Maklumat

Ungkapan pendarfluor merah dan hijau dalam tisu yang sama

Ungkapan pendarfluor merah dan hijau dalam tisu yang sama


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dalam artikel ini (https://jcs.biologists.org/content/122/14/2351), terutamanya dalam Rajah 1 dan 2, mereka menunjukkan ekspresi GFP dan pendarfluor merah dalam tisu yang sama, dan saya rasa seperti merah itu. pendarfluor hadir di mana GFP dinyatakan (walaupun lebih lemah daripada di mana GFP tidak hadir), tetapi saya tertanya-tanya mengapa ia tidak kuning? Biasanya, apabila kedua-dua ini dinyatakan dalam sel yang sama (dalam kes ini, GFP berada dalam sitoplasma dan merah menunjukkan protein membran), warna kuning diperhatikan, bukan seperti ini. Dalam artikel ini, saya rasa seperti saya melihat beberapa merah di bawah hijau jika itu masuk akal…

Jika sesiapa tahu maksud ini, sila berikan saya nasihat! Terima kasih.


Imej ini biasanya tidak diambil menggunakan kamera berwarna. Mereka diambil menggunakan kamera skala kelabu, menggunakan penapis yang membenarkan panjang gelombang pengujaan untuk memukul sampel dan panjang gelombang pelepasan pergi ke kamera.

Untuk visualisasi, imej hitam dan putih ini sering dimasukkan ke dalam saluran merah atau hijau dalam imej digital (TV dan monitor komputer membuat warna dengan mencampurkan jumlah cahaya merah, hijau dan biru yang berbeza: RGB). Jika anda mempunyai merah dan hijau bersama-sama yang menunjukkan kuning kepada mata manusia, tetapi itu tidak bermakna sebarang cahaya kuning terlibat: ia hanya persepsi.

Jika anda tidak nampak kuning dalam imej ini, ini adalah kerana pelepasan merah dan hijau tidak berada di tempat yang sama.


Protein pendarfluor merah eqFP611: aplikasi dalam kajian penyetempatan subselular dalam tumbuhan yang lebih tinggi

Protein pendarfluor intrinsik telah merevolusikan kajian dalam biologi sel molekul. Aplikasi selari protein ini dalam eksperimen dwi-atau multilabel seperti kajian penyetempatan subselular memerlukan spektrum pelepasan tidak bertindih untuk pengesanan yang jelas bagi setiap label. Dalam julat spektrum merah, hampir secara eksklusif DsRed dan derivatifnya digunakan hari ini. Untuk menguji kesesuaian protein pendarfluor merah eqFP611 sebagai alternatif dalam tumbuhan yang lebih tinggi, tingkah laku protein ini dianalisis dari segi ekspresi, penyasaran subselular dan keserasian dengan GFP dalam tembakau.

Keputusan

Apabila dinyatakan secara sementara dalam protoplas tembakau, eqFP611 terkumpul sepanjang malam ke tahap yang mudah dikesan oleh mikroskop pendarfluor. Protein asli ditemui dalam nukleus dan dalam sitosol dan tiada kesan buruk terhadap daya maju sel diperhatikan. Apabila digabungkan dengan jujukan penargetan mitokondria dan peroksisom N-terminal, pendarfluor merah terletak secara eksklusif dalam organel yang sepadan dalam protoplas yang ditransmisikan. Apabila ekspresi bersama dengan GFP dalam sel yang sama, pendarfluor kedua-dua eqFP611 dan GFP boleh dibezakan dengan mudah, menunjukkan potensi eqFP611 dalam eksperimen dwi-pelabelan dengan GFP. Satu siri plasmid telah dibina untuk ekspresi eqFP611 dalam tumbuhan dan untuk ekspresi serentak protein pendarfluor ini bersama-sama dengan GFP. Tumbuhan tembakau transgenik secara konstitutif menyatakan eqFP611 yang disasarkan secara mitokondria telah dihasilkan. Pendarfluor merah telah dihantar secara stabil kepada generasi berikut, menjadikan tumbuhan ini sumber mudah untuk protoplas yang mengandungi penanda dalaman untuk mitokondria.

Kesimpulan

Dalam tumbuhan, eqFP611 ialah protein wartawan pendarfluor yang sesuai. Protein yang tidak diubahsuai boleh diekspresikan ke tahap yang mudah dikesan oleh mikroskop epifluoresensi tanpa kesan buruk terhadap daya maju sel tumbuhan. Penyetempatan subselularnya boleh dimanipulasi oleh urutan isyarat N-terminal. eqFP611 dan GFP serasi sepenuhnya dalam eksperimen dwi-pelabelan.


Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G. Ward, W. W., dan Prasher, D. C. (1994) Green Fluorescent Protein sebagai penanda untuk ekspresi gen. Sains 263, 802–805.

Prasher, D. C. (1995) Menggunakan GFP untuk melihat cahaya. Trend Genet. 11, 320–323.

Heim, R., Prasher, D. C., dan Tsien, R. Y. (1994) Mutasi panjang gelombang dan autooksidasi pasca translasi protein pendarfluor hijau. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 12501–12504.

Heim, R., Cubitt, A. B., dan R. Y. Tsien (1995) Peningkatan pendarfluor hijau. alam semula jadi 373, 663–664.

Yang, F., Moss, L. G., dan Phillips, G. N. (1996) Struktur molekul Protein Pendarfluor Hijau, Bioteknologi Alam Semula Jadi 14, 1246–1251.

Ormo, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A. Tsien, R. Y., dan Remington, S. J. (1996) Struktur kristal protein pendarfluor hijau Aequorea victoria. Sains 273, 1392–1395.

Sanger, J. M., Danowski, B. A., dan Sanger, J. W. (2000) Microinjection alpha-actinin berlabel pendarfluor ke dalam sel hidup. Dalam: Kaedah dalam Biologi Molekul: Protokol Biologi Perkembangan (Editor: Tuan, R. S. dan Lo, C. W.), Humana Press Vol. III, 449–456.

Dabiri, G. A., Turnacioglu, K. K., Sanger, J. M., dan Sanger, J. W. (1997) Myofibrillogenesis digambarkan dalam kardiomiosit embrionik hidup. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9493–9498.

Doyle, T. dan Botstein, D. (1996) Pergerakan sitoskeleton aktin kortikal yis dalam vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3886–3891.

Ayoob, J. C., Turnacioglu, K. K., Mittal, B., Sanger, J. M., dan Sanger, J. W. (2000) Menyasarkan Serpihan Titin Digandingkan dengan Protein Pendarfluor Hijau Kepada Z-band Dalam Kardiomiosit Hidup. Motil Sel. Sitoskeleton 45, 67–82.

Moores, S. L., Sabry, J. H., dan Spudich, J. A. (1996) Dinamik Myosin secara langsung Dictyostelium sel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 443–446.

Gerisch, G., Albrecht, R., Heizer, C., Hodgkinson, S., dan Maniak, M. (1995) Pengumpulan coronin yang dikawal oleh chemoattractant di pinggir utama sel Dictyostelium yang dipantau Curr. biol. 5, 1280–1285 (1995).

Heim, R. and Tsien, R. Y. (1996) Kejuruteraan protein pendarfluor hijau untuk kecerahan yang lebih baik, panjang gelombang yang lebih panjang dan pemindahan tenaga pendarfluor. Curr. biol. 6, 178–182.

Matz, M. V., Fradkov, A. F., Labas, Y. A., et al. (1999) Protein pendarfluor daripada spesies Anthozoa bukan bioluminescent. Bioteknol Alam Semulajadi 17, 969–973.

Lazarides, E. dan Burridge, K. (1975) Alpha-actinin: penyetempatan immunofluorescent protein struktur otot dalam sel bukan otot. sel 6, 289–298.

Zhukarev, V., Sanger, J. W., Sanger, J. M., Goldman, Y., dan Shuman, H. (1997) Analisis polarisasi pendarfluor keadaan mantap rhodamine phalloidin yang mengikat otot. Motil Sel. Sitoskel. 37, 363–377.

Dabiri, G. A., Ayoob, J. C., Turnacioglu, K. K. Sanger, J. M., dan Sanger, J. W. (1999) Penggunaan Protein Pendarfluor Hijau yang dikaitkan dengan protein sitoskeletal untuk menganalisis myofibrilogenesis dalam sel hidup. Kaedah dalam Enzimologi 302, 171–186.

Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., dan Schorr, J. (1995) Kesan lipopolysaccharide pada kecekapan transfeksi dalam sel eukariotik. BioTeknik 19, 930–940.

Turnacioglu, K. K., Sanger, J. W., dan Sanger, J. M. (1998) Tapak penggabungan aktin monomerik dalam sel PtK2 dan REF-52 yang hidup. Motil Sel. Sitoskel. 40, 59–70.

Dabiri, G. A., Turnacioglu, K. K., Ayoob, J. C., Sanger, J. M., dan Sanger, J. W. (1999) Transfeksi kultur sel otot primer dengan pengekodan plasmid untuk GFP dikaitkan dengan protein otot panjang penuh dan terpotong. Kaedah dalam Biologi Sel 58, 239–260.

Sanger, J. M. dan Sanger, J. W. (2000) Perhimpunan protein sitoskeletal ke dalam alur belahan sel kultur tisu. Mikroskopi Res. Tech. 49, 190–201.


Antibodi utama sebagai probe

Beribu-ribu antibodi utama tersedia secara komersial untuk sasaran protein dengan sejarah penyiasatan dalam penyelidikan biologi. Kecuali untuk beberapa sasaran penyelidikan yang sangat popular, antibodi utama ini ditawarkan tanpa teg yang boleh dikesan, dan sejenis kaedah pengesanan sekunder (tidak langsung) diperlukan. Namun begitu, hampir mana-mana antibodi boleh dilabelkan dengan biotin, enzim HRP atau salah satu daripada beberapa fluorofor jika diperlukan.

Bergantung pada aplikasi yang akan dilakukan, tahap ketulenan dan jenis kekhususan yang berbeza diperlukan dalam antibodi primer yang dibekalkan. Untuk menamakan hanya beberapa parameter, antibodi mungkin monoklonal atau poliklonal, dibekalkan sebagai penyelesaian antiserum atau penulen pertalian, dan disahkan untuk protein asli atau pengesanan protein ternyahatur.

Jika tiada antibodi wujud untuk antigen yang diminati, antibodi baru boleh dihasilkan (dinaikkan) menggunakan teknik yang mantap untuk mengimunkan haiwan dengan bentuk antigen yang disediakan. Pelbagai reagen tersedia untuk membantu dalam pengeluaran dan penulenan antibodi, dan pelbagai syarikat pakar dalam perkhidmatan pengeluaran antibodi.


Protein pendarfluor boleh tukar foto: alat serba boleh dalam pengimejan rangka ikan zebra

Andy Willaert, Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Bangunan Penyelidikan Perubatan - MRB1, Pintu Masuk 34, Corneel Heymanslaan 10, B-9000 Ghent, Belgium.

Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Biologi Perkembangan Evolusi, Jabatan Biologi, Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Biologi Perkembangan Evolusi, Jabatan Biologi, Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Biologi Perkembangan Evolusi, Jabatan Biologi, Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Ghent, Belgium

Andy Willaert, Pusat Genetik Perubatan, Jabatan Perubatan Biomolekul, Hospital Universiti-Universiti Ghent, Bangunan Penyelidikan Perubatan - MRB1, Pintu Masuk 34, Corneel Heymanslaan 10, B-9000 Ghent, Belgium.

Maklumat pembiayaan: Universiti Ghent, Nombor Geran/Anugerah: BOFMET2015000401, BOF24J2015001401

Abstrak

Salah satu teknik yang paling kerap digunakan dalam ikan zebra (Danio rerio) penyelidikan ialah visualisasi atau manipulasi populasi sel tertentu menggunakan garisan wartawan transgenik. Penjanaan ikan zebra transgenik ini, memaparkan ekspresi khusus sel atau tisu bagi fluorofor yang kerap digunakan seperti Protein Pendarfluor Hijau (GFP) atau mCherry, adalah agak mudah menggunakan teknik moden. Fluorofor dengan panjang gelombang pelepasan yang berbeza dan didorong oleh promoter yang berbeza boleh dipantau secara serentak dalam haiwan yang sama. Protein pendarfluor boleh tukar foto (pcFPs) adalah berbeza daripada fluorofor standard ini kerana spektrum pelepasannya ditukar apabila terdedah kepada cahaya UV, satu proses yang dipanggil penukar foto. Di sini, faedah dan kepelbagaian penggunaan pcFP untuk kedua-dua pengimejan fluorochrome tunggal dan dwi dalam penyelidikan rangka ikan zebra dalam yang dihasilkan sebelum ini. osx: Garis transgenik Kaede digambarkan. Dalam baris ini, Kaede, yang dinyatakan di bawah kawalan osterix, atau dikenali sebagai sp7, promoter dengan itu melabelkan osteoblas yang tidak matang, boleh bertukar daripada pendarfluor hijau kepada merah apabila penyinaran dengan cahaya UV. Pertama, kajian ini menunjukkan bahawa osx:Kaede mempamerkan corak ekspresi yang serupa dengan yang diterangkan sebelum ini osx:talian transgenik nuGFP dalam kedua-dua peringkat larva dan dewasa, dengan ini mengesahkan penggunaan garisan ini untuk pengimejan osteoblas yang tidak matang. Percubaan yang lebih mendalam menyerlahkan aplikasi yang berbeza untuk osx:Kaede, seperti pengesanan keturunan dan penggunaan gabungannya dengan dalam vivo pewarnaan rangka dan latar belakang transgenik lain. Pewarnaan mineral dalam kombinasi dengan osx:Kaede mengesahkan mineralisasi bebas osteoblas notochord. Pengesanan garis keturunan Osteoblast mendedahkan penghijrahan dan penyahbezaan skleroblas semasa penjanaan semula sirip. Akhir sekali, kajian ini menunjukkan bahawa menggabungkan dua transgenik, osx:Kaede dan osc:GFP, dengan panjang gelombang pelepasan yang serupa adalah mungkin apabila menggunakan pcFP seperti Kaede.


Gabungan

Jabatan NanoBiophotonics, Institut Max Planck untuk Kimia Biofizik, Am Fassberg 11, Göttingen, 37077, Jerman

Steffen J. Sahl, Stefan W. Hell & Stefan Jakobs

Jabatan Nanoskopi Optik, Institut Penyelidikan Perubatan Max Planck, Jahnstrasse 29, 69120, Heidelberg, Jerman

Pusat Penyelidikan Kanser Jerman (DKFZ), BioQuant, Im Neuenheimer Feld 267, 69120, Heidelberg, Jerman

Jabatan Neurologi, Fakulti Perubatan Universiti Göttingen, Robert-Koch-Strasse 40, 37075, Göttingen, Jerman

Anda juga boleh mencari pengarang ini dalam PubMed Google Scholar

Anda juga boleh mencari pengarang ini dalam PubMed Google Scholar

Anda juga boleh mencari pengarang ini dalam PubMed Google Scholar

Sumbangan

Ketiga-tiga pengarang menyumbang secara sama rata kepada keempat-empat aspek penyediaan artikel (menyelidiki data untuk artikel, sumbangan besar kepada perbincangan kandungan, menulis, dan menyemak dan menyunting manuskrip sebelum penyerahan).

Pengarang yang sepadan


Kaedah

Bahan tumbuhan dan keadaan pertumbuhan

Populus klon P. davidiana × bolleana (dikenali sebagai Shanxin yang, hadiah daripada Prof. Zhang [63], berasal dari Akademi Hutan dan Alam Sekitar Wilayah Heilongjiang, Heilongjiang, China), P. tremula × alba ‘INRA 717-1B4’ (hadiah daripada Prof. Z. Ye, Universiti Georgia, Georgia, Amerika Syarikat, berasal dari Institut Penyelidikan Kebangsaan Perancis untuk Pertanian, Makanan dan Alam Sekitar, Perancis), P. alba × glandulosa '84 K' (diperkenalkan dari Korea Selatan oleh Akademi Perhutanan China, Beijing, China), P. euramericana '74/76' (diperkenalkan dari Itali oleh Akademi Perhutanan China, Beijing, China), P. tomentosa '741' (Universiti Pertanian Hebei, Hebei, China), P. tomentosa 'B331' (Universiti Perhutanan Beijing, Beijing, China), P. tomentosa 'BJHR01' (dibiakkan secara kerjasama di Akademi Pertanian dan Sains Perhutanan Beijing, Beijing, China, dan Universiti Perhutanan Beijing, Beijing, China), P. popularis ‘35–44’ (Akademi Perhutanan Cina, Beijing, China), P. davidiana (hadiah daripada Prof. T. Jiang, Universiti Perhutanan Timur Laut, Heilongjiang, China, berasal dari Heilongjiang, China), P. alba var. piramid (hadiah daripada Prof. C. Xu, Universiti Barat Daya, Chongqing, China, berasal dari Xinjiang, China), P. trichocarpa (Nisqually-1, Amerika Utara) pada mulanya dibiakkan pada medium Murashige & Skoog (MS) (Phytotech, M519) ditambah dengan 3% sukrosa dan 0.6% agar. Pembiakan klon tumbuhan poplar telah dijalankan seperti yang diterangkan oleh Wang et al. [68], dan tumbuhan telah dibiakkan pada medium steril MS di bawah fotokala 16 jam/8 jam siang/malam pada suhu 25 ° C dalam ruang pertumbuhan. Selepas 3 minggu pertumbuhan, tumbuhan berakar dipindahkan ke dalam tanah dan ditanam di bawah fotokala siang/malam 16 jam/8 jam pada suhu 25 ° C dalam ruang iklim. Setelah dipindahkan ke dalam tanah, tumbuhan ditutup dengan penutup lutsinar selama satu minggu untuk mengelakkan kehilangan air yang berlebihan daripada daun. Untuk eksperimen awal, di mana klon poplar disaring, tumbuhan poplar ditanam di dalam ruang iklim selama sebulan sebelum penyusupan. Untuk eksperimen menilai kesan umur tumbuhan dan umur daun P. davidiana × bolleana pada kecekapan ekspresi sementara, lima kelompok tumbuhan in-vitro berumur 3 minggu telah dipindahkan ke tanah pada selang 3 hari. Apabila kumpulan pertama tumbuhan di dalam tanah mencapai umur PI 14 selepas 3-4 minggu pertumbuhan, agroinfiltrasi dilakukan pada daun LPI 4 [39, 40] tumbuhan peringkat perkembangan yang berbeza PI 10, 11, 12, 13, 14, dan pada daun LPI 3–6 daripada tumbuhan PI 12. Untuk eksperimen kemudian, untuk menilai kesan kepekatan AS, fasa pertumbuhan bakteria, ketumpatan sel bakteria, medium penyusupan dan tempoh ungkapan sementara pada kecekapan ungkapan sementara, tumbuhan telah ditanam dalam ruang iklim selama 2 minggu, iaitu, PI

Penyusupan picagari daun

Agrobacterium tumefaciens ketegangan GV3101, A. tumefaciens EHA105, dan A. rhizogenes C58C1 diperolehi daripada makmal, dan A. tumefaciens strain AGL1 dan LBA4404 telah dibeli daripada Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Sehari sebelum penyusupan, agrobakteria dengan vektor binari tertentu (Rajah S6) bermula daripada klon tunggal pada plat agar telah dikultur dalam medium cecair LB semalaman pada suhu 28 °C pada shaker. Kultur bakteria baharu telah dimulakan pada keesokan harinya dengan menyuntik medium segar dengan kultur ampaian lama (nisbah 1/50, v/v) selama 5-6 jam lagi sehingga OD600

1. Kemudian, kultur dipindahkan ke tiub Eppendorf dan disentrifugasi pada 8000 g selama 2 minit pada suhu bilik dan terampai dalam medium penyusupan yang dilaporkan [10 mM MgCl2, 5 mM MES-KOH (pH 5.6) dan 0.2 mM AS] [29] kepada OD akhir600

1 dalam eksperimen awal. Untuk eksperimen kemudian, kultur agrobakteria digantung dalam medium penyusupan yang diubah suai [10 mM MgCl2, 5 mM MES-KOH (pH 5.6) dan 1.6 mM AS] sebaliknya. Untuk eksperimen yang menilai kesan peringkat pertumbuhan dan kepekatan sel kultur bakteria ke atas kecekapan ekspresi sementara, sama ada kultur semalaman dengan OD600 daripada

2.0 telah digunakan secara langsung untuk penyusupan selepas digantung dalam medium penyusupan yang diubah suai dengan OD akhir600 daripada 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 atau 2.0, atau budaya yang diperbaharui telah ditanam kepada OD akhir600 daripada 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 atau 2.0, dan digantung semula dalam medium penyusupan yang diubah suai dengan OD yang sama seperti budaya asal. Suspensi bakteria diletakkan di dalam gelap selama 1-2 jam pada suhu bilik sebelum agroinfiltrasi.

Tumbuhan yang digunakan untuk penyusupan picagari diterangkan di atas. Suspensi bakteria telah menyusup ke dalam daun poplar melalui stomata dengan menekan hujung picagari 1-mL tanpa jarum pada bahagian bawah daun dan mengenakan tekanan lembut pada pelocok. Biasanya, beberapa suntikan digunakan pada satu daun untuk membesarkan bahagian yang menyusup. Kawasan penyusupan daun dikelilingi oleh pen penanda, berikutan tumbuhan poplar ditanam dalam ruang iklim selama 5 hari dan digunakan untuk penilaian ekspresi gen. Untuk ekspresi bersama dua atau lebih gen sasaran, volum yang sama bagi A. tumefaciens penggantungan dengan OD600

1.0 dalam medium penyusupan dicampur sebelum penyusupan.

Ujian aktiviti LUC

CaMV 35S:LUC vektor (Rajah S6a) ialah hadiah daripada Prof. Wang (Universiti Pertanian China, Beijing, China) [69]. Jumlah protein telah diekstrak daripada kawasan penyusupan daun, dan 50 μL ekstrak protein digunakan untuk mengesan aktiviti luciferase kunang-kunang dengan menggunakan Reagen Pengujian Luciferase (Promega) dan pembaca luminescence (Glo-Max®20/20 Promega) mengikut protokol pengeluar. Kepekatan protein dikira oleh ujian protein Bradford. Aktiviti LUC dikira oleh keamatan cahaya per mikrogram protein. Setiap titik data mewakili sekurang-kurangnya lapan replikasi. Tiga eksperimen bebas telah dilakukan.

Pewarnaan GUS

Daun, kalus dan tumbuhan yang telah diubah dengan pCAMBIA2301-CaMV 35S:GUS-intro (Rajah S6b) telah diwarnakan untuk aktiviti β-glucuronidase (GUS) seperti yang diterangkan [70]. Intron terbitan tumbuhan telah dimasukkan ke dalam GUS untuk mengelakkan ekspresi gen wartawan dalam Agrobacterium.

Penyetempatan subselular dan ujian BiFC

Beberapa protein daripada P. davidiana × bolleana telah disiasat untuk penyetempatan subselular mereka. Untuk menyediakan vektor berteg GFP, kawasan pengekodan bagi CBL1, MTP1, C4H, GT47C, MYB221, dan PrxQ telah dikuatkan oleh tindak balas rantai polimerase transkripsi terbalik (RT-PCR) menggunakan primer khusus, di mana enzim sekatan yang sepadan dimasukkan (Jadual S1), dan kemudian diklonkan ke dalam vektor binari pSuper1300-SUPER:GFP (Gamb. S6c). The A. tumefaciens Suspensi GV3101 yang mengandungi salah satu vektor ini telah menyusup ke dalam LPI 4 daun P. davidiana × bolleana tumbuhan PI 11–12 dengan menggunakan picagari di bawah parameter eksperimen optimum yang diterangkan di atas dalam bahagian Keputusan. Pada 5 dpi, daun yang menyusup telah tertanggal, dan isyarat pendarfluor GFP diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor terbalik Nikon TE2000-E dengan panjang gelombang pengujaan pada 488 nm dan panjang gelombang pancaran pada 510 nm. Untuk mengenal pasti petak subselular, membran plasma diwarnai dengan FM4-64 (20 mg / L, Invitrogen) selama 1 minit, nukleus diwarnai dengan DAPI (1 mg / mL, Sigma) selama 10-20 minit, ER adalah ditunjukkan menggunakan protein gabungan penanda ER HDEL-mCherry [71], dan Golgi ditunjukkan menggunakan protein gabungan penanda Golgi NAG-mCherry [71]. Pendarfluor FM4-64 dikesan dengan pengujaan pada 543 nm dan pelepasan pada 610 nm, dan DAPI dengan pengujaan pada 358 nm dan pelepasan pada 461 nm. Isyarat pendarfluor merah protein gabungan HDEL-mCherry dan NAG-mCherry dipantau pada panjang gelombang pengujaan 543 nm dan panjang gelombang pelepasan 610 nm. Klorofil dikesan oleh auto-pendarfluornya pada pengujaan 488 nm dan pelepasan 681 nm.

Untuk ujian BiFC, kawasan pengekodan bagi DiWRKY40 telah dikuatkan menggunakan primer khusus (Jadual S1) dan diklonkan ke dalam vektor pSPYNE173 (NE) dan pSPYCEM (CE) (Rajah S6e) [72]. Isyarat pendarfluor YFP diperhatikan pada pengujaan 488 nm dan pelepasan 510 nm. Visualisasi nukleus dengan pewarna DAPI telah dijalankan seperti yang diterangkan di atas.

Split luciferase assay

GV3101 Agrobacteria membawa binaan daripada 35S:AtNRT3.1-Nluc, 35S:AtNRT2.1-Cluc, 35S:Nluc, dan 35S:Cluc (Rajah S6f) dikurniakan daripada Prof. Wang (Universiti Pertanian China, Beijing, China). Ujian split-luciferase telah dijalankan seperti yang diterangkan [73] dengan beberapa pengubahsuaian. Secara khusus, daun yang telah berubah telah disusupi dengan 2 mM luciferin dengan menggunakan picagari tanpa jarum pada 5 dpi dan kemudian dibiarkan dalam gelap selama 6 minit untuk memadamkan pendarfluor. Keamatan luminescence telah ditangkap oleh radas pengimejan CCD disejukkan cahaya rendah (Lumazone PyLoN2048B, Roper Scientific) dengan masa pendedahan 5-10 minit apabila kamera disejukkan kepada -110 °C. Pemerolehan imej dikendalikan dan diproses oleh perisian Light Field.

Ujian Western blot dan co-imunoprecipitation

Untuk western blot, daun yang menyusup dengan A. tumefaciens GV3101 atau EHA105 membawa Super:GFP-Bendera (Rajah S6d) dituai pada 5 dpi. Pengekstrakan jumlah protein daripada bahagian daun yang menyusup dan assay western blot dilakukan mengikut Ticconi et al. [71]. Secara ringkas, 15-30 μg protein dipisahkan pada 10% SDS-PAGE. Anti-Flag (MBL) dan anti-Actin (Abmart) digunakan sebagai antibodi utama. Pemerolehan imej telah ditangkap oleh sistem pengimejan sains kawalan jauh CCD (LAS-4000, FUJIFILM). Untuk ujian co-imunoprecipitation, A. tumefaciens GV3101 berlindung Super:PtoUBC34s-Bendera atau Super: PtoMYB221-Myc (Gamb. S6g) digunakan untuk penyusupan. Ujian co-imunoprecipitation telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [47].

Ujian FRET-FLIM

Interaksi antara PtoMYB221 dan PtoUBC34s telah diterangkan dalam kajian terdahulu [47]. Vektor penderma pGreen0029-35S:YFP-PtoUBC34s dan vektor reseptor pGreen0029-35S:PtoMYB221-RFP (Rajah S6h) dipindahkan bersama ke dalam daun poplar melalui Agrobacterium-penyusupan picagari pengantara seperti yang diterangkan di atas. FRET-FLIM telah dilakukan pada mikroskop FV1200 terbalik Olympus yang dilengkapi dengan pengawal Picoquant picoHarp300 (Jerman) mengikut kaedah yang dilaporkan [74]. YFP-PdbUBC34s teruja pada 488 nm menggunakan laser diod berdenyut picosecond yang dikendalikan pada kadar pengulangan 40 MHz melalui objektif (40 × rendaman air, NA 1.2). Cahaya yang dipancarkan dikumpulkan dalam objektif yang sama dan ditapis dengan penapis laluan jalur 520/35 nm. Pendarfluor kemudiannya dikesan oleh pengesan MPD SPAD. Kawasan yang diminati dalam imej telah dipilih dan diperoleh dengan foton pemerolehan sehingga 20,000 atau lebih. Perisian SymphoTime 64 (PicoQuant, Jerman) digunakan untuk mengira lengkung pereputan setiap piksel dan dipasang dengan model pereputan. Eksponen berganda telah dipilih untuk gabungan ujian dengan penderma YFP-PdbUBC34s dan reseptor PdbMYB221-RFP, dan model mono-eksponen digunakan untuk hanya penderma YFP-PdbUBC34s sebagai kawalan.

Ujian urus niaga

Vektor CaMV 35S-GAL4DB-SUPRD dan CaMV 35S-GAL4-TATA-Ω-LUC-No adalah hadiah daripada Prof. Masaru Ohme-Takagi (Institut Teknologi dan Sains Perindustrian Termaju Negara, Tokyo, Jepun) [47], dari mana wilayah GAL4DB-SUPRD dan GAL4-TATA-Ω telah dikuatkan dengan primer (Jadual S1) dan diklonkan ke dalam vektor binari pGreenII 62-SK dan pGreenII 0800-LUC (Rajah S6i), masing-masing, menghasilkan vektor efektor dan vektor pelapor. Kaset ungkapan daripada Renilla luciferase (RLuc) juga dimasukkan ke dalam vektor pGreenII 0800-LUC, berfungsi sebagai kawalan dalaman. Ujian transaksi dilakukan dengan Sistem Ujian Pelapor Dual-Luciferase (#E1980, Promega) mengikut protokol pengeluar. Nilai ekspresi LUC bagi setiap transformasi telah dinormalisasi kepada nilai RLuc. Setiap titik data mewakili sekurang-kurangnya lapan replikasi. Tiga eksperimen bebas telah dilakukan.

Induksi dinding sekunder

Kawasan pengekodan bagi tiga pengaktif utama biosintesis SCW, iaitu VNS07/WND6A, VNS09/WND2A, dan MYB020, telah dikuatkan daripada P. davidiana × bolleana cDNA dengan primer (Jadual S1) dan diklonkan ke dalam vektor binari pGreenII 62-SK (Rajah S6i) untuk ekspresi berlebihan sementara dalam daun poplar. Vektor pGreenII 62-SK digunakan sebagai kawalan negatif. Daun yang berubah secara sementara telah diwarnai dengan fuchsin asas pada 10 dpi dan diperhatikan untuk pemendapan dinding sekunder dengan mikroskop confocal seperti yang diterangkan sebelum ini [75].

Penjanaan poplar yang berubah secara stabil

Daun yang menyusup dengan Agrobacterium GV3101 menyimpan plasmid binari pSuper1300-Super:GFP (Gamb. S6c) dengan rintangan hygromycin atau CaMV35S:GUS-intro (Rajah S6b) dengan rintangan kanamisin dituai daripada tumbuhan pada 9 dpi. Daun-daun ini dicuci bersih di bawah air paip yang mengalir, disterilkan selama 10 minit dalam larutan natrium hipoklorit 2% ditambah dengan 0.01% Tween 20, dan dibilas tiga kali dengan air steril. Bahagian daun yang menyusup, yang ditandai pada masa penyusupan, dipotong menjadi kepingan dengan berhati-hati untuk mengelakkan pelepah. Tumbuhan yang diubah telah dijana semula melalui organogenesis tidak langsung yang disebabkan oleh kalus. Pertama, induksi kalus dilakukan pada medium MS ditambah dengan 1 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L NAA, 0.2 mg/ L 6-BA, 0.01 mg/L TDZ, 0.1 g/L Tim, 0.1 g /L Cefo, dan 4.5 mg/L hygromycin (untuk transforman GFP) atau 50 mg/L kanamycin (untuk transforman GUS) pada 25 °C dalam gelap selama 3-4 minggu. Kemudian, kalus dipindahkan ke medium penangkapan [medium MS ditambah dengan 0.1 mg/L NAA, 0.2 mg/L 6-BA, 0.01 mg/L TDZ, 0.1 g/L Tim, 0.1 g/L Cefo, dan 4.5 mg/ L hygromycin (untuk transforman GFP) atau 50 mg/L kanamycin (untuk transforman GUS)] dan dikultur pada 25 °C dengan kitaran cahaya/gelap 16 jam/8 jam. Kalus ini disubkultur pada medium penangkapan segar setiap 2 minggu sehingga pucuk terbentuk. Pucuk dipotong kira-kira 1.0 cm ke bawah dari hujung apikal dan dibiakkan pada medium pengakaran (medium MS ditambah dengan 0.1 mg/L NAA, 0.1 g/L Tim, 0.1 g/L Cefo, dan 4.5 mg/L hygromycin (untuk transforman GFP ) atau 50 mg/L kanamisin (untuk transforman GUS)) pada 25 °C dan 16 jam cahaya/8 jam kitaran terang/gelap. Panggilan positif GFP telah disahkan di bawah Lampu Suluh Protein Dwi Pendarfluor DFP-1 (Laut Malam, Amerika Syarikat) sebelum ia dipindahkan untuk penjanaan semula pucuk. Calli yang diperkenalkan dengan GUS telah diwarnakan untuk GUS selepas pucuk yang dijana semula dipotong. Regenerator perakaran di mana akar muncul dalam masa 5-10 hari selepas dipindahkan ke dalam medium perakaran telah diperiksa untuk ekspresi wartawan GFP atau GUS. Transformasi melalui organogenesis langsung telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [63].

Isyarat pendarfluor GFP dalam kalus yang diubah dan tumbuhan utuh yang menyatakan wartawan GFP diperhatikan menggunakan Lampu Suluh Protein Dwi Pendarfluor DFP-1 (Laut Malam, Amerika Syarikat). Bahan tumbuhan telah diterangi oleh RB-Royal Blue (400-460 nm) dan diperhatikan dan difoto melalui penapis kuning.

Mikroskopi

Daun poplar LPI 4, dengan pengecualian daun LPI 3 daripada P. trichocarpa, digunakan untuk menyiasat struktur dalaman daun. Bahagian melintang daun telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini [76]. Bahagian tebal lima mikrometer dipotong dengan mikrotom (Leica RM2265, Jerman), diwarnai dengan toluidine blue O (TBO) seperti yang diterangkan sebelum ini [68], dan diperhatikan menggunakan mikroskop cahaya Leica DM 5500 B (Leica, Jerman).


Perbincangan

Walaupun GECI pendarfluor hijau pada masa ini merupakan alat yang paling berkesan untuk visualisasi isyarat neuron in vivo, kami menjangkakan bahawa ia suatu hari nanti akan dibuat berlebihan oleh GECI pendarfluor merah kerana kelebihan yang wujud yang dikaitkan dengan pendarfluor panjang gelombang yang lebih panjang. Transmisi tisu meningkat apabila panjang gelombang meningkat, jadi GECI pendarfluor merah akan membolehkan pengimejan aktiviti neuron lebih dalam ke dalam tisu otak daripada yang mungkin dengan GECI pendarfluor hijau, dengan mengandaikan semua sifat lain adalah setara [24, 30]. Di samping itu, GECI pendarfluor merah membolehkan pengimejan multiparameter bersama dengan penunjuk pendarfluor hijau, dan memudahkan pengimejan serentak dan pengaktifan optik apabila digunakan bersama dengan penggerak optogenetik boleh diaktifkan cahaya biru seperti ChR2 [42]. Walau bagaimanapun, seperti yang diiktiraf secara meluas [13, 19, 22, 24], GECI merah kini mengalami beberapa batasan berbanding GECI hijau yang paling dioptimumkan (iaitu, GCaMP6) [17]. Had ini termasuk penurunan sensitiviti untuk varian RCaMP dan fotofizik rumit dan pengumpulan lisosom untuk varian R-GECO. Oleh kerana kedua-dua GECI hijau dan merah mempunyai reka bentuk yang serupa dan mengandungi domain pengikat Ca 2+ yang serupa, ciri-ciri yang tidak diingini ini berkaitan dengan perancah RFP yang digunakan untuk menjana GECI merah.

Untuk mengatasi batasan yang berkaitan dengan perancah RFP semasa, kami mengalihkan perhatian kami kepada garis keturunan RFP monomerik yang diperolehi eqFP578 (iaitu, mKate dan terbitannya) [7,8,9], yang cenderung memberikan pendarfluor terang dan teragih sama rata apabila dinyatakan. dalam neuron tikus transgenik [31]. Menggunakan reka bentuk separa rasional dan evolusi terarah, kami membangunkan penunjuk Ca 2+ pendarfluor merah baharu, K-GECO1, berdasarkan varian mKate FusionRed [9]. Kami menjangkakan bahawa K-GECO1 akan mengekalkan ciri-ciri baik yang dikaitkan dengan RFP templat permulaannya. Kami mendapati jangkaan ini secara amnya benar, kerana kami tidak melihat pengagregatan lisosom dalam neuron tikus yang dipisahkan, neuron ikan zebra, atau tisu otak tetikus tetap yang menyatakan K-GECO1. Beberapa struktur seperti punctate pendarfluor diperhatikan semasa pengimejan berfungsi in vivo.

Ciri tersendiri K-GECO1 yang lain ialah penggunaan peptida ckkap sebagai rakan pengikat CaM untuk motif pengikat Ca 2+. Selaras dengan laporan sebelumnya [23, 35], motif ckkap/CaM menghasilkan jelas yang lebih rendah. Kd untuk Ca 2+ dan kinetik yang lebih pantas (berbanding dengan RS20/CaM), dan pekali Bukit yang ketara hampir kepada 1. Ciri-ciri ini sepatutnya membolehkan pengesanan dinamik Ca 2+ yang lebih sensitif pada julat fisiologi, seperti yang terbukti daripada tindak balas pendarfluor besar K-GECO1 amplitud untuk potensi tindakan tunggal. Dengan pekali Bukit yang hampir kepada 1, K-GECO1 harus memberikan tindak balas Ca 2+ yang lebih linear berikutan pelbagai rangsangan.

Struktur kristal sinar-X K-GECO1 menunjukkan bahawa penunjuk mempunyai mekanisme modulasi pendarfluor serba lengkap, sama seperti yang dicadangkan untuk R-GECO1 [22, 29]. Tidak seperti GCaMP, di mana mekanisme modulasi pendarfluor bergantung pada interaksi dengan sisa CaM [43] (Rajah 2l), keadaan terikat K-GECO1 Ca 2+ berkemungkinan stabil oleh ikatan hidrogen antara kumpulan fenolat sisa kromofor dan penghubung1 Asn32 (Rajah 2i). Ini menjadikan protein cpFusionRed dalam K-GECO1 templat yang berpotensi berguna sebagai domain transduksi isyarat untuk digabungkan dengan domain mengikat lain untuk pembangunan jenis penunjuk pendarfluor merah baharu. The crystal structure also reveals that the ckkap/CaM motif in K-GECO1 has a reversed binding orientation for CaM compared with the RS20/CaM binding patterns in R-GECO1, RCaMP, and GCaMP6 (Fig. 2e–h). These results indicate that the GCaMP-like design is versatile enough to tolerate different peptide conformations and CaM orientations, and that exploring a wider range of CaM binding partners is likely to lead to GECIs with new and improved properties.

First-generation red GECIs, including mApple-based R-GECO1 and mRuby-based RCaMP1h, have been optimized using a neuron screening platform [24, 44], resulting in jRGECO1a and jRCaMP1a/b with greatly improved in vivo performance for detection of action potentials. Although K-GECO1 is a first-generation red GECI, it already provides performance that, by some criteria, is comparable to second-generation red GECIs. Specifically, K-GECO1 has a fluorescent response to single action potentials that is similar to that of jRGECO1a (and superior to jRCaMP1a/b) and faster dissociation kinetics than either jRGECO1a or jRCaMP1a/b. However, by other criteria, K-GECO1 will require further optimization to match the performance of second-generation red GECIs. For example, K-GECO1 does not provide the same level of in vivo sensitivity as the highly optimized jRGECO1a. In addition, K-GECO1 showed some blue-light-dependent photoactivation during in vitro characterization, though less so than R-GECO1. The photoactivation of K-GECO1 was not detectable under the illumination condition in our characterizations in cultured dissociated neurons (Additional file 5: Figure S3c) or in iPSC-CMs (Fig. 4c), suggesting that it is more suitable than R-GECO1 for use with blue/cyan-excitable optogenetic actuators. Nevertheless, the occurrence (or absence) of photoactivation will depend on the specific illumination conditions, and so appropriate controls (i.e., blue-light illumination of tissue expressing K-GECO1 but no optogenetic actuator) must be performed. Future efforts to screen K-GECO variants in neuronal cells, as was done for R-GECO1 and RCaMP1h [24], could lead to the discovery of improved variants with higher levels of expression in neurons, Kds tuned to the range of neuronal cytoplasmic Ca 2+ concentrations, increased cooperativity of Ca 2+ binding to improve single action potential detection, diminished lysosomal accumulation, and minimum blue-light activation.


Aplikasi

Single or multiple promoter reporter monitoring studies

Live-cell monitoring of promoter reporters

Additional product information

Please see the product's Certificate of Analysis for information about storage conditions, product components, and technical specifications. Please see the Kit Components List to determine kit components. Certificates of Analysis and Kit Components Lists are located under the Documents tab.

Takara Bio USA, Inc.
Amerika Syarikat/Kanada: +1.800.662.2566 &bull Asia Pasifik: +1.650.919.7300 &bull Eropah: +33.(0)1.3904.6880 &bull Jepun: +81.(0)77.565.6999
UNTUK KEGUNAAN PENYELIDIKAN SAHAJA. BUKAN UNTUK DIGUNAKAN DALAM PROSEDUR DIAGNOSTIK. &salinan 2021 Takara Bio Inc. Hak Cipta Terpelihara. Semua tanda dagangan adalah hak milik Takara Bio Inc. atau ahli gabungannya di A.S. dan/atau negara lain atau pemilik masing-masing. Tanda dagangan tertentu mungkin tidak didaftarkan dalam semua bidang kuasa. Maklumat produk tambahan, harta intelek dan penggunaan terhad boleh didapati di takarabio.com.

Takara Bio Europe ialah ahli Kumpulan Takara Bio, sebuah syarikat sains hayat terkemuka yang komited untuk memperbaiki keadaan manusia melalui bioteknologi. Melalui jenama Takara, Clontech dan Cellartis kami, misi kami adalah untuk membangunkan alat dan perkhidmatan inovatif berkualiti tinggi untuk mempercepatkan penemuan.


Green Fluorescent Protein Quantification in Microplates

The assessment of gene expression is an important tool in molecular and cellular biology. Several methods have been developed, but most cannot provide real-time information concerning expression. Here we report the quantitation of cellular extracts from cells expressing the gene for green fluorescent protein (GFP) using the FL600 Fluorescent Microplate Reader in order to demonstrate the feasibility of GFP to assess "real-time" gene expression.

Pengenalan

The assessment of gene expression has become one of the most utilized tools in molecular and cellular biology today. The expression of transiently and/or permanently transfected cloned DNA sequences allows the investigator to determine the transcriptional activity of promoters. Unfortunately, in most instances the natural product of the promoter cannot be assayed in a quantitative manner. In the past, the promoter was joined to a reporter gene which encoded for a protein with unique enzymatic activity, such as ß-galactosidase or chloramphenicol acetyltransferase, that could be assayed easily. The level of gene activity would then be monitored as a function of that enzymatic activity. These assays, while easy to perform and generally quite quantitative, suffer from their inability to be measured in "real time". In these assays it was generally necessary to make cell lysates and perform the reaction at some later time on the lysates. The Achilles&rsquo heel of these experiments is the stability of the enzyme throughout storage and during the actual assay. Recently, the use of inherently fluorescent proteins, such as green fluorescent protein (GFP), has been described as a means to assess gene expression and transfection efficiency.

Green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea victoria is a 27-kDalton monomer protein consisting of 238 amino acids which is naturally fluorescent (1). Its role is to transduce, by energy transfer, the blue chemiluminescence of another protein, aequorin, into green fluorescent light (10). The wild type green fluorescent protein (wtGFP) has an absorbance/excitation peak at 395 nm with a minor peak at 475 nm (UV to blue light), and has a peak emission at 508 nm, with a shoulder at 540 nm (green light). The crystal structure of the protein suggests a closely packed b-can enclosing a a-helix (9). The chemical structure necessary for fluorescence has been determined and the data suggest a hexapeptide that contains a cyclic-tripeptide moiety, serine, dehydro-tyrosine, glycine, which is covalently linked through the protein&rsquos peptide backbone (2). The exact mechanism of formation of this unique structure is unknown, but it takes place post-translationally and requires molecular oxygen (6). Interestingly, the hexapeptide is contained within the a-helix portion of the protein suggesting that the b-can provides the means to exclude solvents and molecular oxygen, which tend to quench fluorescent signal (9). Unlike other bioluminescent reporters, which require additional proteins, substrates, or cofactors to emit light, GFP is inherently fluorescent and its fluorescence is not species-specific.

As shown in Table 1, several mutations have been made to the wild type protein (wtGFP) to improve one or more characteristics of the protein. The most widely used variants are the red-shifted GFPs. These mutants have a single excitation peak around 488 nm rather than the primary excitation peak and minor peak found in the wild type protein (Table 2). These variants do however, have the same emission spectra as wild type protein. EGFP, also known as GFPmut 1:23, has two mutations in the chromophore region (Table 1) and is reported to have a single, red-shifted excitation peak at 488 nm and fluoresces with greater intensity than wild type protein (3). The GFP-S65T mutant, with the Serine at position 65 mutated to a Threonine, also has a single red shifted excitation peak, fluoresces more intensely than wild type, and has an added advantage of acquiring fluorescence approximately four times faster than wild-type GFP (4).

Several mutants have been optimized for expression in bacterial cells. For example, GFPuv, which has been optimized to fluoresce when excited with ultra violet (UV) light contains three amino acid substitutions, none of which alter the chromophore sequence. These substitutions alter protein folding and chromophore formation. When expressed in E. coli GFPuv is more soluble than the wtGFP, which is primarily found in inclusion bodies in a nonfluorescent insoluble form. Also, five rarely used Arg codons from the wild type gene have been replaced by codons preferred in E. coli in order to increase expression efficiency. This protein does have a propensity to dimerize, which forms as a result of hydrophobic interactions and results in a four-fold reduction in absorbance at 470 nm and an increase in absorption at 395 nm. Despite the changes, the excitation and emission maxima remain the same as wild type. The Stemmer mutant is quite similar to the GFPuv, with the exception of the Arg codon changes.

Mutations have also been used to create blue emission GFP variants. The Y66H variant has a histidine residue at position 66 instead of a tyrosine. This results in excitation and emission maxima of 382 and 459 nm respectively. Other improvements on the blue emitting proteins have been made to improve their brightness. For example EBFP also contains amino acid changes at positions 64, 65, and 145 that improve brightness and resulting in an excitation and emission maxima of 380 and 440 respectively.

Other substitutions have been made to improve protein folding and chromophore formation. Besides the obvious amino acid substitutions previously described many different silent mutations have been made to the wild type sequence. Clontech has made over 150 sequence substitutions to the native DNA sequence in order to change codon usage to reflect the intended host&rsquos codon bias. Upstream sequences flanking the coding region have also been converted to a Kozak consensus translation initiation site in order to increase translation initiation efficiency.

Expression of GFP as a transgene has opened many exciting new windows of investigation in cell, developmental, and molecular biology. Fluorescent GFPs have been expressed in bacteria (1, 3) yeast (11), slime mold (12), plants (13), drosophilia (14), and mammalian cells (17). GFPs can function as a protein tag, tolerating either an N- or a C-terminus fusion to a broad variety of proteins, many of which have been shown to maintain native function (18). The enormous flexibility of these proteins as a noninvasive real-time marker in living cells allows for numerous applications. Here we describe several experiments demonstrating the use of fluorescence to quantitate various Green Fluorescent Proteins (GFPs) using the FL600 microplate fluorescence reader.


Table 1. GFP mutants and their amino acid substitutions

# These mutants also contain over 150 silent base mutations that correspond to human codon-usage preferences. & Upstream sequences flanking the coding region have been converted to a Kozak consensus translation initiation site. @ Five rarely used Arg codons from the wild type gene have been replaced by codons preferred in E. coli in order to increase expression efficiency.

Bahan dan Kaedah

The 96 well clear microplates, catalogue number CFCP N96, were purchased from Biosearch, (Bedford, MA). Purified recombinant proteins for wtGFP, EGFP, GFP-S65T, and GFPuv were purchased from Clontech. Partially purified extracts containing recombinant wtGFP protein, as well as the EGFP, Y66H, and Stemmer mutant proteins were a generous gift of Daniel González (Rutgers, New Brunswick, NJ). A series of dilutions of each protein extract were made using Tris-EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) as the diluent. Fluorescent determinations were made using an FL600 Fluorescence Microplate reader (BioTek Instruments, Winooski, Vermont) with KC4 data reduction software on an external PC controlling reader function and data capture (BioTek Instruments, Winooski, VT). Filter sets varied depending on the variant of GFP used. Determinations of wtGFP were made using a 400 nm, 30 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter. Stemmer, mutant and GFPuv were read using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter. The red-shifted mutants EGFP and GFP-S65T were determined using a 485 nm, 20 nm bandpass excitation filter and a 530 nm, 25 nm bandpass emission filter,while the "blue" emitting mutant, Y66H, was investigated using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter with a 460 nm, 40 nm bandpass emission filter. Table 2 indicates the excitation and emission maxima of several of the proteins used. Protein concentrations for each GFP variant were determined using absorbance at appropriate wavelength ( l max) and the concentration calculated using the reported extinction coefficients (e) for each variant (15, 16).


Table 2. Excitation and emission data of GFP variants

@ Note that both excitation peak wavelengths are indicated.

Keputusan

Concentration curves were made using several GFP variants and the fluorescence determined. In all cases a linear correlation to concentration was observed. The fluorescence of partially purified wtGFP protein was measured from 0 to 140 ng. Determination of total protein content by the method of Lowry indicates that wtGFP represents 3% of the total protein. As demonstrated in Figure 1, using an excitation wavelength of 400 nm and an emission wavelength of 508 a linear response was observed (r 2 =0.998). In terms of detection limits as little as 5 ng per well of wtGFP can be detected. Using purified recombinant wtGFP obtained commercially, similar results were obtained in regards to linearity and detection limits.

When the fluorescence of the red-shifted proteins was determined, a linear relationship between concentration and fluorescence was also observed for either EGFP or GFP-S65T (Figure 2). With the fluorescein filter set, the increase in the extinction coefficient (Table 2) for EGFP results in a brighter fluorescence than with the wild-type protein. This may account for the lower detection limit of 1 ng per well we observed with this protein (data not shown). Quantitation of EGFP in extracts using a calibration curve determined by linear regression can be used with a high degree of confidence (r 2 = 0.998).

As demonstrated in Figure 3, the Stemmer mutant and GFPuv can utilize the same filter set. As with all the other GFP variants examined both proteins demonstrate a linear relationship between concentration and fluorescence signal (Figure 3). The detection limit of the Stemmer mutant was determined to be 2.5 ng (data not shown). These data are in close agreement with the extinction coefficient data that indicates that the Stemmer mutant is half as bright as the EGFP variant. Although they are optimized for excitation using UV light and in these experiments were excited at 360 nm, they can be quantitated very well with the same filter set as wtGFP, which utilized a 400 nm excitation filter.

The fluorescence from a serial dilution of the GFP-Y66H protein extract was performed. Although the Y66H blue emitting mutant sample was not pure enough to quantitate protein content using absorbance, there was sufficient protein to detect a fluorescent signal. With dilution of the protein extract, a linear relationship between dilution and fluorescence was observed (Figure 4).

As demonstrated in Figure 5 using the appropriate filter set is important in order to maximize the signal. Use of the red-shifted mutants such as EGFP allows the use of the traditional "fluorescein" filter set (485 nm excitation, 530 nm emission). When filters that maximize the signal with wtGFP (400 nm excitation and 508 nm emission) are used to detect EGFP, the signal returned is greatly diminished, despite having the same sensitivity setting. Unfortunately, filter overlap precludes the use of the 485 nm excitation filter with a 508 nm emission filter. Wild-type GFP, as previously described has a primary excitation centered at 395 nm with a shoulder located at 485 nm. With the traditional "fluorescein" filter set than a loss of fluorescent signal is observed as compared to the result when a 400 nm excitation and 508 nm emission is used. Due to the secondary excitation peak at 370 nm with wtGFP, the degree of loss is alleviated somewhat as compared to EGFP, which only has a single excitation peak. In the case of GFPuv, which has been optimized for excitation with UV light, the loss of fluorescent signal is much more profound when the "fluorescein" filter set is used (data not shown).

Figure 1. Concentration curve using partially purified wtGFP protein. Dilutions of wtGFP protein were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 400 nm, 30 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 175.

A

B

Figure 2. Concentration curves of red-shifted GFP proteins. Dilutions of (A) EGFP or (B) GFP-S65T proteins were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 485 nm, 20 nm bandpass excitation filter and a 530 nm, 25 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 135.

A

B

Figure 3. Concentration curves using partially purified Stemmer mutant GFP and rGFPuv proteins. Dilutions of partially purified Stemmer-mutant GFP protein (A) or rGFPuv protein (B) were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 140.

Figure 4. Concentration curve using partially purified GFP-Y66H mutant protein. Dilutions of mutant GFP-Y66H protein were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 460 nm, 45 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 150.

A

B

Figure 5. Loss of signal when using alternative filter sets. Dilutions of (A) EGFP protein or (B) wtGFP were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using either a 485 nm, 20 nm bandpass excitation, 530 nm, 25 nm bandpass emission filter set or a 400 nm, 30 nm bandpass excitation, 508 nm, 20 nm bandpass emission filter set. For EGFP and wtGFP determinations using either filter set, a sensitivity setting of 170 was used.

Perbincangan

The utility of green fluorescent proteins has become increasingly obvious. Detection only requires the addition of near UV to blue light and is not limited by the availability of substrates, therefore providing information concerning gene expression and cellular localization in real time. Also GFPs do not interfere with cell growth in a wide variety of organisms and as such, are a convenient indicator of transformation. In this application note we describe the direct quantitation of several different mutant forms of GFP using fluorescence.

Because GFPs are actually proteins rather than small fluorescent molecules, the physical properties of GFPs as peptides must be taken into account. Despite being a peptide, GFP is resistant to denaturation. GFP, with a Tm=70°C, is quite resistant to heat denaturation once formed. In vivo it appears that the formation of GFP is somewhat temperature sensitive. In yeast GFP fluorescence is reported to be maximal at 15°C and decreases to about 25% of maximal when the incubation temperature is raised to 37°C (7). It has been demonstrated that mutations that increase efficiency of protein folding, as with EGFP and GFPuv, suppress the sensitivity of fluorescence to growth incubation temperature (3). In regards to redox status, GFP needs to be in an oxidized state in order to fluoresce, as the formation of the cyclic tripeptide chromophore requires molecular oxygen (6). Strong reducing agents, such as 5 mM Na2S2O4 or 2 mM FeSO4 convert GFP into a nonfluorescent moiety. Fortunately, weaker reducing agents such as, 2% ß-mercaptoethanol, 10 mM dithiotheitol (DTT), 10 mM glutathione, or 10 mM L-cysteine, do not seem to affect the fluorescence of GFP (16). Strong oxidizing agents such as 1% H2O2 will also abolish fluorescence as will complete denaturation. GFP is quite resistant to pH changes. For example, wtGFP is fluorescent over a very broad pH range (pH 5.5-12) with rapid loss of fluorescence with pH levels either above or below this range. The red-shifted mutants have been reported to have a narrower range of pH stability and exhibit fluorescence between pH 7.0 and 11.5.

In regards to fluorescence, GFP offers some advantages that one would not expect from proteins. Unlike many proteins, activity is not lost and fluorescence is maintained after fixation with either glutaraldehyde or formaldehyde. Most importantly, GFP and its most of its variants are reported to be quite resistant to photobleaching. Chaotropic agents such as 8M urea, and low concentrations of detergents (1% SDS) also do not effect fluorescence of the protein.

There are several issues that have to be kept in mind when using GFP as a reporter molecule. Expression of exogenous proteins in organisms can lead to solubility problems. Wild-type GFP, like many other proteins when expressed in bacteria, is primarily found in inclusion bodies in an insoluble form and is nonfluorescent. Mutations that increase protein folding and translation efficiency have been found to eliminate many of the solubility problems. Sebagai contoh, E coli expressing GFPuv, with its mutations to improve protein folding and chromophore formation, are reported to be 18 times brighter than bacteria expressing wtGFP mostly due to increased protein solubility. In regards to the use of GFP as a means to measure transcription, the rate of chromophore formation and the apparent stability of wtGFP may preclude the use of GFP as a reporter to monitor rapid changes. Chromophore formation takes place post-translationally and requires molecular oxygen. Cells, bacteria in particular, grown in anaerobic conditions will be refractory to GFP fluorescence. Likewise if very rapid changes in transcription rates are being investigated, the lag between protein production and chromophore formation may preclude the use of GFP. Similarly, GFP proteins once produced are quite stable and resistant to degradation, again reducing their utility as a reporter for rapid changes. Another important point to consider in regards to using GFP as quantitative reporters is the lack of signal amplification. The signal associated with GFP does not have any enzymatic activity associated with it, therefore there is no opportunity for amplification as would be the case for reporters such as b-galactosidase, luciferase, or alkaline phosphatase.

Another problem associated with GFP fluorescence is background autofluoresence. Most autofluoresence in mammalian cells is due to the presence of the flavins FAD and FMN. These compounds have excitation and emission maxima of 450 nm and 515 nm respectively and tend to cause problems primarily with the red-shifted variants. Likewise, NADH, another commonly found cellular cofactor, has an excitation of 365 nm and an emission of 445 nm and may result in background fluorescence when wtGFP fluorescence is quantitated. If background autofluorescence is a problem, it may be necessary to tailor the GFP mutant to the type of autofluorescence encountered. It has been estimated that cytoplasmic concentration must be 1.0 µM in order for the wtGFP signal to be twice that generated from autofluorescence. Red-shifted variants, because they are brighter, have a lower threshold of 100-200 nM (16).

Although most experiments using GFP are performed using either fluorescence microscopy or flow cytometry, these data presented in this application note, demonstrate the utility of direct measurement of GFP using a fluorescence microplate reader. Microscopy can provide information on the number of cells expressing GFP, but is quite subjective in regards to quantitation. Flow cytometry can provide quantitative information, but throughput is quite limited. Determination of fluorescence using a microplate fluorometer allows quantitative information as well as high throughput.

Other Related Application Notes Excitation and Emission of Green Fluorescent Protein

Rujukan

(1) Chalfie, M., Y. Tu, G.Euskirchen, W. Ward, D. Prasher (1994) Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science 263:802-805.

(2) Cody, C. D. Prasher, W. Westler, F. Prendergast, W. Ward (1993) Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-Fluorescent Protein, Biochemistry, 32:1212-1218.

(3) Cormack, B.P. R. Valdivia, and S. Falkow. (1996) FACS-optimized Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP) Gene, 173:33-38.

(4) Heim, R., A.B. Cubitt, and R.Y. Tslen, . (1995) Improved Green Fluorescence, Nature, 373:663-664.

(5) Delagrave, S. R.E. Hawtin, C.M. Silva, M.M. Yang, and D.C. Youvan. (1995) Red-shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein, Bio/Technology, 13:151-154.

(6) Heim, R. D.C. Prasher, and R.Y. Tsien (1994) Wavelength Mutations and Posttranslational Autoxidation of Green Fluorescent Protein, Proc. Natl, Acad. Sci, USA 91:12501-12504.

(7) Lim, C.R., Y. Kimata, M. Oka, K. Nomaguchi, and K. Kohno (1995) Thermosensitivity of Green Fluorescent Protein Fluorescence Utilized to Reveal Novel Nuclear-like Compartments in a Nucleoporin Nsp1. J. Biochemistry, 118:13-17.

(8) Cubitt, A., R. Heim, S. Adams, A. Boyd, L. Gross, R. and R. Tsien (1995) Understanding, improving and Using Green Fluorescent Proteins. Trends in Biochemical Sciences, 20:448-455.

(9) Yang, F., L.G. Moss, G.N. Phillips (1996) The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein. Nature Biotechnology 14:1246-1251.

(10) Ward, W. in Photochemical and Photobiological Reviews, K. Smith Ed. 1979, Plenum NY. P. 1-57.

(11) Kahana, J., B. Schapp, and P. Silver (1995) Kinetics of Spindle Pole Body Separation in Budding Yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9707-9711.

(12) Moores, S., J. Sabry, and J. Spudich (1996) Myosin Dynamics in Live Dictyostelium Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:443-446.

(13) Epel, B., H. Padgett, M. Heinlein, and R. Beachy (1996) Plant Virus Movement Protein Dynamics Probed with a GFP-protein Fusion. Gene. 173:75-79.

(14) Wang, S., and T. Hazelrigg (1994) Implications for bcd mRNA Localization from Spatial Distribution of exu Protein in Drosophila Oogenesis. alam semula jadi. 369:400-403.

(15) Gonzalez, D. Personal communication.

(16) Living Colors User Manual Clontech Laboratories Inc. Palo Alto CA.

(17) Crameri, A. E.A. Whitehorn, E. Tate, and W.P.C. Stemmer (1996) Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nature Biotechnology 14:448-455.

(18) Stearns, T. (1995) The Green Revolution. Current Biology. 5:262-264.


Tonton video: Cara Menanam Kacang Hijau Menggunakan Media Kapas (Februari 2023).