Maklumat

1.11: Kes Paterniti dengan Elektroforesis - Biologi

1.11: Kes Paterniti dengan Elektroforesis - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Objektif Pembelajaran

Matlamat:

  • Jalankan elektroforesis gel agarose pada sampel.
  • Ketahui cara menganalisis cap jari DNA.

Hasil Pembelajaran Murid:

Setelah menyelesaikan makmal ini, pelajar akan dapat:

  • Asingkan molekul dengan elektroforesis.
  • Menganalisis jalur yang terhasil daripada elektroforesis gel.
  • Tentukan paterniti anak menggunakan analisis cap jari DNA.

Bahagian I: Elektroforesis Gel Agarose

Pengenalan

Elektroforesis gel adalah teknik yang sangat biasa dan berguna untuk mengasingkan molekul DNA, RNA, dan protein berdasarkan saiz dan cas molekul. Agarose ialah polisakarida, terdapat dalam rumpai laut, yang membentuk matriks gel (jaringan lubang pelbagai saiz). Apabila arus elektrik dialirkan melalui penampan dan gel, molekul dalam sampel bergerak ke arah elektrod dengan cas yang bertentangan. Molekul DNA, RNA dan protein biasanya mempunyai cas keseluruhan negatif dan akan bergerak ke arah elektrod positif. Molekul yang lebih kecil boleh bergerak melalui matriks gel lebih cepat daripada molekul yang lebih besar.

Cap jari DNA menggunakan corak jalur yang terhasil daripada rawatan khusus sampel DNA untuk mengenal pasti hubungan sampel dengan sampel rujukan. Dalam makmal ini, anda akan menjalankan simulasi aktiviti cap jari DNA untuk membiasakan diri dengan proses ini. Anda akan memuatkan sampel pada gel dan memisahkan jalur dalam setiap sampel untuk mencipta corak tertentu menggunakan elektroforesis gel.

Menyediakan Gel Agarose

Terdapat pelbagai buffer berjalan yang boleh digunakan untuk memisahkan DNA. Beberapa penimbal yang biasa digunakan dipanggil TAE (Tris Acetate EDTA), TBE (Tris Borate EDTA), dan SB (Sodium Borate). Sentiasa gunakan penimbal yang sama untuk membuat gel agarose dan menjalankan elektroforesis.

BAHAN

  • Serbuk agarose
  • Spatula
  • Bot timbang
  • Stok 20x
  • Silinder bergraduat
  • PipetAid
  • Pipet serologi
  • Kelalang dengan penutup berventilasi

PERALATAN

  • Seimbang
  • Ketuhar gelombang mikro

PROSEDUR

  1. Sediakan 500 ml penimbal Natrium Borat 1X daripada larutan stok 20X.
    1. Sukat 25 mL 20X stok penimbal Sodium Borate dalam silinder gradasi 25 mL dan tuangkan ke dalam bekas 500 mL.
    2. Sukat 475 mL DI-air dalam silinder bergraduat 500 mL dan tuangkan ke dalam bekas yang sama.
    3. Tutup rapat dan gaul.
  2. Sediakan 50 ml 0.8% (w/v) agarose dalam 1X penimbal Sodium Borate untuk menuang empat gel Mini One. Ambil perhatian bahawa agarose (dan gelatin) adalah dua bahan yang disediakan dengan cara yang istimewa, kerana ia hanya boleh larut dalam cecair mendidih. Jadi, kami TIDAK PERNAH meletakkan serbuk agarose (dan gelatin) ke dalam silinder bergraduat. Sebaliknya kita tuangkan serbuk ke dalam bekas terakhir (kelalang Erlenmeyer).
    1. Sukat 50 mL 1X penimbal dengan silinder bergraduat 50 mL dan tuangkan ke dalam kelalang Erlenmeyer.
    2. Sukat 0.4 g serbuk agarose dan tuangkan ke dalam kelalang yang sama. Ini akan kelihatan seperti buburan legap.
    3. Gunakan penutup udara jika boleh (atau tiada penutup). Letakkan kelalang dalam ketuhar gelombang mikro dan hidupkan (selama 1 minit) pada tetapan tinggi. Berhati-hati - jangan biarkan cecair mendidih!
    4. Perhatikan cecair menggelegak. Sebaik sahaja cecair mula menggelegak, hentikan ketuhar gelombang mikro, gunakan sarung tangan atau silikon "Tangan Panas" untuk memutarkan kelalang 2-3 kali.
    5. Kemudian ganti dan hidupkan gelombang mikro semula untuk mendidih kedua.
    6. Sebaik sahaja cecair mula menggelegak, hentikan ketuhar gelombang mikro, gunakan sarung tangan atau "Tangan Panas" untuk memegang kelalang pada lampu siling. Perhatikan dengan teliti sebarang bintik atau kristal dalam cecair. Apabila tiada lagi bintik kelihatan dalam larutan jernih, maka agarosa telah cair sepenuhnya.
    7. Letakkan kelalang di atas meja dan biarkan sejuk hingga 60oC. Apabila anda mula-mula dapat memegang kelalang dengan tangan kosong, maka agarose cukup sejuk untuk dituangkan ke dalam dulang. Jangan tuang agarose terlalu panas, kerana gel tuangan akan meledingkan dan berkerak. Jangan sejukkan agarose terlalu lama, kerana gel tidak akan terpolimer secara sekata.
    8. Sediakan dulang tuang dan amalkan memuatkan sampel gel semasa anda menunggu.

Tuangkan Gel Agarose (MINI ONE EMBITEC GEL SYSTEM)

  1. Letakkan dua dulang tuangan akrilik jernih ke dalam dirian tuangan putih.
  2. Masukkan sikat 9-telaga ke dalam slot yang betul pada dirian tuang.
  3. Sebaiknya gunakan Pipet-Aid dan 25 mL Serological Pipet untuk mengukur dan memindahkan 12.5 mL larutan agarosa cair ke dalam setiap dulang tuang. Atau tuangkan larutan agarose sehingga 1/3 ke atas sikat.
  4. Cepat gerakkan atau letuskan gelembung udara dengan hujung pipet atau sikat gel. Masukkan sikat gel ke dalam slot yang betul.
  5. Jangan gerakkan atau tumbuk dulang gel sehingga gel menjadi pejal dalam masa kira-kira 15 minit.
  6. Simpan larutan agarosa tambahan dalam kelalang, ditutup dengan parafilem atau penutup, pada suhu 4oC untuk kegunaan kemudian.

Amalkan Memuatkan Sampel Gel

Memuatkan sampel gel adalah kemahiran yang memerlukan latihan untuk dipelajari! Gel agarose sebenar yang anda akan gunakan untuk elektroforesis adalah sangat halus dan mudah tercucuk. Gel amalan tidak boleh ditebuk, tetapi menyediakan telaga saiz yang sama untuk mengeluarkan sampel anda. Oleh kerana DNA adalah jelas, biasanya pewarna pemuatan berwarna ditambah kepada sampel DNA. Gliserol berketumpatan tinggi juga ditambah kepada pewarna pemuatan, supaya sampel DNA akan jatuh ke dasar telaga dengan cepat.

Petua Makmal: Apabila memuatkan sampel ke dalam telaga gel, hanya tolak pelocok mikropipet ke hentian pertama, JANGAN tolak ke hentian kedua. Pastikan ibu jari anda menekan pelocok, sehingga mikropipet terkeluar sepenuhnya dari tangki penimbal.

  1. Dapatkan gel uretana amalan.
  2. Tutup gel dengan air ternyahion. Jika terdapat buih di dalam telaga, gunakan pipet pemindahan plastik untuk mengeluarkan buih.
  3. Gunakan hujung pipet pada mikropipet P20 dan tetapkan dail kepada 10.0 uL.
  4. Tolak dan tahan pelocok mikropipet ke hentian pertama.
  5. Ambil 10 µL pewarna merah amalan dan perlahan-lahan lepaskan ibu jari anda.
  6. Pegang mikropipet secara menegak (lihat Rajah 1) di atas gel latihan, seperti hujungnya di bawah paras air dan tepat di atas telaga. Tidak perlu hujung untuk masuk ke dalam telaga, kerana gliserol berat akan menarik sampel ke bawah ke dalam telaga.
  7. Tolak pelocok ke PERHENTIAN PERTAMA sahaja dan simpan ibu jari anda di sana. (Pilihan: cuba tolak ke hentian kedua untuk melihat apa yang berlaku.)
  8. Gerakkan seluruh lengan anda ke atas, supaya mikropipet keluar dari air, kemudian biarkan ibu jari anda terlepas dari pelocok. (Pilihan: cuba lepaskan ibu jari anda semasa pipet masih di dalam air untuk melihat apa yang berlaku).
  9. Amalkan memuatkan 10.0 µL pewarna merah ke dalam tiga atau lebih telaga gel amalan.
  10. Anda sepatutnya dapat melihat sampel berwarna jatuh ke bahagian bawah telaga.

Petua Makmal: Jika dilakukan dengan betul, semua sampel akan kekal di dalam telaga. Periksa sama ada terdapat sebarang pewarna berwarna terapung dari bahagian atas telaga, yang bermaksud sampel itu boleh mencemari perigi lain. Periksa sama ada terdapat sebarang pewarna yang bocor keluar dari bahagian bawah perigi, yang bermaksud bahawa anda menusuk perigi dan sampel mungkin tidak masuk ke dalam gel.

BAHAGIAN II: Kes Paterniti: Siapa Bapa Anak Kucing Saya?

Mary mempunyai seekor kucing putih bernama "Madu" yang hilang selama dua hari kira-kira tiga bulan lalu. Dia kini mempunyai empat anak kucing (foto 1) dan Mary ingin tahu sama ada dua kucing jiran, "Tom" atau "Butch," boleh menjadi bapa kepada setiap anak kucing. Untuk menganalisis cap jari DNA mereka, Mary telah mengumpul folikel rambut daripada setiap kucing dewasa dan anak kucing, mengekstrak DNA, dan menguatkan DNA menggunakan tindak balas rantai polimerase.

Hipotesis

Menggunakan foto, lengkapkan jadual 1 dengan ramalan anda tentang bapa setiap anak kucing.

Jadual 1. Hipotesis mengenai Paterniti Anak Kucing

anak kucing

Bakal Bapa

Penaakulan

krim

Molase

halia

gula

Bahan

Reagen

  • Pra-tuang 0.8% gel agarose
  • Tujuh sampel dalam tiub mikrofuge. Satu untuk setiap kucing
  • 135-150 mL 1X penampan berjalan natrium borat (cukup untuk menenggelamkan gel agarose)

Peralatan dan Bekalan

  • Sistem elektroforesis seperti MiniOne atau jenama lain dengan ruang gel dan bekalan kuasa
  • Mikropipet P-20 dan petua yang sesuai
  • Telefon bimbit atau kamera untuk mengambil gambar gel untuk mendokumenkan keputusan

Prosedur

  1. NOTA: Perkara berikut dilengkapkan apabila ruang elektroforesis telah disediakan dengan gel agarose 0.8% dan 1x penimbal Sodium Borate di dalam ruang. Jangan lupa untuk mendokumenkan prosedur anda dengan sewajarnya dalam buku nota makmal anda.
  2. Dapatkan "sampel DNA" - terdapat tujuh tiub mikrofuge berlabel P-V.
  3. Menggunakan mikropipet P-20 dan hujung pipet, ukur 10µL dari Tiub P dan pindahkan ke dalam telaga pertama gel agarose. Pastikan anda mengikut urutan pemuatan gel yang dinyatakan dalam Lajur 1 – Nah.
  4. Menggunakan hujung baru untuk setiap sampel, pindahkan 10µL setiap sampel ke dalam telaga baru gel.
  5. Pastikan anda menjejaki pemuatan sampel anda, jika anda tidak mengikut jadual di bawah. Jika terdapat sebarang masalah dengan pemuatan (gel tertusuk, sampel tidak mencukupi), pastikan anda menulis di ruangan NOTA.
Jadual 2. Memuatkan nota: Sertakan sebarang penyelewengan atau nota dalam buku nota makmal anda

Nah

tiub

Sampel DNA 10µL

Nota untuk memuatkan

1

P

Tom (lelaki)

2

Q

Krim (anak kucing)

3

R

Molase (anak kucing)

4

S

Madu (perempuan)

5

T

Halia (anak kucing)

6

U

gula (anak kucing)

7

V

Butch (lelaki)

  1. Jika menggunakan sistem elektroforesis MiniOne, jalankan gel selama 15 minit, sehingga jalur warna terpisah. Jika menggunakan sistem elektroforesis lain, jalankan gel pada 135V sehingga bahagian hadapan pewarna.
  2. Untuk melihat hasil terbaik, ambil dulang tuang (dengan gel) daripada tangki penimbal, luncurkan gel ke atas kertas berlamina putih, labelkan sampel (dan nama pasukan anda) dan ambil gambar.
  3. Oleh kerana sampel DNA akan meresap melalui gel agarose, anda harus sentiasa merekodkan keputusan dengan cepat sebaik sahaja elektroforesis telah dimatikan.

ANALISIS

  1. Gunakan pensel warna untuk merekodkan corak jalur (warnakan blok yang sesuai) dalam Jadual Data di bawah.
Jadual 3. Jalur “DNA” Berwarna Dipisahkan Oleh Elektroforesis Gel Agarose

tiub

P

Q

R

S

T

U

V

Band

Tom (Lelaki)

krim

Molase

Sayang(Perempuan)

halia

gula

Butch (Lelaki)

Biru #1

Biru #2

Merah jambu #1

Ungu #1

Kuning #1

Kuning #2

  1. Pertimbangkan dengan teliti setiap kumpulan keempat-empat sampel anak kucing dan tentukan sama ada kumpulan itu sepadan dengan Tom, Honey atau Butch. Untuk sampel anak kucing (lajur QRTU) dalam Jadual Data 3, tulis (dalam blok berwarna) yang sepadan dengan jalur itu -- Tom, Honey atau Butch.
  2. Buat kesimpulan anda berdasarkan "bukti DNA".
  3. Isikan lajur ke-2 dan ke-3 dalam jadual 4 di bawah. Bandingkan hipotesis anda dalam jadual 1 di mana anda meneka bapa bagi setiap anak kucing berdasarkan penampilan dengan kesimpulan anda mengenai bapa berdasarkan bukti DNA. Adakah hipotesis anda betul untuk setiap anak kucing?
  4. Apakah bukti khusus yang membenarkan kesimpulan anda menentukan bapa setiap anak kucing? Isikan jawapan anda kepada soalan-soalan ini dalam jadual di bawah.
Jadual 4. Perbandingan Hipotesis dan Kesimpulan yang disokong oleh Bukti Eksperimen

anak kucing

AYAH berdasarkan visual

AYAH berdasarkan DNA

Bukti

krim

Molase

halia

gula

Soalan Kajian

  1. Semasa elektroforesis gel, DNA akan berhijrah ke elektrod yang mana?
  2. Jika anda mempunyai molekul DNA yang kecil, sederhana, panjang dan lebih panjang, yang manakah paling hampir dengan bahagian bawah gel selepas elektroforesis?
  3. Apakah yang anda tahu tentang corak jalur yang terhasil daripada zuriat yang berkaitan dengan ibu dan bapa?
  4. Jika anda menjalankan analisis cap jari DNA tetapi corak jalur untuk anak tidak sepadan dengan ibu bapa, apakah yang anda akan simpulkan?


Tonton video: Principles of Gel Electrophoresis (Februari 2023).