wisconsin, di mana strain tikus senama, tikus Sprague Dawley, pada mulanya dibiakkan, kini menjadi sebahagian daripada Harlan. Harlan membekalkan Hsd tetikus bogel [117], Dark Agouti rat [118], C57BL tetikus [58], FVB tetikus [119], athymic bogel Foxn1-nu tetikus [74] dan SJL/J tetikus [120].

Pembekal lain termasuk agensi kerajaan seperti NCI Mouse Repository [121] dan RIKEN BioResource Research Center [3], organisasi seperti kemudahan haiwan DKFZ [88], UC Davis Mutant Mouse Resource & Research Centre [113, 122], Universiti Alabama di kemudahan haiwan Birmingham (UAB) [123], Pusat Kanser Frederick / Institut Kanser Kebangsaan, NIH [44, 123], dan pembekal komersial seperti Haiwan

Pusat Sumber [6], Makmal Janvier [79] (NOD-SCID [103] ), Envigo [63, 64, 124], Bekalan Makmal Shimizu Jepun [16] dan SLC [14, 86]. Syarikat seperti GenOway (manusia VISTA knockin tikus [113] ) juga boleh menjana haiwan transgenik atas permintaan.

IMSR ialah kerjasama sedozen repositori tetikus antarabangsa, yang mengandungi maklumat untuk 56,886 strain dan 231,033 talian sel EC setakat September 2019. Sebagai contoh, berikut ialah 130 strain untuk gen p53 tetikus. Laman web ini disokong oleh geran NIH.


Penerangan terperinci

Tikus heterozigot untuk mutasi spontan Akita (Ins2 Akita ) berdaya maju dan subur. Gejala pada tikus mutan heterozigot termasuk hiperglisemia, hipoinsulinemia, polidipsia, dan poliuria, bermula sekitar umur 3-4 minggu. Fenotip diabetes adalah lebih teruk dan progresif pada lelaki berbanding wanita. Obesiti atau insulitis tidak mengiringi diabetes.

Ekspresi mRNA glutathione S-transferase meningkat dalam sel epitelium dalam tubul proksimal mutan hiperglisemik (Fujita et al., 2001). Selain itu, kepekatan plasma valine, leucine, isoleucine, serta jumlah asid amino rantai bercabang, alanin, citrulline dan proline, adalah jauh lebih tinggi dalam tikus Akita (Mochida et al., 2011). Sfingosine-1-fosfat dinaikkan dan haiwan kencing manis menunjukkan pengurangan dalam paras plasma omega-9 24:1 (asid nervonik) yang mengandungi ceramide, sphingomyelin, dan cerebrosides. Pengurangan sphingolipid 24:1-esterfied juga diperhatikan dalam hati dan jantung (Fox et al., 2011).

Tikus tua mempamerkan gangguan gaya berjalan dan menurunkan halaju pengaliran saraf deria, tetapi tidak menunjukkan defisit pembelajaran atau ingatan (Choeiri C et al., 2005). Walau bagaimanapun, mereka menunjukkan hiperphagia dan tingkah laku kebimbangan (Asakawa et al., 2007).

Keabnormalan retina progresif bermula seawal 12 minggu selepas permulaan hiperglisemia. Komplikasi retina termasuk peningkatan kebolehtelapan vaskular, perubahan dalam morfologi astrosit dan mikroglia, peningkatan apoptosis dan penipisan lapisan dalam retina (Barber AJ, et al., 2005).

Purata jangka hayat tikus jantan yang menghidap diabetes pada latar belakang C57BL/NJcl (305 hari) adalah jauh lebih pendek daripada tikus jantan yang tidak menghidap diabetes dalam koloni lain daripada strain yang sama (690 hari). Kadar kematian tikus betina kencing manis dan bukan kencing manis bagi strain ini tidak berbeza dengan ketara. Pulau kecil dari Ins2 Akita tikus kehabisan sel beta dan yang tinggal mengeluarkan insulin matang yang sangat sedikit. Ini, dan penemuan bahawa tikus mutan bertindak balas terhadap insulin yang diberikan secara eksogen, menunjukkan bahawa Ins2 Akita tikus akan berfungsi sebagai pengganti yang sangat baik untuk tikus yang membuat diabetes bergantung kepada insulin dengan rawatan dengan alloxan atau streptozotocin. Heterozigot Ins2 Akita tikus juga sesuai dengan protokol pemindahan pulau kecil alogenik atau xenogeneik kerana penyiasat tidak perlu merawat tikus dengan diabetogen untuk mendorong keadaan hiperglisemik. Homozigot yang tidak dirawat jarang bertahan melebihi umur 12 minggu.

Data fenotip metabolik boleh didapati di laman web Konsortium Komplikasi Diabetik (DiaComp).


Bahan dan Kaedah

Ketegangan tikus

Tikus C57BL/6 telah dibeli dari Institut Kanser Kebangsaan atau Makmal Jackson dan digunakan pada usia 8� minggu. Tikus IFNγR-deficient (IFNγR-KO) dan iNOS-deficient (iNOS-KO) telah dibeli daripada Makmal Jackson. Tikus kekurangan TLR5 (TLR5-KO) dibiakkan di University of California Davis dari garis yang dibangunkan di makmal Akira (40) dan tikus ini tidak mengalami kecacatan keradangan atau metabolik basal (41). Semua tikus telah dijaga mengikut garis panduan Haiwan Universiti California Davis.

Strain bakteria dan jangkitan

Dilemahkan Salmonella typhimurium strain BRD509 (AroA − ) telah disediakan oleh Dr. D. Xu, (University of Glasgow, Glasgow, U.K) (42). Kekurangan flagellin S. typhimurium strain BC490 ialah hadiah daripada Dr. B. Cookson, (University of Washington, Seattle, WA) (31). LPS-kekurangan Salmonella typhimurium � ialah hadiah baik daripada Dr. R Curtiss (Universiti Negeri Arizona, Tempe, AZ). Salmonella telah dibiakkan semalaman dalam sup LB tanpa goncang dan dicairkan dalam PBS selepas anggaran kepekatan bakteria menggunakan spektrofotometer. Untuk eksperimen imunisasi, 5휐 5 BRD509 ditadbir secara intravena dalam urat ekor sisi. Tikus yang diimunisasi telah dicabar dengan 1000 jenis liar Salmonella typhimurium SL1344 secara intravena atau 1휐 6 SL1344 ditadbir secara lisan melalui gavage. Dos bakteria yang ditadbir telah disahkan dengan menyadurkan pencairan bersiri pada plat agar MacConkey mengira koloni selepas kultur semalaman pada 37ଌ. Tikus yang dijangkiti dipantau setiap hari dan tikus dimatikan jika mengalami keadaan hampir mati (tidak bertindak balas terhadap dorongan lembut). Untuk menilai kolonisasi bakteria, limpa dan hati daripada tikus yang dijangkiti telah dihomogenkan dalam PBS dan pencairan bersiri disalut pada plat agar MacConkey. Selepas pengeraman semalaman pada 37ଌ, plat bakteria dikira dan beban bakteria dikira untuk setiap organ individu.

Penjanaan protein rekombinan dan tulen

Salmonella antigen, SseB, telah diklon daripada Salmonella DNA genomik dan dimasukkan ke dalam vektor pRSET tag-Nya dan diekspresikan secara berlebihan E coli Sel DE3 BL21star (ThermoFisher Scientific). Untuk menghasilkan protein SseB yang mengekspresikan epitope 2W1S (EAWGALANWAVDSA) (SseB-2W), urutan 2W1S telah diklonkan dalam bingkai ke terminal C SseB dan dinyatakan dalam yang sama. E coli sistem ekspresi. Tambahan Salmonella antigen, CirA, IronN, dan SlyB juga diklon dan dinyatakan dalam E coli. Rekombinan E coli strain telah dikultur dalam sup Luria-Bertani (LB) dan dituai selepas 14 jam induksi IPTG 1mM. Pelet bakteria digantung semula dengan BugBuster (EMD Millipore) dan badan rangkuman digantung semula dengan penimbal Urea 8M. Protein rekombinan telah disucikan menggunakan ProBond (ThermoFisher Scientific) atau resin Ni-NTA His-Bind (EMD Millipore) mengikut protokol pengilang sebelum dialisis terhadap 1X PBS untuk menghilangkan kesan urea. Sampel kemudiannya dipekatkan menggunakan alat emparan Amicon (EMD Millipore) dan kepekatan protein ditentukan menggunakan kaedah BCA (ThermoFisher Scientific). Oleh kerana metodologi memerlukan penggunaan E coli LPS sebagai adjuvant untuk imunisasi, sisa LPS tidak dikeluarkan secara khusus daripada protein rekombinan sebelum digunakan.

Pemurnian flagellin

LPS-kekurangan Salmonella typhimurium � digunakan untuk membersihkan flagellin menggunakan protokol renjatan asid yang diubah suai (43, 44). Secara ringkas, kultur bakteria semalaman dipusing, dibasuh, dan digantung semula dalam HCl/PBS (pH2) selama 30 minit pada suhu bilik. Supernatan dikumpul dan flagellin dituai dengan ultrasentrifugasi dan pemendakan ammonium sulfat. Flagellin monomerik disediakan dengan menyahpolimerkan sampel pada suhu 70ଌ selama 1 jam dan LPS dikeluarkan menggunakan lajur detoks.

Imunisasi

LPS dibeli daripada Axxora, MPLA daripada Invivogen, Alum daripada ThermoFisher Scientific, dan bahan bantu lengkap dan tidak lengkap Freund daripada Sigma-Aldrich. Tikus telah diimunisasi melalui urat ekor sisi pada selang empat minggu dengan 100μg protein rekombinan (SseB atau SseB-2W1S) dan/atau 100μg flagellin tulen dicampur dengan 10μg LPS atau bahan pembantu lain. Dalam sesetengah eksperimen, tikus telah diimunisasi secara subkutan dengan SseB, flagellin, IronN, CirA atau SlyB digabungkan dengan CFA semasa imunisasi utama dan IFA semasa rangsangan, 4 minggu kemudian.

Antibodi ELISA

Tindak balas IgG2c terhadap imunisasi SseB diukur menggunakan kaedah ELISA. Secara ringkas, plat mikrotiter 96-telaga disalut dengan 10μg/ml SseB rekombinan dan sampel serum ditambah dalam pencairan bersiri dalam 10% FBS/PBS. Selepas pengeraman selama 2 jam pada suhu 37ଌ, plat dibasuh empat kali dengan 0.05% Tween 20/PBS sebelum penambahan Ab terkonjugasi biotin khusus untuk IgG2c anti-tikus (BD Bioscience). Selepas pengeraman selanjutnya selama 1 jam pada suhu 37ଌ, plat dibasuh enam kali dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37ଌ dengan streptavidin Ab (Extravidin, Sigma-Aldrich) terkonjugasi HRP dicairkan dalam 10% FBS/PBS. Plat kemudiannya dibasuh lapan kali dan substrat HRP (O-Phenylenediamine dihydrochloride, OPD, Sigma-Aldrich) digunakan untuk membangunkan plat. Selepas perubahan warna yang mencukupi diperhatikan, tindak balas dihentikan dengan menambah 50μl 2N H2JADI4 dan plat dianalisis menggunakan spektrofotometer (SpectraMax M2, Peranti Molekul).

Pewarnaan tetramer sel CD4 T khusus 2W1S

2W1S::I-A b tetramer terkonjugasi PE dijana dalam rumah daripada monomer 2W1S::I-A b yang dihasilkan dalam sel serangga, seperti yang diterangkan sebelum ini (45, 46). Limpa dan hati dituai dan diwarnai dengan PE-konjugasi 2W1S::I-A b tetramer dengan kehadiran blok Fc (supernatan kultur daripada hibridoma 2.4G2, 2% serum tikus, 2% serum tikus) suhu bilik selama satu jam. Selepas mencuci dengan 2% FBS / PBS, sel telah diwarnai dengan antibodi konjugasi fluorochrome khusus untuk CD3, CD4, CD8, dan CD44 (Affymetrix). Sel kemudiannya dianalisis oleh sitometri aliran menggunakan BD LSR Fortessa (BD Biosciences). Semua set data dianalisis menggunakan perisian FlowJo (Bintang pokok).

Eksperimen parabiosis

Tikus telah diimunisasi dan dirangsang dengan SseB dan flagellin bercampur dengan MPLA, dan 60 hari kemudian tikus disambungkan melalui pembedahan untuk menjana peredaran bersama. Parabionts ditempatkan bersama selama 28 hari, membolehkan pembentukan anastomosis dan pemindahan limfosit vaskularisasi yang mencukupi antara haiwan. Tikus kemudian diasingkan dan dibenarkan 2 minggu untuk pulih daripada pembedahan pemisahan. Selepas pemulihan, tikus dicabar dengan 1000 virulen Salmonella (SL1344) secara intravena dan 5 hari kemudian semua kumpulan tikus telah dimatikan dan beban bakteria diukur dalam tisu, seperti yang diterangkan di atas.

Analisis Statistik

Perbezaan statistik antara kumpulan data taburan normal telah diperiksa menggunakan Prism (GraphPad). Kumpulan eksperimen dibandingkan menggunakan tidak berpasangan t ujian dan dianggap berbeza secara signifikan dengan a hlm nilai π.05.


Keputusan

Penyusunan semula limfosit neonatal memulihkan aktiviti lokomotor dalam OFT pada tikus remaja

Pada PND 35 tikus dinilai dalam OFT.Aktiviti lokomotor mendatar, seperti yang ditentukan oleh jumlah jarak yang dilalui dalam arena, dikurangkan dengan ketara dalam Rag2 −/− tikus berbanding tikus Recon dan WT, yang tidak menunjukkan perbezaan dalam pergerakan [F(2, 18) = 10.48, hlm = 0.001] (Rajah 1B). Perbezaan tingkah laku ini adalah konsisten sepanjang ujian, dan semua kumpulan tikus menunjukkan pelaziman yang sama ke arena [Masa: F(5, 90) = 3.99, hlm = 0.003 Status imun: F(2, 18) = 10.43, hlm = 0.001 interaksi n.s.] (Rajah 1C). Tiada perbezaan statistik di kalangan kumpulan ditemui untuk jumlah masa di tengah arena (p = 0.16), ukuran kebimbangan (Rajah 1D), atau dalam perubahan masa tengah sepanjang ujian [Masa: F(5, 90) = 4.525 hlm = 0.001 status imun dan interaksi: n.s.] (Rajah 1E). Penemuan ini mencadangkan bahawa semasa penyusunan semula Rag2 −/− tikus dengan limfosit adalah mencukupi untuk menyelamatkan defisit lokomotor dalam OFT, tidak ada kesan ke atas tingkah laku seperti kebimbangan remaja dalam ujian ini.

Penyusunan semula limfosit neonatal menyelamatkan defisit dalam pergaulan semasa remaja

Satu hari selepas OFT, tikus dinilai dalam ujian interaksi sosial. Rag2 −/− tikus menunjukkan kemerosotan dalam pergaulan, yang tidak terdapat dalam tikus Recon (Rajah 2). secara keseluruhan, Rag2 −/− tikus menghabiskan lebih sedikit masa berhampiran tetikus tertentu berbanding tikus WT dan Recon [F(2, 18) = 13.73, hlm < 0.001 Rajah 2A ] dan mempunyai purata skor interaksi sosial yang lebih rendah secara statistik (nisbah masa dalam arena sosial kepada arena bukan sosial) daripada tikus WT [F(2, 28) = 7.71, hlm = 0.004 Rajah 2B], manakala tikus Recon tidak berbeza dengan ketara daripada mana-mana kumpulan. Tiada perbezaan dikesan dalam jumlah aktiviti dalam ruang interaksi sosial (hlm = 0.35) (Rajah 2C) menunjukkan bahawa kesan penyusunan semula limfosit neonatal dalam kalangan remaja Rag2 −/− tikus adalah khusus untuk tingkah laku sosial dan tidak bergantung kepada aktiviti lokomotor.

Penyusunan semula limfosit neonatal meningkatkan keutamaan sukrosa semasa remaja

Dua hari selepas ujian SI, tikus menjalani ujian keutamaan sukrosa. Tikus recon menunjukkan peningkatan dalam keutamaan sukrosa berbanding dengan Rag2 −/− dan tikus WT [F(2, 19) = 10.31, p = 0.001] (Rajah 3A) tanpa perbezaan yang ketara antara kumpulan dalam jumlah penggunaan cecair (p = 0.38 Rajah 3B) atau diselaraskan untuk berat badan individu (p = 0.69 Rajah 3C).

A) Keutamaan untuk penggunaan sukrosa sepanjang ujian 2 hari yang dikira berkenaan dengan jumlah isipadu pengambilan cecair. Jumlah isipadu cecair (ml) (B) dan jumlah isipadu cecair yang digunakan bagi setiap gram berat badan (C) tidak menunjukkan perbezaan yang ketara antara kumpulan. ANOVA dengan ujian post hoc Tukey untuk semua analisis. WT: n = 6, Rag2 −/− : n = 8, Recon: n = 8. * p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001.

Penyusunan semula limfosit neonatal menyelamatkan kecacatan dalam pembelajaran spatial semasa dewasa

Pembelajaran dan ingatan spatial dinilai dalam MWM apabila tikus mencapai umur 12 minggu. Tiada perbezaan dalam ketajaman penglihatan atau pembelajaran diperhatikan apabila tikus dipersembahkan dengan platform yang boleh dilihat dengan tanda bendera, dengan semua tikus menunjukkan penurunan kependaman untuk mencari platform semasa ujian berlangsung [Masa: F(3, 39) = 16.22, p < 0.0001, status imun dan interaksi: n.s.] (Rajah 4A). Analisis post hoc Tukey semasa percubaan platform yang boleh dilihat menunjukkan perbezaan yang ketara antara percubaan 1 (53.54 ± 2.99 s) dan percubaan 2 (35.61 ± 1.33 s hlm = 0.003), percubaan 3 (32.13 ± 4.90 s, hlm = 0.0004) dan percubaan 4 (20.04 ± 4.58 s, hlm < 0.0001). Selain itu, semua kumpulan menunjukkan prestasi yang setanding semasa pembelajaran pemerolehan isyarat, dengan platform tersembunyi [Masa: F(4, 52) = 4.53, hlm = 0.003, status imun dan interaksi: n.s.] (Rajah 4B). Walaupun tiada satu kumpulan berprestasi lebih baik daripada yang lain, analisis post hoc menunjukkan bahawa terdapat pengurangan ketara dalam kependaman melarikan diri dari Hari 1 (42.47 ± 4.64 s) kepada Hari 5 (28.26 ± 3.03 s, hlm = 0.006). Walau bagaimanapun, Rag2 −/− tikus menunjukkan kemerosotan dalam ingatan ingatan semasa percubaan siasatan sehari selepas tamat latihan pemerolehan (Rajah 4C𠄾). Tikus Recon mempunyai bilangan lintasan yang jauh lebih besar di atas platform yang dialih keluar berbanding dengan Rag2 −/− tikus [F(2, 10) = 7.114, hlm = 0.012], walaupun jumlah masa yang dibelanjakan dalam kuadran sasaran tidak berbeza secara statistik. Selain itu, tiada perbezaan dalam jumlah jarak yang dilalui (hlm = 0.752) telah dikesan semasa percubaan siasatan. Akhirnya, tikus Recon memaparkan kependaman melarikan diri yang lebih pendek dalam tugas pembalikan berbanding dengan Rag2 −/− tikus [Status imun: F(2, 24) = 4.15, hlm = 0.028, Masa: dan interaksi: n.s.] (Rajah 4F dan G). Keputusan ini menunjukkan bahawa menyusun semula limfosit dalam Rag2 −/− neonat adalah mencukupi untuk menyelamatkan defisit dalam MWM sebagai orang dewasa.

A) Prestasi dengan platform yang boleh dilihat dan ditanda pada ujian Hari 1 (Masa: p < 0.0001, status imun dan interaksi: ns) dan B) platform tersembunyi semasa latihan pemerolehan isyarat selama 5 hari (Masa: p = 0.003, imuniti status dan interaksi: ns) menunjukkan hasil yang serupa untuk WT, Rag2 −/− dan tikus Recon. RM ANOVA 2 hala. C) Bilangan lintasan di atas kawasan platform yang dibuang semasa percubaan siasatan, hlm = 0.012. ANOVA, Tukey post hoc. D) Tiada perbezaan dikesan dalam jarak perjalanan semasa percubaan probe. E) Pengesanan wakil bagi percubaan siasatan. Anak panah menandakan bulatan kecil kuadran sasaran menunjukkan di mana platform telah diletakkan sebelum ini. F) Purata kependaman melarikan diri semasa ujian tugasan pembalikan (platform tersembunyi dialihkan ke kuadran bertentangan) selama dua hari (4 percubaan/hari). Status imun: hlm = 0.028, masa dan interaksi: n.s. RM ANOVA 2 hala, Tukey post hoc. G) Pengesanan perwakilan laluan renang semasa Hari 2 ujian pembalikan. Anak panah menunjuk ke kuadran sasaran bulatan kecil menandakan penempatan platform. WT: n = 6, Rag2 −/− : n = 5, Recon: n = 5. * p≤ 0.05, ** p ≤ 0.01.

Otak selepas bersalin menyokong kolonisasi sel T

Penjajahan dan penyetempatan sel GFP + di dalam otak telah dikaji oleh mikroskop pendarfluor. Kedua-dua haiwan yang diperiksa pada usia dua minggu mempunyai sel GFP + yang sangat sedikit yang dikesan secara sporadis dalam ruang meningeal beberapa bahagian merentasi paksi rostrocaudal dari mentol olfaktori ke hujung cerebellum (data tidak ditunjukkan). Empat minggu selepas penyusunan semula banyak sel GFP + ditemui di seluruh otak mengikut corak pengedaran yang sama yang diterangkan sebelum ini pada tikus dewasa (Lagu et al., 2016). Limfosit didapati secara konsisten dalam organ circumventricular (CVOs) (Rajah 5 A𠄿) dan plexus choroid (ChP). Sama seperti penyusunan semula dewasa, mereka juga terletak di parenchyma otak dalam kedua-dua bahan kelabu dan putih tanpa corak anatomi yang konsisten merentas tikus individu. Kumpulan sel secara konsisten ditemui dalam struktur jirim putih termasuk fimbria hippocampus, corpus callosum, kapsul dalaman dan striatum (Rajah 5) seperti yang diterangkan sebelum ini (Lagu et al., 2016). Dalam jirim kelabu, sel-sel bertaburan disetempat di kawasan berbeza pembentukan hippocampal, korteks serebrum dan hipotalamus (data tidak ditunjukkan). Taburan yang sama ditemui pada tikus yang diperiksa pada 8 dan 12 minggu selepas penyusunan semula (Rajah 6 A𠄼). Kuantifikasi jumlah bilangan sel setiap bahagian menunjukkan tiada perbezaan antara 4 dan 8 minggu selepas penyusunan semula (21.5 ± 3 dan 18.5 ± 2.7 masing-masing p = 0.54 n.s) menunjukkan bahawa bilangan sel kekal stabil pada titik masa ini. Dalam bahagian mendatar (12 minggu), banyak sel GFP + ditemui dalam parenkim mentol olfaktori seperti yang diterangkan (Lagu et al., 2016), tetapi juga dalam aliran migrasi rostral (Rajah 6 D–I). Dalam RMS, sel GFP + dikesan di lokasi berbeza dalam struktur ini (Rajah 6 D–I). Data ini mengesahkan kajian terdahulu kami dan menunjukkan bahawa penyusunan semula neonatal dengan sel limfoid mengakibatkan penjajahan otak remaja berikutan corak pengembangan temporal yang sama (4 minggu) seperti pada otak limfopenik dewasa.

Imej mikroskop pendarfluor bahagian otak koronal remaja Rag2 −/− tikus yang baru lahir disusun semula dengan GFP + sel limfoid. Panel A dan C menunjukkan struktur jirim putih yang dilabelkan dengan FluoroMyelin Red (pembesaran 100X). Pembesaran lebih tinggi (200X) bagi kawasan yang digariskan digabungkan dengan saluran hijau dalam Panel B dan D untuk menunjukkan penyetempatan sel GFP + dalam jirim putih dan organ circumventrikular (anak panah). Koordinat Bregma sepadan dengan atlas tetikus dewasa dari Franklin dan Paxinos, ed Ketiga. 2007. CPu: putamen caudate, fi: fimbria of the hippocampus, GP: globus pallidus, ic: kapsul dalaman, LV: lateral ventricle, SFO: organ subfornikal, sm: stria medullaris thalamus, vhc: ventral hippocampal commissure. Bar skala dalam A, C: 400 μm, B, D: 200 μm.

Bahagian sel T periferal dalam tikus Rag2 dewasa −/− dibentuk semula sebagai neonat

Pengenalpastian fenotip sel T dari keseluruhan populasi limfosit dilakukan dalam sel dari LN tikus WT dan Recon pada selesai ujian tingkah laku. Gating dan persempadanan populasi dilakukan secara serentak untuk tikus WT dan Recon. Sama seperti kajian terdahulu kami dalam haiwan dewasa, nisbah CD4 / CD8 dalam WT adalah kira-kira 1: 1, manakala tikus Recon mempunyai nisbah yang lebih besar (

4:1 Rajah 7). Bias CD4 dalam neonatal disusun semula Rag2 −/− tikus adalah konsisten dengan kajian terdahulu kami pada orang dewasa dan mungkin mengambil kira keputusan tingkah laku dalam eksperimen sekarang (Song et al., 2016). Walau bagaimanapun, komposisi sel limfoid penderma tidak ditentukan dalam kajian ini dan mungkin telah mempengaruhi perkadaran ini.

Plot ketumpatan sitometri aliran perwakilan sel limfoid yang diasingkan daripada jenis liar C57BL/6 dan Recon Rag2 −/− tikus pada akhir eksperimen tingkah laku. Seperti yang dijangkakan, tikus jenis liar adalah negatif untuk sel GFP + dan mempunyai nisbah 1:1 bagi sel CD4/CD8 CD3 + T. Sebaliknya, nisbah sel T CD4/CD8 berfungsi dalam tikus Recon (CD3 + /GFP + ) ialah ≥ 4:1 (lihat bahagian keputusan).


Keputusan

USP44 ialah sebahagian daripada kompleks FOXP3 dan lebih disukai dinyatakan oleh Tregs antara subset sel CD4 + T

FOXP3 telah dilaporkan berinteraksi dengan beberapa faktor yang termasuk enzim pengubahsuaian epigenetik dan pengawal selia bersama transkrip (Hori, 2012). Dalam kajian terdahulu, kami menggunakan pendekatan penulenan pertalian tandem untuk mencirikan molekul yang mampu berinteraksi dengan FOXP3 (Chen et al, 2013 Gao et al, 2015). Dalam pendekatan ini, sel Jurkat T yang secara stabil menyatakan FOXP3 yang diberi tag HA telah dilepaskan, dan imunopresipitasi anti-HA dibenarkan untuk pemulihan molekul FOXP3 dengan faktor yang berkaitan (kompleks FOXP3). Analisis spektrometri jisim peptida yang dikaitkan dengan FOXP3 membawa kepada pengenalpastian beberapa pendamping dan faktor bersama (Gao et al, 2015). Di samping itu, polipeptida kepunyaan jujukan DUB yang diketahui dipanggil USP44 juga terdapat pada tahap rendah tetapi boleh dikesan dalam kompleks FOXP3 pulih.

Walaupun protease khusus ubiquitin ini diketahui penting dalam kitaran sel dan biologi tumor (Sargin et al, 2007), tiada peranan sedemikian untuk USP44 dalam Tregs atau peraturan imun telah ditemui. Mencadangkan bahawa peranan sedemikian untuk DUB ini sememangnya wujud, paras mRNA dan protein USP44 didapati meningkat dengan ketara dalam kedua-dua Treg murine yang baru diasingkan daripada tisu limfoid (nTreg) dan subset iTregs berbanding sel CD4 + T naif. iTregs juga memaparkan lebih banyak transkrip USP44 dengan ketara berbanding yang lain secara in vitro subset sel CD4 + T effector dibezakan yang kami hasilkan (iaitu, sel Th1, Th2, dan Th17) (Rajah 1A). Keputusan yang sama diperoleh apabila meninjau tahap mRNA USP44 dalam sel T kesan CD4 + manusia yang dibezakan secara in vitro dan disahkan dengan mengukur ekspresi faktor transkripsi kanonik (Rajah EV1A). Walaupun nTregs menyatakan tahap mRNA dan protein USP44 yang lebih tinggi daripada rakan bukan Treg mereka, secara in vitro iTreg yang dihasilkan secara konsisten menunjukkan ekspresi USP44 yang lebih besar (Rajah 1A).

Rajah 1. USP44 lebih disukai dinyatakan dalam subset Treg

  1. (Atas) Tahap transkrip USP44 merentas populasi sel CD4 + T. Penggantungan nodus limfa dan sel limpa bagi tikus betina C57BL/6 betina berumur 6 hingga 8 minggu (n = 5 eksperimen) telah diperolehi, dan naif (CD62L tinggi /CD25 −) sel CD4 + T dan nTregs (CD4 + /CD25 tinggi ) diperolehi oleh FACS. Populasi sel T effector yang ditunjukkan dijana dengan mengaktifkan 1 × 10 6 prekursor CD4 + T naif dengan antibodi anti-CD3 dan anti-CD28 (masing-masing 1 dan 4 μg/ml) selama 4 hari di bawah yang ditunjukkan. secara in vitro keadaan condong (diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah). Selepas menuai RNA oleh reagen TRIzol dan menghasilkan cDNA, tahap mRNA Usp44 yang dinyatakan oleh Teff dan iTreg yang terhasil, serta sel nTreg yang baru diasingkan, ditentukan oleh qRT-PCR. (Bawah) Penggantungan nodus limfa dan sel limpa tikus C57BL/6 betina berumur 6 hingga 8 minggu telah diperolehi dan naif (CD62L tinggi CD25 − ) sel CD4 + T dan nTregs (CD4 + /CD25 tinggi ) telah disusun. oleh FACS. iTregs dihasilkan dengan mengaktifkan 1 × 10 6 sel CD4 + T naif dengan antibodi anti-CD3 dan anti-CD28 (masing-masing 1 dan 4 μg/ml) selama 4 hari dengan kehadiran IL-2 (100 μg/ml) dan TGF-β (5 ng/ml) sebelum sel dituai untuk SDS-PAGE.
  2. Sel CD4 + T murine naif diperoleh dan dibezakan ke dalam keturunan iTreg seperti dalam A. Tahap ekspresi Usp44 dan Foxp3 mRNA dinilai setiap hari dari semasa ke semasa oleh qRT-PCR.
  3. Ekspresi protein USP44 dan FOXP3 oleh sel T semasa secara in vitro pembezaan juga diukur. Selepas 1-4 hari iTreg condong, lisat sel telah diselesaikan oleh SDS-PAGE diikuti dengan immunoblotting dengan antibodi yang ditunjukkan.
  4. Murine iTregs dihasilkan secara in vitro seperti di atas telah diaktifkan dengan kehadiran rekombinan TNFα, IL-6, atau IL-1β (masing-masing pada kepekatan 10 ng/ml), atau LPS (1 μg/ml) selama 24 jam. Treg yang dirawat kemudiannya dituai, dan tahap protein USP44 ditentukan seperti di atas.

Data sumber tersedia dalam talian untuk angka ini.

Rajah EV1. USP44 dikawal selia dalam Treg dan sebahagian besarnya dijejaki dengan ketinggian progresif tahap transkrip yang berkaitan dengan Treg

  1. Sel CD4 + T naif telah diasingkan daripada darah periferi penderma yang sihat (n = 2–3/eksperimen) dan dibezakan ke dalam keturunan pembantu T yang ditunjukkan melalui pengaktifan (antibodi anti-CD3/anti-CD28 1 dan 4 μg/ml, masing-masing) dengan kehadiran reagen senget tertentu (diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah ). Sel-sel dituai selepas 4 hari, dan mRNA telah diasingkan untuk analisis qRT-PCR mesej USP44 dan faktor transkripsi penentu keturunan utama.
  2. iTregs dijana oleh secara in vitro condong seperti di atas, dan sel telah dituai pada titik masa yang berbeza. Sitometri aliran mengesahkan peraturan naik progresif FOXP3 di bawah keadaan pencongan iTreg, dan graf bar dipaparkan.
  3. Analisis qRT-PCR mendedahkan tahap transkrip pengekodan FOXP3, USP44, IL-2, CD25, CTLA-4 dan GITR dalam iTregs.

Juga menghubungkan ungkapan USP44 kepada proses pembezaan Treg adalah pemerhatian bahawa mesej USP44 dan tahap protein meningkat secara progresif dalam sel CD4 + T naif murine sepanjang mereka. secara in vitro induksi daripada Foxp3 dan komitmen kepada keturunan iTreg (Rajah 1B dan C, dan EV1B). Peraturan naik ini sebahagian besarnya dikesan dengan ketinggian progresif tahap transkrip yang berkaitan dengan Treg (termasuk FOXP3, CD25, CTLA4, dan GITR) dan pembungkaman ekspresi IL-2 (Rajah EV1C), profil ekspresi gen tipikal Treg.

Ekspresi USP44 dikawal selia oleh TGF-β semasa pembezaan Treg

Setelah memerhatikan ungkapan USP44 keutamaan oleh Tregs dan pengawalseliaan teguh DUB ini semasa penjanaan iTregs (Rajah 1A-C), kami membuat hipotesis bahawa USP44 memainkan peranan penting dalam mempromosikan ekspresi FOXP3 dalam sel-sel ini. Pemacu kritikal pengawalseliaan FOXP3 dalam sel CD4 + T naif ialah sitokin TGF-β. Isyarat hiliran reseptor TGF-β mendorong fosforilasi dan pengaktifan faktor SMAD2/3 yang mengaktifkan ekspresi gen yang berkaitan dengan Treg, termasuk FOXP3 (Zheng et al, 2010 Schlenner et al, 2012). Sitokin ini juga memainkan peranan penting dalam mengekalkan fungsi penindasan Treg yang telah ditetapkan (Marie et al, 2005 Tran, 2012 ), begitu juga dengan pencetus lain aktiviti SMAD (Ni et al, 2018). Mengesyaki bahawa USP44 mungkin dikawal selia dalam sel T oleh TGF-β, kami memeriksa promoter gen USP44 tetikus / manusia menggunakan perisian analisis R-vista. Sesungguhnya, satu tapak pengikat SMAD yang terpelihara ditemui di kawasan proksimal kedua-dua tetikus dan manusia Usp44 promoter (Rajah EV2A dan B).

Rajah EV2. Ekspresi USP44 diinduksi oleh TGFβ di bawah keadaan pembezaan Treg

  • A, B. Urutan promoter USP44 diwakili dengan tapak pengikat SMADnya yang ditunjukkan. Kesan kehilangan tapak pengikat SMAD2/3 didapati dengan membuat mutasi yang digambarkan dalam (B).
  • C. Sel Jurkat T telah ditransfeksi dengan wartawan luciferase kunang-kunang dipacu promoter USP44 secara elektroporasi. Sel telah dirangsang dengan PMA dan ionomycin dengan kehadiran atau ketiadaan TGF-β (2 ng/ml) atau anti-TGF-β (10 μg/ml) selama 8 jam sebelum dituai untuk pengukuran aktiviti luciferase, yang telah dinormalisasi kepada Aktiviti Renilla luciferase.
  • Sel D. Jurkat T telah ditransfeksi dengan wartawan luciferase kunang-kunang dipacu promoter USP44 secara elektroporasi. Sel telah dirangsang dengan PMA dan ionomycin dengan kehadiran atau ketiadaan TGF-β (2 ng/ml) selama 8 jam sebelum dituai untuk pengukuran aktiviti luciferase, yang telah dinormalisasikan kepada aktiviti Renilla luciferase.
  • E. Analisis CHIP bagi penghunian SMAD bagi Usp44 promoter. Sel T naif telah diasingkan daripada tikus C57BL/6 dan terpolarisasi kepada iTreg sebelum penuaian dan lisis. Faktor SMAD2 dan SMAD3 telah diimunisasi, dan PCR digunakan untuk mengesan pengikatan kepada Usp44 urutan promoter.
  • F. Sel T naif terpencil FACS terdedah kepada rangsangan yang ditunjukkan semasa ex vivo budaya dan dituai pada titik masa yang berbeza untuk pengasingan mRNA dan pengukuran ekspresi USP44 oleh analisis qRT-PCR.
  • G. Sel CD4 + T naif telah diasingkan daripada tikus jenis liar (Smad2 +/+ Smad3 +/+ ) serta tikus yang tidak mempunyai SMAD2 (Smad2 −/− Smad3 +/+ ), SMAD3 (Smad2 +/+ Smad3 −/ − ), atau kedua-dua SMAD2 dan SMAD3 (Smad2/3 −/− ), semuanya pada latar belakang C57BL/6 (n = 3/kumpulan/eksperimen). Sel telah diaktifkan di bawah secara in vitro Keadaan yang mendorong Treg (anti-CD3/CD28, 1 dan 4 μg/ml, masing-masing) dengan kehadiran IL-2 (100 U/ml) dan TGF-β (5 ng/ml) selama 4 hari. Kemudian, RNA diekstrak, dan cDNA disediakan untuk menilai tahap ekspresi USP44 dalam sel-sel ini oleh qRT-PCR.

Berdasarkan ini, kami mengklonkan wilayah +17-(-314) tetikus Usp44 promoter, yang termasuk tapak mengikat SMAD, untuk menjana a Usp44 konstruk wartawan luciferase yang didorong oleh promoter. Pengenalan wartawan ini ke dalam barisan sel Jurkat T membolehkan kami mengesahkan bahawa TGF-β boleh membawa peraturan naik USP44. Pengaktifan dengan PMA dan ionomycin dapat mendorong aktiviti wartawan ke tahap tertentu dalam sel-sel ini. Walau bagaimanapun, rawatan dengan 2 ng/ml TGF-β menghasilkan peningkatan ketara dalam isyarat luciferase pada titik masa yang sepadan dengan pengaktifan SMAD2/3 puncak. Menariknya, ablating isyarat TGF-β dalam sistem ini dengan antibodi yang meneutralkan sitokin mengurangkan ekspresi USP44 dalam sel yang dirangsang dengan PMA/Iono tanpa TGF-β eksogen (Rajah EV2C), menunjukkan bahawa aktiviti USP44 yang diinduksi boleh ditambah dengan jumlah surih TGF- β dalam media kultur pelengkap serum (RPMI) yang digunakan dalam eksperimen ini. Ia juga mungkin bahawa pengaktifan boleh menjadikan sel lebih mudah menerima isyarat TGF-β (iaitu, melalui pengawalan atas reseptor permukaan). Telah dilaporkan bahawa lata kinase protein diaktifkan mitogen (MAP) yang dicetuskan oleh isyarat reseptor sel T boleh membawa kepada Smad2 terfosforilasi (Mamura, 2000 #204). Yang penting, apabila tapak pengikatan SMAD dalam promoter USP44 konstruk kami telah bermutasi, aktiviti wartawan telah ditindas dengan teruk, walaupun dengan adanya rangsangan dan TGF-β (Rajah EV2D). Mengukuhkan penemuan ujian ini, ujian ChIP mendedahkan penghunian SMAD di penganjur Usp44 gen murine iTregs (Rajah EV2E), seterusnya melibatkan TGF-β sebagai pemacu ekspresi USP44.

Kami juga meneliti beberapa rangsangan yang menyumbang kepada keadaan yang mendorong Treg untuk keupayaan untuk memacu induksi USP44. Secara khusus, kami menilai kesan rangsangan TCR, kostimulasi, isyarat IL-2, dan TGF-β secara berasingan pada ekspresi USP44 dalam sel CD4 + T naif. Walaupun pengaktifan sahaja menyebabkan pengawalseliaan sederhana USP44 mRNA, penambahan IL-2 tidak mempunyai kesan yang sedikit. Kami mendapati bahawa pendedahan kepada TGF-β bertanggungjawab terutamanya untuk mendorong tahap USP44 yang teguh dalam membangunkan iTregs (Rajah EV2F). Penemuan ini sangat mencadangkan bahawa ekspresi USP44 dalam Tregs sebahagian besarnya didorong oleh isyarat TGF-β / SMAD. Selaras dengan mekanisme sedemikian untuk induksi USP44 dalam Tregs, dan penemuan yang diperolehi dalam sistem wartawan kami, sel T daripada tikus yang kekurangan genetik secara genetik dalam SMAD2 dan SMAD3 gagal untuk mengawal selia USP44 di bawah keadaan condong iTreg, dan kekurangan SMAD juga memansuhkan peningkatan USP44- peraturan oleh iTregs (Rajah EV2G).

Kami juga meneroka kesan isyarat pro-radang pada tahap USP44. Di sini, iTreg terpencil telah diaktifkan dengan kehadiran LPS agonis reseptor seperti tol atau sitokin yang mendorong keradangan IL-1β, IL-6, dan TNFα-rangsangan yang sebelum ini didapati menjejaskan tahap protein FOXP3 (Chen et al, 2013 van Loosdregt et al, 2013 Gao et al, 2015). Menariknya, pendedahan kepada sama ada isyarat keradangan telah mengurangkan tahap protein USP44 dengan ketara, sepadan dengan peraturan turun FOXP3 (Rajah 1D). Keputusan ini menyelaraskan lagi ekspresi USP44 dengan peraturan tahap protein FOXP3 dalam Tregs.

USP44 berinteraksi dengan FOXP3

Kajian terdahulu membabitkan USP44 sebagai komponen kompleks FOXP3. Di sini, persatuan fizikal antara USP44 dan FOXP3 telah disahkan oleh co-immunoprecipitation timbal balik. Untuk tujuan ini, sel HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan binaan berlabel MYC FOXP3 dan USP44 bertanda FLAG. Empat puluh lapan jam selepas pemindahan, sel-sel telah dituai dan dilisiskan, dan sama ada FOXP3 atau USP44 telah diimunopresipitasi daripada lisat sel bersama-sama dengan rakan-rakan berinteraksi mereka, seperti yang divisualisasikan oleh immunoblotting (Rajah 2A). Pemetaan mutagenesis seterusnya mencirikan interaksi. Ungkapan bersama USP44 berteg HA dengan pelbagai mutan FOXP3 bertanda Bendera dalam sel HEK 293T mendedahkan bahawa DUB ini boleh menurunkan FOXP3 jenis liar serta mutan pemadaman FOXP3 yang tidak mempunyai jari zink dan domain zip leucine (ΔZ+L) atau domain gegelung bergelung (ΔCC) tetapi tidak satu pun yang tidak mempunyai rantau kaya prolin (ΔP) (Rajah EV3A).

Rajah 2. USP44 berinteraksi dengan FOXP3

  1. Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan binaan ekspresi pengekodan MYC-FOXP3 dan FLAG-USP44 menggunakan polyethylenimine. 48 jam selepas pemindahan, sel telah dituai dan dilisiskan, dan manik bersalut antibodi anti-FLAG atau anti-MYC digunakan untuk mengimunopresipitasi protein berlabel yang diberikan bersama-sama dengan pasangan pengikatnya. Protein co-imunoprecipitated tertakluk kepada SDS-PAGE diikuti oleh analisis imunoblot. Antibodi yang mengiktiraf tag FLAG atau MYC telah digunakan untuk menyiasat untuk USP44 dan FOXP3, masing-masing.
  2. Co-IP endogen USP44 dan FOXP3 dalam iTregs murine. iTregs dijana seperti dalam Rajah 1 daripada sel CD4 + T naif FACS yang diasingkan daripada penggantungan terkumpul nodus limfa dan sel limpa tikus C57BL/6 jenis liar (n = 2–3/eksperimen). iTregs telah dilisekan dan protein utama telah diimunopresipitasi menggunakan sama ada antibodi anti-USP44 (panel kanan) atau anti-FOXP3 (panel kiri). Protein yang ditarik ke bawah dalam eksperimen ini kemudiannya diselesaikan dan dianalisis oleh imunoblot menggunakan antibodi anti-FOXP3 atau anti-USP44.
  3. Co-IP endogen USP44 dan FOXP3 dalam nTregs murine. nTregs (CD4 + CD25 tinggi) yang diasingkan oleh FACS telah diaktifkan oleh anti-CD3 dan anti-CD28 (masing-masing 1 dan 4 μg/ml) semalaman dengan kehadiran IL-2 (100 U/ml). Sel-sel telah dilisiskan dan protein telah diimunopresipitasi menggunakan sama ada anti-Foxp3 (panel kiri) atau anti-Usp44 (panel kanan). Protein yang ditarik ke bawah dalam eksperimen ini kemudiannya diselesaikan dan dikenal pasti dengan antibodi yang ditunjukkan.
  4. Sel CD4 + T murine naif telah diasingkan oleh FACS daripada nodus limfa dan penggantungan sel limpa USP44 fl/fl CD4Cre + tikus dan rakan sampah jenis liar mereka (USP44 fl/fl CD4Cre- mencit n = 2–3/kumpulan/eksperimen). Sel-sel iTreg dihasilkan daripada tikus ini seperti yang diterangkan untuk Rajah 1 sebelum pengeraman pada slaid mikroskop yang telah disalut dengan poli-L-lisin selama 1 jam. Sel-sel yang dipatuhi kemudiannya ditetapkan oleh PFA untuk 0.5 diikuti dengan menyekat dengan 1% BSA selama 1 jam dan kemudian diinkubasi dengan antibodi yang ditentukan. Imej mikroskop confocal perwakilan (40 ×) telah divisualisasikan untuk USP44 endogen (merah) dan FOXP3. DAPI digunakan untuk menggambarkan bar skala nukleus sel (biru) 50 μm.

Data sumber tersedia dalam talian untuk angka ini.

Rajah EV3. Domain FOXP3 yang kaya dengan Pro diperlukan untuk perkaitan antara USP44 dan FOXP3 dan penstabilan FOXP3

  • A. Konstruk pemadaman FOXP3 yang berbeza telah dijana seperti yang ditunjukkan dan telah ditransfeksi bersama dengan atau tanpa FLAG-USP44 ke dalam sel HEK293T. Lysate sel telah diimunopresipitasi oleh antibodi anti-FLAG, dan tahap FOXP3 dikesan oleh Western blotting.
  • B, C. Pembinaan FOXP3 terpenggal berbeza dijana seperti yang ditunjukkan dan ditransfeksi bersama dengan atau tanpa FLAG-USP44 ke dalam sel HEK293T. Lisat sel telah diimunopresipitasi oleh antibodi anti-FLAG, dan tahap FOXP3 dikesan dengan imunoblotting untuk tag MYC.
  • D. Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan binaan MYC-FOXP3N3 atau pemotongan N4 dan FLAG-USP44. Sel-sel ini dilisiskan dan faktor-faktor yang berkaitan telah diimunopresipitasi menggunakan anti-MYC. Protein yang ditarik ke bawah dianalisis oleh imunoblot menggunakan antibodi anti-FLAG dan anti-MYC.
  • E, F. Konstruk USP44 terpenggal berbeza dijana seperti yang ditunjukkan dan telah ditransfeksi dengan atau tanpa plasmid pengekodan MYC-FOXP3 ke dalam sel HEK293T. Protein FOXP3 telah diimunopresipitasi daripada lisat sel oleh antibodi anti-MYC, dan tahap USP44 dikesan oleh immunoblotting. Ditunjukkan ialah dapatan perwakilan daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen.

Data sumber tersedia dalam talian untuk angka ini.

Eksperimen co-immunoprecipitation selanjutnya menguji keupayaan beberapa mutan FOXP3 terpotong (Rajah EV3B) untuk berinteraksi dengan USP44. Hanya varian yang mengandungi domain kaya prolin FOXP3 boleh menurunkan USP44 (Rajah EV3C dan D) yang mengesahkan keperluan domain ini untuk interaksi USP44. Dalam pendekatan yang sama, mutan pemotongan C- dan N-terminal USP44 digunakan untuk memetakan kawasan DUB yang penting untuk interaksi (Rajah EV3E). Pemadaman domain ZF-UBP USP44, tetapi bukan rantau UCH terminal C, didapati kritikal untuk interaksi dengan FOXP3. Mutasi sisipan ZF-UBP juga menyebabkan USP44 tidak mampu menarik FOXP3 (Rajah EV3F) menyokong kesimpulan bahawa USP44 mengaitkan dengan FOXP3 melalui interaksi domain yang kaya dengan prolin ZF.

Eksperimen co-IP endogen seterusnya menyokong tanggapan bahawa FOXP3 dan USP44 berinteraksi. Khususnya, immunoprecipitation FOXP3 daripada lysate murine iTregs atau nTregs dengan mudah menarik ke bawah USP44, dan DUB ini juga mampu untuk coimmunoprecipitate FOXP3 dalam eksperimen timbal balik (Rajah 2B dan C). Kolokalisasi molekul ini dicadangkan oleh mikroskop imunostaining dan pendarfluor dalam sel Jurkat T yang mengekspresikan FOXP3 (Rajah EV4). Mikroskopi konfokal murine utama Tregs mengesahkan kolokalisasi FOXP3 dan USP44 dalam sel yang berasal dari jenis liar tetapi tidak dalam sel yang diasingkan daripada tikus yang tidak mempunyai ekspresi USP44 (Usp44 fl / fl Foxp3Cre + Rajah 2D). Secara keseluruhan, data ini mencadangkan bahawa USP44 berinteraksi dengan FOXP3 dalam Tregs.

Rajah EV4. Interaksi fizikal antara USP44 dan FOXP3a telah divisualisasikan oleh mikroskop imunofluoresensi

USP44 menggalakkan penstabilan FOXP3 melalui deubiquitination

Mengesyaki bahawa USP44 menyasarkan FOXP3 untuk deubiquitination, kami sekali lagi menggunakan pendekatan IP bersama untuk menguji tanggapan ini. Seperti yang dijangkakan, pemindahan bersama sel HEK 293T serentak dengan pengekodan binaan FOXP3 bertag Myc dan ubiquitin bertanda-Nya menghasilkan spesies FOXP3 yang jelas di mana-mana yang boleh diperhatikan selepas pemendakan oleh manik anti-His (anti-ubiquitin) dan pengesanan oleh immunoblotting untuk MY -protein FOXP3 yang diberi tag (Rajah 3A). Pengenalan tambahan vektor ekspresi USP44 mengganggu ubiquitination FOXP3, menunjukkan bahawa DUB yang mengaitkan FOXP3 ini sememangnya menyasarkan FOXP3. Tambahan pula, ungkapan USP44 mutan yang tidak aktif secara pemangkin (“CS”) gagal menghalang pengubahsuaian FOXP3 dengan cara ini (Rajah 3A dan EV5). Begitu juga, ketukan USP44 yang dimediasi shRNA dalam transfektan ini juga menentang pengurangan FOXP3 yang diubah suai ubiquitin seperti yang dilihat pada rawatan kawalan vektor shRNA atau ekspresi berlebihan USP44 (Rajah 3B). Dalam eksperimen ini, kehilangan FOXP3 yang dimediasi proteasome telah dihalang oleh rawatan MG132, yang membenarkan pemulihan FOXP3 polyubiquitinated.

Rajah 3. USP44 deubiquitinates dan menstabilkan FOXP3

  • A. Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan binaan ekspresi MYC-FOXP3, His-Ubiquitin, dan sama ada versi USP44 jenis liar atau tidak aktif secara pemangkin (C282S, "cs") yang ditandakan dengan FLAG. Sel yang ditransfeksi telah dirawat dengan 20 μM MG132 selama 4 jam dan kemudiannya dituai untuk lisis sel. Tarik ke bawah protein berlabel-Nya menggunakan manik Ni-NTA membenarkan pemulihan spesies FOXP3 di mana-mana yang kemudiannya divisualisasikan oleh pemeriksaan imunoblot dengan antibodi khusus untuk MYC.
  • B. Kesan kejatuhan USP44 pada ubiquitination FOXP3. Dua binaan lentiviral shRNA berbeza yang masing-masing mengandungi kaset rintangan G418 dihantar ke dalam sel HEK293T. Selepas dipilih selama 7 hari, sel telah ditransfeksi dengan MYC-FOXP3 dan His-Ubiquitin, dan kemudian dirawat dengan 20 μM MG132 selama 4 jam sebelum penuaian dan lisis. Protein FOXP3 Ubiquitinated telah divisualisasikan seperti dalam A.
  • C. Tahap polyubiquitinated FOXP3 dengan kehadiran atau ketiadaan USP44. Seperti dalam Rajah 2B, iTregs murine dihasilkan daripada prekursor CD4 + naif yang diasingkan daripada jenis liar dan tikus yang kekurangan secara global dalam tikus USP44 -/- (n = 3/kumpulan/eksperimen). Protein ubiquitinated telah diekstrak daripada lisat iTreg dengan antibodi anti-ubiquitin (anti-Ubi) sebelum penyelesaian oleh SDS-PAGE dan analisis imunoblot, menyiasat FOXP3.
  • Sel D, E. HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan plasmid MYC-FOXP3 dan FLAG-USP44 (sama ada USP44 jenis liar, "wt" atau mutan C282S). Sel-sel ini kemudiannya dirawat dengan sikloheximide (CHX 5 μg/ml) untuk titik masa yang dinyatakan sebelum dituai dan lisis sel. Tahap FOXP3 dan kadar pusing ganti relatif faktor ini ditentukan oleh analisis imunoblotting dengan antibodi anti-MYC.
  • F, G. USP44 knockdown dalam Treg manusia. Sel CD4 + T naif (CD4 + CD25 − CD45RA + ) telah diasingkan daripada darah periferi penderma yang sihat oleh FACS, dan iTreg dijana selepas 7 hari secara in vitro keadaan senget. Seperti dalam Rajah 3B, binaan shRNA yang menyasarkan USP44 dihantar oleh lentivirus. Di sini, iTreg manusia menerima sama ada shCK (kawalan), atau salah satu daripada dua binaan shUSP44 yang berbeza. Tahap protein FOXP3 dan USP44 endogen telah divisualisasikan oleh imunoblot (F), dan ekspresi FOXP3 dinilai oleh pewarnaan intraselular diikuti oleh sitometri aliran (G).
  • H. Sel T CD4 naif Murine (CD62L + /CD25 − /CD4 + ) daripada WT dan USP44 −/− tikus (n = 2–3/kumpulan/eksperimen) telah dimurnikan dan diaktifkan FACS secara in vitro selama 4 hari oleh antibodi penghubung silang CD3/CD28 (masing-masing 1 μg dan 4 μg/ml) dengan kehadiran 100 U/ml IL-2 dan dos TGF-β yang ditunjukkan. Down-regulation FOXP3 diperhatikan dalam USP44 -/- tikus oleh immunostaining intraselular dan sitometri aliran.

Data sumber tersedia dalam talian untuk angka ini.

Rajah EV5. USP44 menstabilkan FOXP3 dalam cara yang bergantung kepada dos

Data sumber tersedia dalam talian untuk angka ini.

Kami selanjutnya menunjukkan kepentingan USP44 dalam mengatasi proses polyubiquitination FOXP3 dengan mengkaji kehadiran relatif pengubahsuaian pasca terjemahan ini dalam Tregs yang tidak mempunyai ekspresi USP44. Untuk tujuan ini, iTregs yang diperoleh daripada sel CD4 + T naif tikus jenis liar atau mereka yang kekurangan secara global dalam ekspresi USP44 (USP44 -/-tikus) telah dianalisis untuk kehadiran FOXP3 di kalangan protein ubiquitinated dalam setiap sampel dengan immunoblotting. Seperti yang dijangkakan, Treg biasa mengandungi beberapa spesies FOXP3 di mana-mana, tahap yang dipertingkatkan dengan menghentikan degradasi protein dengan perencat proteasome MG132 yang menghentikan perolehan protein FOXP3. Sebaliknya, USP44 kalah mati Tregs mempamerkan polyubiquitination FOXP3 yang mantap pada garis dasar dan lebih-lebih lagi selepas rawatan MG132 (Rajah 3C). Keputusan ini menyokong peranan untuk USP44 dalam deubiquitination FOXP3 dan penstabilan ekspresi faktor transkripsi penting ini.

Oleh kerana FOXP3 tertakluk kepada degradasi pengantara ubiquitin dalam Tregs, dan deubiquitination FOXP3 telah dilaporkan untuk menstabilkan faktor transkripsi (van Loosdregt et al, 2013), kami mengkaji kesan ekspresi paksa USP44 pada separuh hayat FOXP3. Rawatan Cycloheximide (CHX) sel HEK 293T yang mengekspresikan FOXP3 berlabel MYC menunjukkan penurunan tahap FOXP3 sebanyak 8 jam selepas rawatan. Ekspresi bersama jenis liar, tetapi bukan mutan, pembinaan pengekodan USP44 sebahagian besarnya menstabilkan kumpulan protein FOXP3 dalam barisan sel ini (Rajah 3D dan E).

Sebaliknya, ketukan USP44 yang dimediasi shRNA meningkatkan kehilangan protein FOXP3 dalam sel Jurkat T (Lampiran Rajah S1A dan B). Modulasi turun FOXP3 ini dikaitkan dengan disregulasi beberapa gen yang biasanya ditindas oleh FOXP3 (Lampiran Rajah S1C). Yang penting, memperkenalkan binaan shRNA yang menyenyapkan USP44 ke dalam iTreg utama manusia melalui transduksi lentiviral juga mengurangkan tahap protein FOXP3, manakala kawalan vektor kosong tidak. Ini dibuktikan oleh immunoblotting dan immunostaining intraselular, masing-masing (Rajah 3F dan G). Seperti garisan sel, shRNA knockdown USP44 dalam iTreg manusia juga menggelincirkan corak ekspresi gen Treg tipikal untuk IL2, CTLA4, GITR, dan CD25 (Lampiran Rajah S1D).

Selaras dengan peranan USP44 dalam menstabilkan ekspresi FOXP3, kami juga mendapati bahawa sel T daripada tikus yang tidak mempunyai deubiquitinase (USP44 -/− ) kurang mampu mengawal selia FOXP3. secara in vitro daripada rakan sampah USP44-kompeten (WT) mereka. Semasa peringkat awal pembezaan iTreg, sel T terbitan USP44 −/− menunjukkan peratusan sel FOXP3 + yang lebih rendah (Lampiran Rajah S1E). Di bawah keadaan kultur condong iTreg yang dilanjutkan, ekspresi protein FOXP3 terjejas yang berpunca daripada kekurangan USP44 adalah paling ketara apabila kepekatan rendah TGF-β (0.5 ng/ml) digunakan. Menariknya, sedikit perbezaan dalam penjanaan iTreg dilihat di antara kumpulan selepas 4 hari pencongan dalam banyak sitokin (2.5 ng / ml) (Rajah 3H). Sementara itu, analisis sitometri aliran nodus limfa, limpa, dan penggantungan sel timik mendedahkan bahawa tahap FOXP3 + Treg tidak berbeza dengan ketara antara tisu limfoid tikus USP44 -/- dan kawalan WT. Petak sel CD4 + dan CD8 + T am, serta makrofaj, sel dendritik, dan populasi sel B kedua-dua strain, juga boleh dibandingkan. Tikus dengan kekurangan USP44 khusus Treg (Usp44 fl/fl Foxp3Cre + tikus) juga didapati berkemampuan seperti rakan sampah jenis liar mereka dalam mengekalkan populasi leukosit dan homeostasis imun (Lampiran Rajah S2A). Selain itu, penanda permukaan kenaifan dan pengaktifan sel T (masing-masing, CD62L dan CD44), serta pengeluaran sitokin pro-radang, semuanya didapati serupa antara tikus kekurangan USP44 khusus Treg dan rakan jenis liar mereka (Lampiran). Rajah S2B). Secara kolektif, keputusan ini mencadangkan peranan penting untuk USP44 dalam induksi iTregs di bawah keadaan suboptimum dan penyelenggaraan kumpulan protein FOXP3 dalam membangunkan serta Treg yang ditubuhkan. Namun mereka juga nampaknya mencadangkan peranan yang kurang menonjol atau mungkin berlebihan dalam permulaan thymic ekspresi FOXP3 dan homeostasis imun pada peringkat awal.

USP44 menyasarkan FOXP3 polyubiquitinated berkaitan K48

Kami kemudiannya menentukan sama ada USP44 menstabilkan tahap FOXP3 secara khusus melalui penyingkiran rantai polyubiquitination jenis K48—pengubahsuaian yang diketahui memacu degradasi proteasomal protein sasaran (Komander & Rape, 2012). Untuk tujuan ini, kami mencirikan deubiquitination FOXP3 oleh USP44 secara in vitro dengan kehadiran molekul ubiquitin jenis liar dan mutan yang tidak mempunyai semua kecuali sisa lisin khusus. Pendekatan ini membolehkan kami mengenal pasti jenis hubungan ubiquitin yang disasarkan oleh USP44. Di sini, sel HEK 293T yang membawa gabungan Flag-USP44, MYC-FOXP3, dan sama ada binaan ubiquitin jenis liar atau lisin-mutan telah dirawat dengan MG132 (untuk menstabilkan tahap protein ubiquitinated) sebelum ubiquitin (His) pull-down dan immunoblot penilaian spesies FOXP3. Dalam eksperimen ini, ubiquitination FOXP3 telah dikurangkan oleh ekspresi bersama USP44 dengan kehadiran ubiquitin jenis liar. Walau bagaimanapun, mutan ubiquitin bukan lisin (K0, di mana semua residu lisin telah bermutasi) dalam skema transfeksi bersama triple menghalang deubiquitination.Begitu juga, empat daripada tujuh kemungkinan varian residu lisin tunggal (K6, K29, K33, dan K63) tidak membenarkan deubiquitination FOXP3 oleh ekspresi bersama USP44 berbanding dengan jenis liar dan mutan ubiquitin lain. Ini boleh dijelaskan oleh perubahan biokimia (mis., Konformasi) yang terhasil daripada kandungan lisin yang diubah bagi varian ini. Menariknya, untuk dua daripada varian residu lisin tunggal (K11 dan K23) ubiquitin pada FOXP3 masih boleh dialih keluar oleh USP44. Terutama, terdapat pengurangan yang lebih ketara bagi ubiquitination berkaitan K48 bagi FOXP3 (hampir penyingkiran lengkap) (Lampiran Rajah S3). Ini menunjukkan bahawa USP44 terutamanya menyasarkan rantaian ubiquitin berkaitan K48 pada FOXP3 untuk mengekalkan tahap faktor transkripsi.

USP44 bekerjasama dengan USP7 untuk deubiquitinate FOXP3 dan menstabilkan ekspresi

Sebelum ini, DUB USP7 telah ditunjukkan untuk menstabilkan kumpulan protein FOXP3 dan fungsi menindas Tregs (van Loosdregt et al, 2013). Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa DUB lain mampu menyahkuiti FOXP3 untuk meningkatkan ekspresi pengawal selia transkrip yang penting ini. Oleh itu, kami menyiasat sama ada USP44 bekerjasama dengan USP7 untuk menyahbikuiti dan memelihara FOXP3. Eksperimen Co-IP mendedahkan bahawa USP44 dan USP7 dikaitkan antara satu sama lain dalam kompleks (Rajah 4A). Tambahan pula, peningkatan tahap USP44 nampaknya meningkatkan tahap protein FOXP3 (Rajah 4B). Memandangkan FOXP3 ialah sasaran bersama untuk USP44 dan USP7, kami membuat hipotesis bahawa DUB ini bekerjasama untuk menstabilkan FOXP3. Seperti yang dijangkakan, ungkapan USP44 atau USP7 sahaja mengurangkan ubiquitination FOXP3, manakala ekspresi bersama kedua-dua USP44 dan USP7 hampir sepenuhnya menghapuskan polyubiquitination FOXP3, mencadangkan peranan sinergistik kedua-dua DUB ini (Rajah 4C).

Rajah 4. USP44 bekerjasama dengan USP7 untuk deubiquitinate FOXP3 dan menstabilkan ekspresinya

  1. IP bersama timbal balik USP44 dan USP7. Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan binaan MYC-USP44 dan FLAG-USP7. Sel-sel ini dilisiskan dan faktor-faktor yang berkaitan telah diimunopresipitasi menggunakan sama ada anti-FLAG atau anti-MYC. Protein yang ditarik ke bawah diperhatikan oleh analisis imunoblot menggunakan sama ada antibodi anti-MYC atau anti-FLAG.
  2. Kesan USP44 pada tahap USP7. Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan MYC-FOXP3. Sel juga menerima gabungan FLAG-USP7 dan pelbagai dos plasmid pengekodan pLVX-USP44. FOXP3 telah immunoprecipitated menggunakan anti-MYC, dan immunoblots dianalisis menggunakan antibodi anti-FLAG, anti-USP44, atau anti-MYC.
  3. Kesan ekspresi bersama USP44 dan USP7 pada ubiquitination FOXP3. Sel HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan plasmid MYC-FOXP3, sama ada FLAG-USP44 atau FLAG-USP7 atau kedua-duanya, His-ubiquitin. Sel-sel telah dirawat dengan 20 μM MG132 selama 4 jam sebelum dituai, dilisekan, dan diinkubasi pada manik Ni-NTA untuk menarik turun FOXP3 di mana-mana, yang divisualisasikan dengan immunoblotting menggunakan antibodi khusus untuk MYC.
  4. (panel kiri) iTregs telah terpolarisasi daripada sel CD4 + T naif manusia selama 7 hari (n = 3 penderma/eksperimen) menerima kawalan (shCK), atau binaan knockdown shRNA yang menyasarkan USP44 (shUSP44-1, -2), atau USP7 (shUSP7-1, -2), atau kedua-dua binaan shRNA. nTregs yang baru diasingkan telah dirawat dengan sama ada pembinaan kawalan atau shRNA. Selepas transduksi dengan lentivirus selama 48 jam, sel dituai dan menjalankan gel SDS-PAGE. Tahap protein divisualisasikan dengan immunoblotting menggunakan antibodi khusus untuk FOXP3, USP44, USP7, dan GAPDH. Ditunjukkan adalah penemuan perwakilan daripada tiga eksperimen bebas (replika biologi).

Data sumber tersedia dalam talian untuk angka ini.

Kerjasama antara USP44 dan USP7 juga dilihat dalam iTreg manusia. Seperti yang dinyatakan sebelum ini, mengetuk ekspresi USP44 dalam iTregs mengurangkan tahap FOXP3 dalam iTregs. Menyenyapkan ekspresi USP7 mencapai kesan yang serupa, tetapi kurang dramatik. Gabungan USP7/USP44 knockdown, walau bagaimanapun, mempertingkatkan lagi degradasi FOXP3 (Rajah 4D, panel kiri). Menariknya, dalam nTregs terpencil, pembungkaman USP7 mempunyai kesan yang lebih besar daripada pembungkaman USP44 (Rajah 4D, panel kanan). Keputusan ini menunjukkan bahawa, walaupun sebahagiannya berlebihan dalam keupayaan mereka untuk mengekalkan kumpulan protein FOXP3, kedua-dua DUB ini secara berbeza penting merentas subset Treg. USP7, seperti yang ditunjukkan sebelum ini, nampaknya diperlukan untuk kestabilan optimum nTreg yang mantap, manakala USP44 mungkin sangat penting untuk mengekalkan FOXP3 dalam iTregs. Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa tahap kerjasama wujud antara DUB yang mampu menstabilkan FOXP3 terhadap degradasi pengantara ubiquitin.

USP44 memodulasi fungsi sel Treg secara in vitro

Memandangkan kepentingan USP44 untuk menstabilkan FOXP3, adalah wajar bahawa DUB ini diperlukan untuk fungsi Treg yang betul. Menggunakan ujian wartawan berasaskan luciferase untuk ekspresi IL-2, kami mendapati bahawa penindasan yang dijangkakan IL2 gen oleh FOXP3 boleh ditambah dengan ekspresi berlebihan USP44. Ini penindasan dipertingkatkan IL2 transkripsi dilihat bersama paras protein FOXP3 yang sepadan dengan dos dari segi tahap ekspresi berlebihan USP44 dalam sel Jurkat T (Rajah 5A). Menilai perubahan corak ekspresi gen yang dicetuskan oleh kalah mati USP44 dalam Tregs (dari USP44 -/- tikus) mendedahkan gangguan dalam corak tipikal gen yang ditadbir oleh FOXP3, yang berkaitan dengan Treg. Khususnya, transkrip pengekodan sitokin effector IL2, IL-17, dan IFN-γ telah dinaikkan, manakala untuk faktor yang berkaitan dengan Treg CTLA-4, CD25, GITR, dan IL-10 telah tertekan dalam Usp44 -/- Treg berbanding dengan WT Tregs (Rajah 5B). Ketidakstabilan sedemikian dalam ekspresi gen Treg berkemungkinan akibat langsung melemahkan penstabilan yang difasilitasi USP44 bagi kumpulan protein FOXP3, kerana kekurangan USP44 mempunyai sedikit kesan kepada tahap mRNA Foxp3 (Rajah 5B).

Rajah 5. Kesan USP44 pada peraturan gen pengantara FOXP3 dan fungsi Treg secara in vitro

  • A. Sel Jurkat T telah ditransfeksi dengan kombinasi yang ditunjukkan dan dos relatif ekspresi membina pengekodan MYC-FOXP3, FLAG-USP44 bersama-sama dengan wartawan luciferase kelip-kelip yang dipacu oleh promoter IL-2. Selepas 8 jam rangsangan dengan PMA / ionomycin, sel-sel telah dilisiskan dan aktiviti luciferase, yang diperhatikan dan dinormalkan kepada aktiviti Renilla luciferase.
  • B. Treg (CD4 + / CD25 High ) telah dipulihkan daripada nodus limfa dan limpa jenis liar C57BL/6 (WT) dan tikus USP44 -/− melalui penulenan FACS. Sel telah diaktifkan dengan antibodi agonis anti-CD3/CD28 semalaman, dan RNA telah diasingkan, dan cDNA dihasilkan daripada sampel ini untuk pengukuran beberapa transkrip berkaitan Treg oleh qRT-PCR. Tahap ekspresi relatif ini oleh Treg terbitan WT dan KO ditunjukkan.
  • C, D. Analisis terhadap secara in vitro fungsi menindas Tregs yang diasingkan daripada tikus WT atau tikus USP44 −/− padanan umur dan jantina (n = 3/kumpulan/eksperimen). Treg dicampur dengan sel T naif responder berlabel CFSE daripada CD45.1 + C57BL/6 tikus (n = 3/eksperimen) selama 3 hari. Pencairan CFSE dalam sel CD45.1 + T diperhatikan oleh sitometri aliran, dan penindasan peratus percambahan sel responder oleh Tregs yang dikultur bersama telah ditentukan.

Keputusan di atas meramalkan bahawa dengan ketiadaan USP44, jentera molekul yang diperlukan untuk fungsi menindas Tregs sepatutnya kurang. Untuk menguji kesan kekurangan USP44 pada fungsi Treg, an secara in vitro ujian penindasan dilakukan menggunakan Tregs dari WT dan Usp44 -/- tikus. Kami mendapati bahawa USP44 −/− Tregs memaparkan aktiviti yang kurang menindas daripada rakan sejawatannya yang berasal dari jenis liar (Rajah 5C dan D). Penemuan ini jelas mencadangkan peranan sokongan untuk USP44 dalam menyokong fungsi penindasan Treg.

Treg kekurangan USP44 adalah kurang menindas daripada Treg jenis liar dalam vivo

Untuk menentukan kepentingan USP44 untuk dalam vivo Fungsi Treg, kami menggunakan model kolitis tikus yang disebabkan oleh sel T. Secara ringkas, sel CD4 + T naif (CD62L tinggi / CD25-) diasingkan daripada penderma jenis liar oleh FACS dan disuntik secara intraperitoneal ke dalam tikus Rag2 -/− limfopenik bersama-sama dengan sel Treg yang berbeza secara kongenital yang diasingkan daripada tikus jenis liar atau USP44 -/− . Perubahan dalam berat badan tikus yang menerima sel ini, serta penerima CD4 + naif sahaja dan tikus yang tidak dirawat, dinilai setiap minggu. Pemindahan pakai Treg jenis liar, seperti yang dijangkakan, menghalang perkembangan pembaziran yang teruk dan progresif yang disebabkan oleh pengembangan CD4 + naif dalam tikus Rag2 -/−. Sebaliknya, Treg kekurangan USP44 kurang berkesan untuk menyelamatkan tikus penerima daripada kolitis (Rajah 6A). Pemarkahan patologi bahagian tisu kolon bernoda H&E yang dituai 10 minggu selepas pemindahan juga mencadangkan bahawa USP44 −/− Treg tidak mengawal keradangan kolon serta rakan jenis liar mereka (Rajah 6B dan C). Selain itu, leukosit menyusup limpa, nodus limfa dan lamina propria tikus yang menerima USP44 -/− Tregs didapati mengandungi bilangan sel effector kolitogenik yang lebih tinggi berbanding dengan tisu penerima Treg jenis liar, hampir menyerupai tikus. tidak menerima sebarang Treg sama sekali (Rajah 6D).

Rajah 6. USP44 memodulasi aktiviti sel Treg dalam vivo

  1. Kolitis disebabkan oleh suntikan intravena sel T tinggi CD4 + CD25-CD62L dan sel Treg tinggi CD4 + CD25 yang berbeza secara congenically (CD45.2) ke dalam tikus Rag2 -/− (n = 8/kumpulan 1 × 10 6 dan 2 × 10 5 sel setiap Rag2 −/− penerima, masing-masing). Perubahan dalam berat badan dari semasa ke semasa dipantau dan dinyatakan sebagai peratusan berat asal.
  2. Fotomikrograf perwakilan kolon distal Rag2 −/− tikus selepas pemindahan sel T. 10 minggu selepas pemindahan, tikus telah dieuthanasikan, dan kolon dituai, ditetapkan dalam 10% formalin penimbal, dan diproses untuk pewarnaan H&E standard sebelum analisis histologi. (i)- (iv) hadirkan mikrograf medan terang (100×).
  3. Slaid H&E dijaringkan secara buta, dan patologi kolon dijaringkan seperti yang diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah. Ditunjukkan ialah skor min bagi setiap kumpulan rawatan.
  4. Sel-sel nodus limfa limpa, mesenterik, dan lamina propria telah diasingkan daripada tikus 10 minggu selepas pemindahan sel T pakai, dan bilangan sel Teff ditentukan oleh sitometri aliran.
  5. Ekspresi protein dan mRNA FOXP3 oleh Treg yang dipindahkan secara angkat. Nodus limfa mesenterik dikeluarkan daripada penerima WT dan USP44 −/− Treg dalam A. protein FOXP3 dikesan oleh imunostaining intraselular dan sitometri aliran (kiri). Ditunjukkan ialah acara dalam gerbang untuk Treg yang dipindahkan (CD4 + /CD45.1 + ). Treg yang dipindahkan juga diperolehi daripada penggantungan sel nodus limfa mesenterik dengan pewarnaan untuk penanda konggenik dan CD4 diikuti oleh FACS, dan Foxp3 mRNA diukur dalam Treg yang dipulihkan oleh RT-PCR (kanan).
  6. Nombor sel yang disuntik (CD45.2 + ) Sel Treg dan sel FOXP3 + ditentukan oleh sitometri aliran.
  7. Sel CD4 + T telah dipulihkan daripada penggantungan leukosit yang menyusup lamina propria. Limfosit ini dirangsang ex vivo oleh koktel PMA/Ionomycin dengan kehadiran brefeldin A, dan pengeluaran IFN-γ dan IL-17 oleh limfosit ini dianalisis oleh ELISA.

Memandangkan peranan USP44 dalam deubiquitination dan penstabilan protein FOXP3 yang didedahkan oleh kami secara in vitro eksperimen, kami menilai tahap faktor transkripsi dalam Treg yang dipindahkan asal. Walaupun kebanyakan Treg jenis liar pulih daripada nodus limfa tikus penerima yang mengeringkan usus mengekalkan ekspresi tinggi FOXP3, lebih separuh daripada Treg kekurangan USP44 kehilangan ekspresi FOXP3 (Rajah 6E, kiri). Terutama, walaupun tahap rendah isyarat protein FOXP3 yang dikesan dalam USP44 −/− Treg yang dipulihkan, Foxp3 Tahap transkrip yang dilihat dalam sel-sel ini adalah setanding dengan yang diperhatikan dalam Treg jenis liar yang dipindahkan (Rajah 6E, kanan) menyokong peranan untuk sokongan pengantaraan USP44 terhadap ekspresi FOXP3 pada tahap protein. Tambahan pula, bilangan sel yang mengekspresikan FOXP3 dalam petak Treg yang dipindahkan (Thy1.2 + ) telah dikurangkan secara mendadak dalam penerima USP44 −/− Treg yang diperolehi. Sebaliknya, Tregs jenis liar sebahagian besarnya mengekalkan FOXP3 merentasi pelbagai tisu (Rajah 6F). Penemuan ini menggambarkan ketidakstabilan meluas ekspresi FOXP3 dalam menghadapi keradangan apabila USP44 kekurangan. Menyokong ini, pengeluaran sitokin pro-radang oleh sel T effector telah dipertingkatkan dalam kumpulan di mana Tregs kekurangan USP44 (Rajah 6G).

Keputusan yang menyokong diperolehi dalam model kolitis akibat kimia yang digunakan secara meluas. Di sini, tikus USP44 fl/fl Foxp3-yfp-Cre + dan kawalan jenis liar (Foxp3-yfp-Cre + ) menerima DSS dalam air minuman mereka (2.5%) selama 7 hari diikuti dengan air biasa selama 2 hari tambahan. Seperti yang dijangkakan, DSS mencetuskan penurunan berat badan yang ketara dalam kedua-dua kumpulan, yang serupa dengan berat badan pada permulaan eksperimen (Lampiran Rajah S4A). Walau bagaimanapun, tikus dengan Treg kekurangan USP44 terdedah kepada penyakit yang lebih teruk seperti yang dibuktikan oleh penurunan berat badan yang lebih teruk dan histopatologi usus yang dilihat dalam kumpulan ini berbanding dengan kawalan jenis liar (Lampiran Rajah S4B-D) yang menunjukkan kawalan imun yang lemah. Analisis sitometrik aliran mendedahkan bahawa tikus kalah mati bersyarat juga mempunyai lebih sedikit FOXP3 + Treg di kalangan sel CD4 + T yang menyusup lamina propria kolon mereka (Lampiran Rajah S4E). Foxp3 Tahap mRNA juga diukur dalam Treg yang diperolehi daripada leukosit yang menyusup kolon tikus ini oleh FACS (CD4 + / yfp + ). Selaras dengan peranan khusus protein untuk USP44 dalam penstabilan fungsi FOXP3 dan Treg, kami mendapati tahap transkrip yang sama banyak dalam Tregs daripada semua kumpulan, mencerminkan tahap tinggi yang dilihat dalam nTregs yang telah dimurnikan (kawalan positif), tetapi bukan CD4 + naif. Sel T (kawalan negatif) walaupun tahap protein FOXP3 berbeza dan keupayaan yang berbeza untuk menahan keradangan sel-sel ini (Lampiran Rajah S4F). Sitometri aliran juga mendedahkan kekerapan pengeluar sitokin pro-radang (IFNγ, IL-17) telah dinaikkan dalam kolon Usp44 fl/fl Foxp3Cre + tikus berbanding dengan kawalan jenis liar dalam model ini (Lampiran Rajah S4G). Secara kolektif, ini dalam vivo keputusan menyokong peranan utama untuk USP44 dalam pemeliharaan ekspresi FOXP3 dan fungsi Treg dalam vivo.

Kekurangan USP44 khusus Treg mengakibatkan pertumbuhan tumor terbantut dan imuniti anti-tumor dipertingkatkan

Kami seterusnya menetapkan untuk menguji tanggapan bahawa ungkapan USP44 oleh Tregs menyumbang kepada penindasan patologi mereka terhadap imuniti anti-tumor dalam model kanser. Walaupun telah dilaporkan bahawa tikus yang kekurangan Usp44 terdedah kepada perkembangan tumor spontan disebabkan oleh kesan kepada pusat pemeriksaan mitosis dan ketinggalan kromosom (Zhang et al, 2012 Mosbech et al, 2013), kami mendapati bahawa pertumbuhan tumor adalah lebih perlahan dalam tikus Usp44-null berbanding dengan sampah mereka, yang mencadangkan peranan yang kompleks untuk biologi USP44 dalam tikus yang membawa tumor. Untuk membedah lebih lanjut peranan USP44 dalam Tregs, kami menghasilkan tikus yang tidak mempunyai ekspresi USP44 khusus Treg. Sesungguhnya, cabaran subkutaneus (sc) tikus Usp44fl/flFoxp3Cre + dengan garisan sel karsinoma kolon MC38 yang boleh diimplan mengakibatkan pertumbuhan tumor tertangguh dengan ketara berbanding yang dilihat pada tikus kawalan jenis liar (Rajah 7A). Kekurangan ekspresi USP44 khusus Treg turut membantutkan perkembangan s.c dengan ketara. B16F10 melanoma dan EL4 thymomas (Rajah 7B dan C) -kedua-duanya menyokong peranan pro-tumor untuk DUB ini dan serasi dengan sumbangan penting kepada toleransi patologi dalam tetapan kanser.

Rajah 7. Kekurangan USP44 khusus Treg membantutkan pertumbuhan tumor dan meningkatkan imuniti anti-tumor

  • A–C. Karsinoma kolon MC38, melanoma B16F10, dan garisan sel timoma EL4 adalah s.c. disuntik ke dalam rusuk yang dicukur Usp44 fl/fl Foxp3Cre + tikus dan jenis liar (Usp44 fl/fl Foxp3Cre-) mereka (1 × 10 5 sel/tikus n = 5–9 tikus/kumpulan). Dimensi tumor diukur setiap 2 hari, dan perubahan dalam jumlah purata tumor dari masa ke masa telah diperhatikan (panel bawah). Panel atas menggambarkan gambar perwakilan tumor yang dipotong.
  • E. 21 hari selepas implantasi, perkadaran FOXP3 + Treg dalam petak CD4 + semua tikus pembawa tumor MC38 dalam setiap eksperimen ditemui oleh sitometri aliran. Suspensi sel yang diperoleh daripada limpa, nodus limfa yang mengeringkan tumor, dan leukosit penyusupan tumor (TILs) telah diwarnakan untuk CD4 permukaan dan FOXP3 intraselular sebelum dianalisis oleh sitometri aliran.
  • E, F. Kekerapan sel CD4 + dan CD8 + yang menghasilkan sitokin pro-radang IFNγ ditemui di kalangan tisu tikus yang membawa tumor dalam model MC38 melalui pewarnaan sitokin intraselular (Kralovics). et al, 2005 ) dan sitometri aliran selepas ex vivo rangsangan semula leukosit pulih oleh PMA dan ionomycin dengan kehadiran brefeldin A.
  • G, H. Kapasiti sel CD8 + untuk fungsi effector dalam tumor MC38 dinilai selanjutnya dengan mengukur (G) pengeluaran TNFα oleh ICS dan (H) penegangan intraselular granzyme B pengantara sitotoksik diikuti oleh sitometri aliran.

Selaras dengan tanggapan ini, analisis frekuensi sel FOXP3 + CD4 + T merentas tisu jenis liar pembawa tumor MC38 dan tikus Usp44 fl/fl Foxp3Cre + menunjukkan pengurangan ketara dalam saiz relatif kolam Treg apabila ekspresi USP44 kurang. dalam sel ini (Rajah 7D). Kehadiran Treg yang lebih rendah dalam tikus USP44knockout khusus Treg ini disertai dengan peningkatan tahap pengeluaran sitokin pro-radang dalam petak sel CD4 + dan CD8 + T limpa, nodus limfa yang mengeringkan tumor dan tumor. Khususnya, perkadaran dan bilangan sel CD4 + dan CD8 + T penghasil IFN-gamma yang lebih tinggi diperhatikan dalam Usp44 fl / fl Foxp3Cre + tikus berbanding dengan kawalan jenis liar (Rajah 7E dan F). Sel CD8 + T daripada tikus pembawa tumor yang tidak mempunyai USP44 juga didapati mengekspresikan tahap TNFα yang lebih tinggi dan tahap molekul effector granzyme B yang jauh lebih tinggi daripada rakan jenis liar mereka (Rajah 7G dan H). Keputusan ini menunjukkan bahawa Treg tanpa penstabilan FOXP3 yang dimediasi USP44 adalah penindas tindak balas imun anti-tumor yang tidak berkesan. Mereka juga membabitkan tindakan DUB dalam tetapan kanser mungkin menjadi penyumbang penting kepada melembapkan imuniti anti-tumor semulajadi atau terapeutik yang berkesan. Apabila dipertimbangkan bersama dengan penemuan kami dari model penyakit radang tikus (kolitis), keputusan ini menggambarkan peranan penting yang dimainkan oleh USP44 dalam mempromosikan penindasan imun yang dimediasi Treg dalam vivo.


Kaedah

Reagen CRISPR

RNA panduan CRISPR direka bentuk menggunakan CRISPR.mit.edu, atau CHOPCHOP, dan digunakan sebagai molekul crRNA sintetik dan tracrRNA dua bahagian anil untuk semua gen (RNA panduan CRISPR Alt-R TM, Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT), Coralville, IA, USA dan Genome Craft Type CT, FASMAC, Kanagawa, Jepun), dan sebagai sgRNA untuk Pitx1. Cas9 mRNA (digunakan untuk Pitx1 eksperimen floxing Fail tambahan 1: Rajah S1) disediakan menggunakan plasmid pBGK seperti yang diterangkan sebelum ini [27]. sgRNA (digunakan untuk Pitx1eksperimen floxing Fail tambahan 1: Rajah S1) telah disintesis seperti yang diterangkan sebelum ini [26].Plasmid telah dilinearkan dengan XbaI dan digunakan sebagai templat untuk transkripsi in vitro menggunakan kit ULTRA mMESSAGE mMACHINE T7 (Ambion, AM 1345). Protein Cas9 rekombinan yang digunakan untuk suntikan RNP ialah Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease 3NLS (IDT), atau daripada New England Biolabs, atau FASMAC. Templat dsDNA untuk eksperimen floxing (mengandungi lengan homologi dan jujukan exon floxed) untuk menghasilkan penderma ssDNA ialah gen sintetik tersuai yang dibuat oleh Life Technologies atau IDT (untuk eksperimen floxing) dan kaset knock-in telah dikuatkan menggunakan primer panjang untuk menambah lengan homologi. Penderma HDR ssDNA telah disediakan daripada templat dsDNA klon ini sama ada menggunakan ivKaedah TRT seperti yang diterangkan sebelum ini [26] atau diperoleh daripada IDT (Megamer™ single-stranded Gen Fragments). Kedua-duanya ivPersediaan ssDNA TRT dan IDT Megamer™ menunjukkan kecekapan HDR yang setanding. Walaupun dua versi berbeza ssDNA belum diuji pada lokus genetik yang sama, kami tidak menjangkakan sebarang perbezaan prestasi antara kedua-dua sumber (Jadual 1 dan 2).

Penyediaan campuran suntikan CRISPR

Campuran ctRNP disediakan seperti berikut. crRNA dan tracrRNA lyophilized (diperoleh secara komersial) telah digantung semula dalam penimbal suntikan mikro (TrisHCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 0.1 mM). Lima mikrogram crRNA (5 μl daripada 1 μg/μl) dan 10 μg tracrRNA (10 μl daripada 1 μg/μl) telah digabungkan dalam tiub PCR dan telah disepuhlindapkan dalam thermocycler (95 °C selama 5 minit diikuti dengan tanjakan ke bawah. kepada 25 °C pada 5 °C/min). crRNA anil dan tracrRNA (juga dikenali sebagai RNA panduan) telah dicairkan dalam penimbal suntikan mikro dan dicampur dengan protein Cas9 untuk mendapatkan kompleks ctRNP [57]. Kepekatan akhir komponen dalam penyediaan ctRNP ialah 5–20 ng/μl RNA panduan (jika dua panduan digunakan, setiap panduan adalah pada 5–20 ng/μl) dan 5–50 ng/μl protein Cas9. Penderma ssDNA dicampur dengan kompleks ctRNP pada 5-10 ng/campuran dan campuran suntikan akhir disalurkan melalui unit Penapis Empar Millipore (UFC30VV25, EMD Millipore, Billerica, MA, Amerika Syarikat) dan berputar pada 21,000 g selama 5 minit pada suhu bilik .

Suntikan mikro embrio satu sel

Semua eksperimen haiwan yang dilakukan telah diluluskan oleh protokol IACUC institusi masing-masing. C57BL/6 tikus pada usia 3-4 minggu (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, Amerika Syarikat atau CLEA, Tokyo, Jepun) telah disuperovulasi oleh suntikan intraperitoneal 5 IU hamil mare serum gonadotropin, diikuti 48 jam kemudian dengan suntikan 5 IU human chorionic gonadotropin (kedua-dua hormon daripada National Hormone & Peptide Programme, Torrance, CA, USA). Zigot tikus diperolehi dengan mengawan jantan kancing C57BL/6 dengan betina superovulasi C57BL/6. Embrio tikus disenyawakan peringkat satu sel telah disuntik dengan 5-50 ng/μl protein Cas9 (atau 10 ng/μl Cas9 mRNA untuk Pitx1 lokus), 5-20 ng/μl crRNA anil dan tracrRNA (atau 10 ng/μl setiap sgRNA untuk Pitx1 lokus) dan 5–10 ng/μl ssDNA. Suntikan mikro dan eksperimen transgenesis tetikus telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [27].

Pengekstrakan DNA genom tikus, genotaip dan penjujukan

DNA genomik tikus diekstrak daripada sampel kaki atau telinga menggunakan Kit Tisu Qiagen Gentra Puregene (Qiagen Sciences, Maryland, Amerika Syarikat) atau Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer (KURABO, Osaka, Jepun). Primer direka bentuk untuk menguatkan persimpangan yang disasarkan dengan betul. DNA genomik tertakluk kepada PCR primer mengapit dan PCR primer dalaman (khusus oligo penderma) dan PCR primer luaran. Urutan primer untuk semua 13 gen disenaraikan dalam Fail tambahan 1: Jadual S1. Reaksi PCR dilakukan menggunakan campuran hijau Go Taq Promega Hot Start (Promega, Madison, WI, USA) atau PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa, Shiga, Jepun). Amplikon dipisahkan pada gel agarose 1-3%. Amplikon yang ditulenkan gel telah tertakluk kepada penjujukan menggunakan salah satu primer PCR dan/atau primer dalaman. Dalam sesetengah kes, produk PCR telah diklonkan ke dalam vektor TA (Life Technologies, nombor katalog K2020-20) sebelum penjujukan.

Ujian aktiviti FlpO

Tetikus wartawan FLP homozigot, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm1.3(CAG-tdTomato,-EGFP)Pjen /J (Stok JAX #026932) [30], telah disilangkan dengan Fgf8 -P2A-FlpO #4. Keseluruhan koklea telah dibedah daripada anak anjing P1-P2, dipotong di sepanjang membran Reissner untuk mendedahkan permukaan epitelium deria, dan ditetapkan semalaman pada suhu 4 ° C dalam 4% paraformaldehid dalam PBS. Koklea telah diwarnai dengan Alexa488-phalloidin (Invitrogen) yang dicairkan 1:1500 dalam PBS yang mengandungi 0.1% Triton X-100 selama 15 minit, dan kemudian dipasang dalam Fluoromount-G (SouthernBiotech) pada slaid mikroskop. Cochleae telah diimej pada Axioskop (Zeiss) dengan pencahayaan epifluoresen dan difoto dengan kamera digital Infinity 3-6UR (Lumenera). Saluran hijau dan merah ditindan menggunakan Photoshop CS6 (Adobe).

Kuantifikasi dan analisis statistik

Kekukuhan kaedah penyuntingan genom yang dibangunkan dalam kerja ini telah diuji di 13 lokus genom bebas. Setiap eksperimen khusus lokus dilakukan dengan menyuntik zigot untuk menjana pengasas sehingga sekurang-kurangnya satu haiwan pengasas yang disasarkan dengan betul diperolehi. Berdasarkan kriteria ini, kesemua 13 lokus yang dicuba menghasilkan haiwan yang disasarkan (iaitu, 100% kadar kejayaan). Bilangan zigot yang disuntik adalah antara 19 hingga 105 setiap lokus dengan purata 50 zigot yang disuntik setiap lokus untuk berjaya menyelesaikan projek (untuk mendapatkan sekurang-kurangnya seekor haiwan yang disasarkan dengan betul). Kecekapan keseluruhan projek individu dikira dengan peratusan haiwan yang disasarkan dengan betul di antara jumlah bilangan haiwan yang dilahirkan hidup, yang berkisar antara 8.5 hingga 100%. Sebab kemungkinan kebolehubahan merentas lokus genomik yang berbeza disertakan dalam bahagian perbincangan.


Perbincangan

Walaupun sel T CAR telah menunjukkan kejayaan dalam merawat beberapa jenis kanser hematologi, penggunaannya akan memerlukan penghalusan lanjut untuk serangan ke atas tumor pepejal. Had dalam ketersediaan biomarker, penghantaran sel T CAR yang tidak mencukupi, dan persekitaran imunosupresif yang meningkat dalam tumor mungkin menyumbang kepada prestasi sel T CAR yang lemah dalam rawatan tumor pepejal (31). Halangan fizikal, seperti ECM padat yang membungkus tumor, atau sifat vaskular yang menghalang lekatan dan diapedesis sel T CAR juga boleh menjejaskan keberkesanannya (31). Malah, banyak tumor pepejal menekan imuniti melalui ekspresi protein pusat pemeriksaan seperti PD-L1, yang melibatkan reseptor perencatan yang sepadan pada sel T (23). PD-L1 belum dieksploitasi sebagai sasaran untuk sel T CAR dalam vivo.

Mewujudkan persekitaran tempatan yang lebih radang mungkin bermanfaat untuk mengatasi penindasan imun. Antibodi monoklonal yang menghalang perkembangan vaskular tumor dengan menyasarkan VEGF, atau terapi sitokin seperti penyediaan IL2 atau IL-12, boleh meningkatkan keradangan dalam tumor untuk kawalan imun yang lebih berkesan (27, 32 ⇓ -34). Pembebasan sitokin oleh sel T CAR yang diaktifkan mungkin membantu mewujudkan keadaan setempat yang diperlukan, di samping memberikan kesan sitolitiknya. Oleh itu, kami menghasilkan sel T CAR yang sama ada menyasarkan protein pusat pemeriksaan PD-L1 atau ECM stromal tumor dan neovasculature melalui EIIIB, varian sambatan fibronektin yang dinyatakan dengan kuat dalam kedua-dua tumor murine dan manusia, kedua-duanya diiktiraf oleh NJB2 VHH (25, 29). Kesukaran utama dalam membangunkan sel T CAR untuk rawatan tumor pepejal adalah kekurangan antigen yang boleh disasarkan. Kebanyakan antigen yang dicadangkan sebagai sasaran sel T CAR untuk merawat tumor pepejal adalah eksklusif untuk jenis kanser tertentu, dan maklumat terhad tentang antigen khusus kanser untuk sebahagian besar tumor pepejal meletakkan banyak tumor di luar jangkauan terapi sel T CAR (35). Dengan menyasarkan penanda dalam persekitaran mikro tumor yang dinyatakan dalam pelbagai tumor, sel T CAR yang diterangkan di sini menunjukkan serba boleh untuk beberapa model tumor yang berbeza. Mereka mempunyai potensi untuk menyasarkan kanser lain yang kekurangan antigen khusus tumor yang dikenal pasti. PD-L1 diekspresikan secara berlebihan pada kebanyakan tumor dan pada sel imun dalam persekitaran mikro tumor (36). EIIIB dinyatakan dalam neovaskulatur dan stroma tumor daripada pelbagai subtipe tumor (25). VHH yang disasarkan EIIIB telah pun diuji terhadap panel biopsi metastasis tisu manusia multiorgan dan bertindak balas dengan set sampel tumor yang pelbagai, seterusnya menunjukkan kemungkinan penggunaan luas sel T B2 CAR (29).

Kami mengoptimumkan pengeluaran sel CAR T berasaskan VHH dan mengesahkan fungsinya secara in vitro dan in vivo dengan ujian pengikat ligan langsung, sitotoksisiti, pengeluaran sitokin dan perencatan pertumbuhan tumor. Sel T CAR berasaskan VHH yang mengiktiraf PD-L1 menunjukkan sitotoksisiti spesifik ligan dan berkesan dalam model tumor syngeneik yang sangat agresif dalam tikus imunokompeten tanpa kekurangan imunodeplesi terlebih dahulu. Selagi sistem imun menyumbang kepada pembasmian tumor pepejal, seperti dalam kes melanoma, limfodeplesi mungkin mempunyai kesan buruk yang ketara. Kami mencadangkan bahawa mod tindakan untuk sel T CAR yang disasarkan PD-L1 ini adalah sekurang-kurangnya dua kali ganda. Pertama, sel T CAR anti-PD-L1 memberikan sitotoksisiti langsung dan menghasilkan sitokin. Kedua, pengikatan CAR ke molekul pusat pemeriksaan yang berkaitan harus menyekat interaksinya dengan ligan semula jadi pada sel T perumah, mengakibatkan penindasan dan keletihan imun yang kurang. In vitro, sel CAR T yang disasarkan PD-L1 menunjukkan sitotoksisiti terhadap beberapa jenis tumor pepejal, termasuk melanoma B16, adenokarsinoma kolon MC38 dan garisan sel yang diubah suai C3.43 HPV. Dalam vivo, sel T CAR yang disasarkan PD-L1 menghalang pertumbuhan tumor B16 dan MC38 dengan ketara dan memberikan manfaat kelangsungan hidup.

Pengeluaran sel T CAR anti-PD-L1 adalah rumit oleh fakta bahawa sel T WT mengekspresikan tahap endogen PD-L1 yang rendah. Sel T CAR anti−PD-L1 yang dijana dalam latar belakang WT oleh itu sentiasa mengalami tahap pendedahan antigen yang rendah. Ini membawa kepada beberapa tahap keletihan sel T dan menjejaskan fungsi, kegigihan in vivo, dan percambahan sel T CAR. Fenomena ini tidak unik kepada sasaran PD-L1, kerana beberapa antigen tumor yang diingini juga dinyatakan pada tahap rendah di tempat lain dalam tumor, kerana, dengan pengecualian neoantigen, sangat sedikit antigen khusus tumor yang wujud. Kami menemui dua cara untuk mengatasi halangan ini. Pertama, tikus yang dirawat dengan sel T CAR anti-PD-L1 yang dihasilkan dalam latar belakang kekurangan PD-L1 menunjukkan kelewatan dalam pertumbuhan tumor, menunjukkan bahawa sel T CAR berasaskan VHH ini sememangnya berkesan dalam rawatan tumor. Kedua, dengan menghasilkan sel T CAR anti-PD-L1 dengan kehadiran berterusan dos tepu bagi larutan anti-PD-L1 VHH dalam larutan, penglibatan paksi PD-1/PD-L1 disekat, dan CAR T yang terhasil sel mengekalkan keberkesanan dalam vivo. Ablasi genetik PD-L1 menggunakan CRISPR-Cas9 dalam proses penjanaan CAR juga mungkin, tetapi melibatkan pengubahsuaian genetik sebagai tambahan kepada penyediaan konstruk CAR (37). Oleh itu, kami lebih suka penyediaan ektodomain CAR dalam bentuk larut dalam proses menghasilkan sel T CAR anti-PD-L1. Dalam eksperimen kami, kami tidak melihat kesan tidak diingini yang jelas apabila pemindahan sel T CAR ini pada tahap suntikan kami. Kami melihat penurunan dalam sel CD11b+, yang sangat positif PD-L1, tetapi tidak melihat perubahan ketara dalam populasi imun yang lain. Penjanaan sel CAR T yang disasarkan PD-L1 dalam latar belakang WT tidak mengakibatkan fratricide, mungkin disebabkan oleh pengasingan ligan PD-L1 oleh PD1 pada permukaan sel T dalam cis, seperti yang dilaporkan untuk sel pembentang antigen (APC) (38), atau tahap ekspresi PD-L1 yang tidak mencukupi untuk mendorong pembunuhan.

Menyasarkan ECM tumor atau neovasculature dalam persekitaran mikro tumor dan bukannya tumor secara langsung boleh berfungsi sebagai kaedah lain untuk menyasarkan berbilang jenis tumor. Oleh kerana kebanyakan tumor pepejal memerlukan angiogenesis untuk menyediakan nutrien untuk kelangsungan hidup, menyasarkan penanda stromal dan neoangiogenik mungkin merupakan strategi yang berdaya maju (39). Sesungguhnya, sel T EIIIB + fibronektin CAR (B2 CAR) yang disasarkan kepada tumor ECM dan neovasculature menghalang pertumbuhan melanoma B16 yang agresif dalam tetikus imunokompeten. Tumor B16 sangat positif untuk EIIIB seperti yang dinilai oleh IHC. Tumor B16 yang dirawat oleh sel B2 CAR T kebanyakannya nekrotik dan menunjukkan kerosakan vaskular dan stroma, melambatkan pertumbuhan tumor, kerana lebih sedikit nutrien boleh dihantar untuk menyokong pertumbuhan tumor. Tisu tumor yang dirawat yang belum lagi nekrotik menunjukkan penyusupan sel imun, menunjukkan bahawa sel B2 CAR T dan mungkin sel imun endogen lain menyetempat kepada ECM dan vaskular tumor yang rosak. Sebaliknya, tumor MC38, yang menunjukkan kurang ekspresi varian sambatan fibronektin EIIIB, gagal bertindak balas terhadap rawatan dengan sel T CAR anti-EIIIB. Walaupun tumor pepejal mungkin berkongsi keperluan untuk ECM dan angiogenesis, tidak semua tumor memaparkan varian FN EIIIB secara sama rata. Adalah mungkin untuk mengenal pasti penanda vaskular dan stromal lain yang mungkin mempunyai tujuan yang sama. Model sel B2 CAR T ini menyerlahkan lagi kepentingan menggunakan model haiwan syngeneik untuk rawatan sel T CAR. Apabila tikus RAG -/− yang disuntik dengan B16 dirawat dengan sel T CAR B2, manfaat kelangsungan hidup telah hilang, menonjolkan kepentingan sistem imun endogen dalam bersinergi dengan rawatan CAR. Tidak seperti rawatan sel B2 CAR T, apabila rawatan sel T A12 CAR T diuji dalam tikus RAG -/−, kami melihat manfaat kelangsungan hidup. Memandangkan PD-L1 dinyatakan oleh sel tumor sebenar, tidak seperti EIIIB, manfaat kelangsungan hidup akan dijangkakan. Walau bagaimanapun, dengan rawatan sel CAR T yang disasarkan EIIIB, mungkin menjejaskan matriks membolehkan penyusupan imun yang lebih besar dan pembentukan tindak balas imun endogen kepada antigen secara langsung pada tumor itu sendiri, menjelaskan mengapa rawatan berkesan dalam tikus imunokompeten tetapi tidak. dalam tikus immunodeficient.

Menyasarkan neovaskulatur tumor dan stroma tumor dengan sel T CAR yang disasarkan EIIIB mungkin bukan sahaja menjejaskan bekalan darah tumor, ia juga mungkin berfungsi sebagai cara untuk meningkatkan kebolehcapaian tumor untuk ubat molekul kecil dan terapi lain yang boleh digunakan dalam kombinasi. dengan sel T CAR, walaupun hanya sementara. Sama seperti terapi yang menggabungkan antibodi penyekat pusat pemeriksaan yang berbeza, laluan yang paling mungkin ke hadapan untuk tumor pepejal terletak pada gabungan sel T CAR dengan antibodi, radiasi atau ubat molekul kecil. Daripada eksperimen kami dengan kedua-dua sel CAR T yang disasarkan PD-L1 dan EIIIB, kami menyimpulkan bahawa pendekatan CAR berasaskan VHH adalah sangat modular dan boleh digunakan secara meluas untuk pelbagai tumor. Setelah VHH dengan kekhususan yang sesuai telah dikenal pasti, ia boleh dimasukkan ke dalam tulang belakang CAR untuk ekspresi tanpa memerlukan pengubahsuaian dan pengoptimuman penyambung yang menghubungkan VH dan VL, yang merupakan sebahagian daripada sel T CAR berasaskan scFv. Platform untuk menghasilkan sel T CAR berasaskan VHH memperluaskan julat tumor syngeneik yang boleh disasarkan oleh sel T CAR dalam model murine imunokompeten sepenuhnya. VHH menarik sebagai domain pengecaman antigen untuk sel T CAR, kerana ia mudah dinyatakan dan tidak mempunyai kebimbangan kestabilan yang jelas (9, 11, 40 ⇓ -42).

Model tetikus immunodeficient masih merupakan model yang paling biasa digunakan dalam penyelidikan sel T CAR (43 ⇓ –45). Mereka bermanfaat kerana model tumor manusia dan sel T CAR boleh dikaji, tetapi juga mengalami beberapa kelemahan. Tanpa kehadiran imuniti semula jadi dan adaptif yang utuh, model haiwan ini tidak menggambarkan dengan tepat potensi penindasan imun yang mungkin berlaku di klinik. Penggunaan tikus imunokompeten sebagai model tumor mempunyai faedah tambahan imuniti endogen dan dengan lebih tepat menggambarkan kesan klinikal dan menggambarkan semula tahap keberkesanan. Pembangunan terapi yang tidak memerlukan pengurangan imun akan kelihatan lebih diingini, kerana imuniti antitumor endogen memainkan peranan yang besar dalam pengawasan tumor (46). Berbanding dengan model xenograf, model imunokompeten juga membolehkan penilaian profil keselamatan rawatan yang lebih baik.

Keputusan daripada model ini menunjukkan kebolehlaksanaan dan keberkesanan sel T CAR yang menyasarkan persekitaran mikro tumor terhadap tumor pepejal yang agresif dalam sistem imunokompeten sepenuhnya. Model kami menunjukkan kebolehgeneralisasian merentas pelbagai jenis tumor. Usaha masa depan harus ditujukan kepada penggabungan terapi gabungan, termasuk sekatan pusat pemeriksaan dan terapi sitokin untuk meningkatkan lagi rawatan tumor pepejal.


Latar belakang

Tumor mengelakkan pengesanan dan serangan imun melalui pelbagai mekanisme yang memintas tindak balas anti-tumor. Hipermetilasi DNA, walaupun boleh diterbalikkan, boleh menyenyapkan ekspresi antigen imunogenik ini menjadikan sistem imun kurang berkesan, terutamanya semasa campur tangan imunoterapeutik [1]. Tumor juga merekrut sel imun pengawalseliaan, termasuk MDSC, yang melembapkan tindak balas imun adaptif. Pesakit dengan tahap MDSC yang beredar yang lebih tinggi telah meningkatkan pertumbuhan tumor primer [2], beban metastatik yang lebih tinggi [3], peringkat kanser klinikal yang lebih maju [4, 5], dan kelangsungan hidup keseluruhan yang lebih pendek [3, 6]. Berdasarkan penemuan ini dan pelbagai laporan dalam model tetikus yang membabitkan MDSC sebagai halangan utama kepada imunoterapi kanser yang berjaya, terdapat banyak minat untuk menghapuskan sifat menindas MDSC untuk meningkatkan hasil pesakit [7,8,9,10].

Petak myeloid dalam kanser telah dikaji secara meluas, terutamanya MDSC [11]. MDSC dibahagikan kepada dua subset, MDSC monocytic dan granulocytic. Kedua-dua jenis MDSC telah terbukti menindas dalam kedua-dua model tumor murine dan dalam beberapa kanser manusia. MDSC monocytic menjana oksida nitrik sebagai mekanisme penindasan, manakala MDSCs granulocytic mengekspresikan sejumlah besar spesies oksigen reaktif dan arginase-1 yang mengakibatkan penindasan fungsi sel T [11]. MDSC telah ditemui dalam limpa, darah, hati, dan tumor haiwan yang membawa tumor. Sel-sel penindas ini didapati terkumpul dalam pelbagai jenis model tumor murine dan kanser manusia, daripada model karsinoma hepatik murine [12], model kanser payudara [13], kepada kanser ovari manusia [14], dan banyak lagi.

Makmal kami sebelum ini telah menerbitkan mengenai kesan perencat DNA methyltransferase (DNMTi), decitabine. Menggunakan garis kanser payudara murine yang agresif, 4 T1, kami mendapati bahawa decitabine meningkatkan imunogenisiti sel-sel ini secara in vitro, dan menambah kesan imunoterapi pakai (AIT) dalam vivo [10]. Walaupun decitabine menyebabkan pengurangan pengumpulan MDSC yang disebabkan oleh tumor, mekanisme asas di sebalik ini tidak pernah disiasat. Dalam kajian semasa kami, kami telah mengembangkan penemuan ini dengan DNTMi generasi kedua, guadecitabine, dan menyiasat mekanisme tindakannya dalam pengurangan tumor. Seperti decitabine metabolit aktif, kami mendapati bahawa guadecitabine mengurangkan granulositosis yang disebabkan oleh tumor dalam 4 tikus yang membawa tumor T1. Hasil daripada pengumpulan MDSC yang dikurangkan, guadecitabine menyelamatkan pengaktifan imun dan dapat mengurangkan pertumbuhan tumor dalam cara yang bergantung kepada sel T. Guadecitabine juga berkesan dalam model E0771 karsinoma payudara murine.Akhirnya, kami mendapati bahawa guadecitabine dalam kombinasi dengan AIT menghasilkan kelangsungan hidup yang berpanjangan dalam kedua-dua 4 model kanser payudara T1 dan E0771. Oleh kerana kesan berfaedah ini, guadecitabine boleh terbukti sebagai ubat baharu yang bermanfaat untuk mengurangkan penindasan imun sistemik dan menambah keberkesanan imunoterapi dalam pesakit kanser.


Perbincangan

Dalam laporan ini, kami secara kolektif mengkaji tujuh mutasi berkaitan ASD Cttnbp2 daripada aspek biokimia, biologi sel dan fisiologi. Berdasarkan analisis kami, kami mencirikan kesan tiga mutasi penyebab penyakit yang berpotensi, iaitu M120I, R533* dan D570Y. Ketiga-tiga mutasi ini mengakibatkan kecacatan tulang belakang dendritik yang menonjol dalam neuron hippocampal berbudaya, serta dalam otak tetikus. Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari kesan ketiga-tiga mutasi ini pada pembentukan tulang belakang dendritik berbeza, mewakili contoh ilustrasi bagaimana mekanisme berbeza menyumbang kepada etiologi ASD, walaupun untuk mutasi gen yang sama, namun menghasilkan hasil konvergen.

Kedua-dua mutasi M120I dan R533* menjejaskan interaksi CTTNBP2 dengan cortactin, tetapi mekanisme asasnya berbeza. Protein mutan R533* tidak mempunyai domain C-terminal P kaya CTTNBP2, jadi ia tidak mempunyai keupayaan untuk berinteraksi dengan cortactin. Kami mendapati bahawa overexpression cortactin menyelamatkan kecacatan tulang belakang dendritik yang disebabkan oleh mutasi R533*, mengesahkan peranan kritikal untuk cortactin dalam laluan CTTNBP2. Oleh kerana CTTNBP2 bertindak sebagai perancah sinaptik untuk mengawal penyasaran sinaptik protein lain, seperti SHANKs, NMDAR dan subunit pengawalseliaan protein fosfatase 2A STRN [20], kemungkinan besar pengesan hiliran CTTNBP2 dan cortactin juga bercakap silang dengan protein terkawal CTTNBP2 yang lain. dan seterusnya mengawal pembentukan tulang belakang dendritik.

Mutasi M120I mengganggu interaksi terminal N-C protein CTTNBP2, menghalang interaksi cortactin. Ekspresi berlebihan Cortactin juga menyelamatkan defisit tulang belakang dendritik yang disebabkan oleh mutasi M120I, seterusnya mengesahkan penglibatan cortactin dalam cara CTTNBP2 mengawal pembentukan tulang belakang dendritik dan fungsi neuron. Sudah tentu, ada kemungkinan interaksi N-C yang terganggu juga mempengaruhi interaksi protein-protein lain CTTNBP2 dan menjejaskan koordinasi cortactin dan protein lain yang berinteraksi CTTNBP2. Selain daripada domain CC terminal Nnya, CTTNBP2 secara intrinsik tidak berstruktur, memberikan fleksibiliti yang diperlukan untuk interaksi N-C intra dan/atau antara molekul. Walau bagaimanapun, fleksibiliti ini juga menyukarkan untuk menjalankan kristalografi sinar-X pada CTTNBP2. Kami telah berulang kali mencuba untuk membersihkan protein CTTNBP2 rekombinan penuh. Mungkin disebabkan sifatnya yang tidak berstruktur, protein rekombinan tidak stabil dalam sistem ekspresi bakteria. Akibatnya, setakat ini, tidak diketahui sepenuhnya bagaimana kawasan terminal N dan C CTTNBP2 berinteraksi antara satu sama lain dan bagaimana kawasan terminal N CTTNBP2 boleh mengawal interaksi antara domain kaya P terminal C dan cortactin.

Di sini, kami telah melaporkan bahawa interaksi terminal N-C memudahkan interaksi CTTNBP2 C-terminal dengan cortactin, dengan yang terakhir ini terganggu oleh mutasi M120I. Kemudahan seperti ini tidak jarang berlaku dalam pengawal selia sitoskeleton. Sebagai contoh, N-WASP ialah transduser isyarat teras yang menerima isyarat daripada CDC42 dan mengarahkan pempolimeran aktin yang bergantung kepada Arp2/3 [1]. Interaksi terminal N-C intramolekul N-WASP menutup tapak pengikatan Arp2/3 untuk menghalang pempolimeran aktin [16]. Begitu juga, sifat pengikatan dan penstabilan mikrotubule mPar3 difasilitasi oleh interaksi terminal N-C intramolekul [3]. Oligomerisasi intermolekul mPar bersaing untuk interaksi terminal N-C intramolekul, mendedahkan domain pengikat mikrotubule mPar3 [3]. Kajian kami tentang CTTNBP2 menyediakan contoh baharu pengawal selia sitoskeleton yang dimodulasi oleh interaksi N-Cnya.

Walaupun mutasi D570Y juga mengurangkan ketumpatan tulang belakang dendritik, mekanisme asas adalah berbeza daripada mutasi M120I dan R533*. Perkaitannya yang lebih tinggi untuk mikrotubul menyebabkan varian ini lebih suka kekal dalam aci dendritik daripada bergerak ke dalam duri dendritik. Pengurangan tahap protein CTTNBP2 pada duri dendritik menyerupai hasil daripada Cttnbp2 knockdown atau kalah mati, mengakibatkan ketumpatan tulang belakang dendritik yang lebih rendah. Walau bagaimanapun, selain daripada defisit tulang belakang dendritik, pengikatan protein mutan D570Y kepada mikrotubulus di sepanjang aci dendritik dan seterusnya meningkatkan kestabilan mikrotubulus mungkin menyumbang kepada fenotip lain yang timbul daripada mutasi D570Y. Kemungkinan terakhir ini memerlukan siasatan lanjut. Menariknya, residu D570 terletak sangat dekat dengan hujung terminal-C bentuk pendek CTTNBP2 (630 residu asid amino) [5]. Data kami sebelum ini menunjukkan bahawa kawasan tidak berstruktur tengah CTTNBP2 diperlukan untuk persatuan dengan microtubule [21]. Oleh itu, rantau C-terminal CTTNBP2 juga boleh mengawal selia interaksi protein yang dimediasi oleh kawasan tengahnya, yang mungkin berkaitan dengan sifat CTTNBP2 yang tidak berstruktur secara intrinsik. Kajian kami menunjukkan bahawa struktur protein CTTNBP2 adalah sangat fleksibel dan mempamerkan interaksi dan peraturan diri yang kompleks.

Dalam laporan ini, kami memberi tumpuan terutamanya pada kecacatan tulang belakang dendritik, dengan mutasi R533* dan M120I mengakibatkan fenotip yang paling teruk. Untuk mutasi lain yang disiasat, seperti R42W dan G342R, kesannya terhadap ketumpatan tulang belakang dendritik adalah lebih ringan. Tidak seperti protein WT yang sedikit meningkatkan ketumpatan tulang belakang dendritik, ekspresi berlebihan mutan R42W dan G342R tidak dapat berbuat demikian. Hasil ini menunjukkan bahawa R42W dan G342R berkemungkinan mewakili mutasi kehilangan fungsi. Selain daripada pengaruhnya pada duri dendritik, CTTNBP2 juga mengawal arborisasi dendritik [21]. Memandangkan CTNNBP2 juga terdapat di sepanjang aci akson, ia juga bermakna untuk menyiasat jika mutasi berkaitan ASD ini mempengaruhi arborisasi dendritik dan/atau pertumbuhan akson, yang mungkin juga menyumbang kepada fenotip ASD.

Diambil bersama dengan kajian terdahulu kami [20], kami kini telah menganalisis ciri-ciri tingkah laku Cttnbp2/− , Cttnbp2 +/− , R533* dan tikus mutan M120I. Interaksi sosial yang berkurangan dengan orang yang tidak dikenali dalam interaksi sosial timbal balik dan ujian tiga ruang adalah kecacatan biasa yang dikongsi di antara semua garis tetikus mutan yang diperiksa ini. Oleh kerana interaksi sosial yang rosak adalah salah satu gejala teras ASD, kajian tetikus kami menyokong bahawa mutasi CTTNBP2 sekurang-kurangnya sebahagiannya bertanggungjawab untuk ASD. Walaupun kecacatan sosial biasa ini, defisit tingkah laku lain tidak ditunjukkan oleh semua garis tetikus yang diperiksa. Sebagai contoh, Cttnbp2/- tikus mempamerkan keabnormalan tingkah laku yang paling teruk, termasuk pergerakan hiperaktif, tingkah laku anxiolytic dalam ujian maze dan marmar yang tinggi, dan memori kontekstual terjejas dalam pengecaman objek novel [20]. Walau bagaimanapun, Cttnbp2 +/Tikus mutan −, R533* dan M120I tidak menunjukkan sebarang fenotip yang ketara dari segi pergerakan atau kebimbangan. Oleh itu, adalah bermaklumat untuk mengaitkan mutasi dan gejala pesakit dengan fenotip yang dipaparkan oleh model tetikus kami. Analisis sedemikian akan memberikan maklumat berguna sama ada ujian tingkah laku tetikus, sekurang-kurangnya untuk Cttnbp2 tikus mutan, adalah relevan dengan keadaan pesakit dan boleh berfungsi sebagai model yang sesuai untuk kajian etiologi dan terapeutik.


Tonton video: 백신접종 현지상황 실화임? 처음 느껴본 말레이시아 의료시스템 (Februari 2023).