Maklumat

Adakah ekspresi protein virus penting untuk vaksin peptida?

Adakah ekspresi protein virus penting untuk vaksin peptida?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya ingin tahu sama ada protein yang dinyatakan dalam kuantiti yang lebih tinggi, seperti polimerase DNA, akan menjadi calon vaksin yang lebih baik untuk vaksin berasaskan sel T.


Untuk mencari protein calon yang boleh digunakan sebagai vaksin peptida, ini perlu memenuhi beberapa kriteria:

  • Yang paling penting ialah peptida (atau protein) yang digunakan untuk
    vaksinasi tidak boleh mempunyai urutan yang berkait rapat dalam organisma di mana vaksinasi akan berlaku. Jika tidak, sama ada tiada tindak balas (disebabkan toleransi imunologi kepada diri sendiri) atau tindak balas autoimun mungkin berlaku.
  • Peptida/protein perlu diekspresikan pada permukaan mikrob (sama ada virus atau bakteria) kerana jika tidak, ia tidak akan dikenali oleh sistem imun. Juga domain calon vaksin yang berpotensi yang berada di dalam membran tidak berguna.
  • Epitope perlu cukup stabil untuk digunakan sebagai vaksin dan juga terdapat pada mikrob (jika tidak, tiada tindak balas imun).

Jika anda ingin membaca lebih lanjut mengenai topik ini, terdapat Kertas yang menarik dari WHO tersedia, yang memberikan pengenalan yang bagus:

Untuk menjawab soalan anda: Tidak, protein ini tidak boleh digunakan untuk tujuan ini, kerana ia berkait rapat dengan protein yang sama dalam tubuh manusia. Ini mungkin akan membawa kepada tiada tindak balas imunologi sama sekali. Selain itu, protein ini terletak di dalam sel dan oleh itu tidak terdedah kepada sistem imun.


Soalan asal bertanya tentang pembangunan vaksin terhadap virus. Kebanyakan vaksin anti-virus yang berkesan menimbulkan tindak balas antibodi yang mungkin melindungi melalui peneutralan virus apabila ia memasuki badan. Bob Seder mempunyai ulasan yang baik tentang perkara ini - anda mungkin menemui perbincangan yang berkaitan dengan topik ini dalam bahagian bertajuk "Sasaran virus untuk induksi imuniti humoral". Vaksin ini tidak semestinya membawa kepada kemusnahan sel yang dijangkiti kerana ini adalah fungsi CTL.

Saya rasa gembar-gembur yang dimaksudkan oleh bioteknologi adalah berkaitan dengan vaksin terapeutik terhadap kanser, dsb. yang menimbulkan tindak balas CTL yang mampu memusnahkan sel-sel kanser. Walau bagaimanapun, ia juga penting untuk diingat bahawa kedua-dua CTL dan Sel B memerlukan bantuan CD4 T Cell untuk berkembang - tiada apa yang berdiri sendiri dalam sistem imun.


Sempadan dalam Kimia

Gabungan editor dan penyemak adalah yang terbaru disediakan pada profil penyelidikan Gelung mereka dan mungkin tidak menggambarkan situasi mereka pada masa semakan.



KONGSIKAN

Pengenalan

Wabak penyakit radang paru-paru yang tidak pernah berlaku sebelum ini dilaporkan pada akhir Disember 2019, selepas beberapa kematian direkodkan di Wuhan, China [1]. Terdapat penyebaran penyakit yang cepat dari bandar Wuhan ke banyak negara, termasuk Amerika Syarikat, dengan beribu-ribu dijangkiti dan ramai yang mati dalam beberapa bulan selepas penyebaran awal [1, 2]. Pada 31 Disember 2019, wabak penyakit itu dikesan kepada strain novel Coronavirus [1]. Ia kemudiannya dinamakan SARS-CoV-2 dan penyakit COVID-19 oleh WHO [3, 4]. Laporan menunjukkan sehingga 16 Jun 2020, sekurang-kurangnya 440,421 kematian disahkan dan lebih 8,144,359 kes disahkan, dan statistik semasa sehingga 27 November kini berada pada 1.4 juta kematian dengan 61.2 juta kes jangkitan. [1, 5]. SARS-CoV-2 telah dikenal pasti sebagai strain baru daripada Coronavirus kumpulan 2B, dengan kira-kira 70% persamaan genetik dengan SARS-CoV, dari wabak 2003 [4]. Virus ini mempunyai persamaan 96% dengan coronavirus kelawar, jadi ia disyaki secara meluas berasal dari kelawar [6, 7]. Pandemik telah mengakibatkan sekatan perjalanan dan penutupan seluruh negara di beberapa negara dan mengakibatkan kekacauan ekonomi [1]. Urutan genom telah disimpan dalam beberapa biorepositori dalam talian yang dipilih susun dalam mencari penyelesaian dan membangunkan vaksin yang tersedia secara universal adalah penting.

Coronavirus ialah sekumpulan virus yang biasanya menyebabkan penyakit pada mamalia dan Aves. Dalam kes manusia, coronavirus bertanggungjawab untuk jangkitan saluran pernafasan yang boleh terdiri daripada ringan, seperti kes selesema biasa dan demam rendah, dan lain-lain yang boleh membawa maut, seperti SARS, MERS dan COVID-19 [4]. Kes telah menunjukkan bahawa simptom boleh berbeza-beza bergantung kepada tuan rumah contohnya, penyakit saluran pernafasan atas telah ditemui pada ayam dan cirit-birit pada lembu dan babi. [6]. Coronavirus dikelompokkan di bawah subfamili Orthocoronavirinae, dalam keluarga Coronaviridae, perintah Nidovirales [5, 6]. Ia adalah virus RNA untai tunggal rasa positif dengan nukleokapsid simetri heliks. Ia juga diselubungi dengan protein spike dan saiz genom bagi kebanyakan coronavirus berkisar antara 27-34 kilobases, yang terbesar di kalangan retrovirus yang diketahui. [8]. Lompatan zoonosis semasa kepada manusia membimbangkan kerana jangkitan saluran pernafasan atas boleh membawa kepada penyakit maut pada sesetengah individu. Masih belum ada vaksin yang berkesan untuk mencegah atau merawat sebarang jangkitan coronavirus manusia [4].

Analisis struktur telah mendedahkan bahawa protein Spike S1 memudahkan perlekatan virion ke membran sel dengan berinteraksi dengan kedua-dua reseptor ACE2 dan CLEC4M/DC-SIGNR [9]. Perubahan konformasi glikoprotein S diinduksi pada penghayatan patogen virus ke dalam petak endosomal perumah. [9]. Proteolisis mengikut kumpulan keluarga lisosom cathepsin L boleh membuka topeng gabungan peptida S2 dan mengaktifkan gabungan membran dalam endosom perumah. Protein spike S2, yang bertindak sebagai protein gabungan virus kelas I, menjadi pengantara gabungan virion dan membran selular. Terdapat tiga sifat konformasi protein: keadaan asal pra-gabungan, pertengahan pra-jepit rambut, dan keadaan jepit rambut selepas gabungan. [9]. Semasa pelakuran membran sel virus dan sasaran, kawasan bergelung (heptad berulang) menganggap struktur trimer-pin rambut, meletakkan peptida gabungan berhampiran dengan kawasan terminal-C ektodomain [10]. Pembentukan struktur ini memudahkan percantuman seterusnya protein virus dan membran sel sasarannya [10]. Apabila endositosis, protein spike S2 ​​bertindak sebagai peptida gabungan virus dan ia dibuka selepas pembelahan S2 berlaku apabila endositosis virus [10]. Domain pengikat reseptor (RBD) pada protein spike ditambah dengan reseptor ACE2 selular yang mencirikan sebahagian daripada mekanisme molekul yang mengelilingi kemasukan virus dan jangkitan telah dikenal pasti. [11, 12]. Kajian telah menunjukkan bahawa induksi antibodi peneutral dan proses pengikatan enzim penukar angiotensin 2 (ACE2) yang membantu kemasukan virus dimediasi oleh RBD kawasan S1 protein S. [13]. Kajian eksperimen juga menunjukkan bahawa pengurangan berterusan RBD-antibodi daripada komponen sera mengurangkan keupayaan peneutralan serum, menunjukkan bahawa domain ini dominan dalam meneutralkan induksi antibodi [14]. Peranan penting protein S dalam jangkitan virus telah menjadikannya calon utama untuk pengeluaran vaksin. Pada masa ini terdapat lebih 90 calon vaksin SARS-CoV-2 [1], dan vaksin berasaskan epitope boleh memberikan pendekatan percuma yang berguna yang akan mengemudi imuniti kepada epitop imunogenik pada protein S. Dengan immunoinformatik, kini boleh menilai sifat imunogenik protein melalui kaedah pengiraan (dalam silico) dengan kecekapan tinggi [15–17]. Oleh itu, kami telah menggunakan Dalam silico pusat pemeriksaan untuk mereka bentuk vaksin berasaskan peptida epitope terhadap glikoprotein pancang SARS-CoV-2 dan juga meniru julat tindak balas dalam senario peningkatan utama.


Fungsi Protein Spike

CoVs diedarkan secara meluas dalam alam semula jadi dan penghantaran zoonosisnya ke dalam populasi manusia boleh menyebabkan penyakit wabak. Selepas memasuki saluran pernafasan atau gastrousus, virus ini membentuk dirinya dengan memasuki dan menjangkiti makrofaj lumen dan sel epitelium. Program kemasukan sel untuk virus ini diatur oleh protein spike virus (S) yang mengikat reseptor selular dan juga mengantara gabungan membran sel virus. Ambil SARS-CoV sebagai contoh. Protein spike (protein S) SARS-CoV mempunyai peranan penting dalam jangkitan virus dan patogenesis. S1 mengenali dan mengikat kepada reseptor perumah, dan perubahan konformasi berikutnya dalam S2 memudahkan percantuman antara sampul virus dan membran sel perumah.

Model yang menggambarkan peristiwa gabungan membran pengantara-S telah diperluaskan daripada pengetahuan tentang struktur dan fungsi protein S. Sebahagiannya, model ini dianggap munasabah kerana konformasi 6-HB postfusi dalam protein SARS dan MHV S sangat ketara serupa dengan bentuk pascafusi influenza HA2, paramyxovirus F2, Ebolavirus GP2 dan HIV gp41. Sebagai analogi kepada protein gabungan virus yang lebih dikaji dan difahami dengan baik ini, proses gabungan membran pengantara CoV S secara amnya dilihat sebagai skema dalam Rajah 3.

Rajah 3. Skema gabungan membran pengantara protein spike CoV. Ilustrasi mewakili beberapa langkah perubahan konformasi protein S yang mungkin berlaku semasa pelakuran membran. Pada langkah pertama, pengikatan reseptor, pengurangan pH dan/atau proteolisis protein S mendorong pemisahan S1 daripada S2. Langkah ini didokumenkan untuk beberapa MHV. Dalam langkah kedua, peptida gabungan (FP) diselitkan ke dalam membran sel perumah. Ini adalah peringkat gabungan-perantaraan. Pada peringkat ketiga, bahagian protein S yang paling hampir dengan membran virus dilipat semula ke teras ulangan heptad 1 (HR1) untuk membentuk berkas enam heliks (6-HB), yang merupakan konfigurasi pascafusi terakhir bagi protein S2.


Perbincangan

SARS-CoV-2, virus yang mempunyai kepentingan zoonosis yang tinggi dan kadar penghantaran, telah merebak dengan cepat ke seluruh dunia dan menyebabkan COVID-19 yang mengancam nyawa (Gorbalenya et al., 2020). Bilangan jangkitan SARS-CoV-2, dan kematian seterusnya meningkat dari hari ke hari (Tai et al., 2020), dan dengan itu, wabak COVID-19 telah diisytiharkan sebagai kecemasan kesihatan awam oleh Kebimbangan Antarabangsa (Hui et al. , 2020 Zhou et al., 2020a). Komuniti saintifik di seluruh dunia sedang berusaha untuk membangunkan vaksin yang berkesan dan selamat terhadap SARS-CoV-2 yang semakin cepat muncul ini (Abdelmageed et al., 2020). Walaupun sebilangan besar calon vaksin untuk COVID-19 kini sedang diuji, sesetengah daripada mereka telah maju ke ujian manusia (Lane, 2020), belum ada yang diisytiharkan berkesan dan selamat untuk pencegahan jangkitan SARS-CoV-2. Apa yang menarik, tiada ubat atau vaksin terapeutik yang berkesan masih lagi tersedia untuk rawatan pesakit SARS-CoV-2 (Hoque et al., 2020a). Melalui kajian genomik dan proteomik yang komprehensif, kami berusaha untuk mereka bentuk vaksin chimeric multi-epitope (imunodominan) antigenik untuk SARS-CoV-2, dinamakan sebagai CoV-RMEN (417 aa), yang akan membatalkan penglibatan penghantaran virus melarikan diri dari makmal , mengurangkan kos, dan mungkin menimbulkan imuniti dengan merangsang sel B dan T spesifik antigen secara terpilih.

Pendekatan baru reka bentuk vaksin berasaskan pelbagai epitope (termasuk berbilang epitope yang dipelihara) mewakili mendorong imuniti selular tertentu, dan antibodi peneutral yang sangat kuat terhadap jangkitan (Dawood et al., 2019 Yong et al., 2019 Gralinski & Menachery, 2020 Kibria, Ullah & Miah, 2020). Vaksin berasaskan epitope ini juga memberikan peningkatan keselamatan dan mempunyai keupayaan untuk menumpukan pada tindak balas imun yang mampan kerana memasukkan berbilang epitop yang dipelihara. Tidak seperti protein S penuh, segmen RBD dan NTD mempunyai domain peneutralan kritikal tanpa sebarang kawasan imunodominan yang tidak meneutralkan (Ul Qamar et al., 2019 Gralinski & Menachery, 2020 Shang et al., 2020 Wrapp et al., 2020) . Mutasi pada RBD mungkin membolehkan strain baru melarikan diri dari peneutralan oleh antibodi penargetan RBD yang ditubuhkan, oleh itu kawasan berfungsi lain, terutamanya NTD, harus dipertimbangkan untuk membangunkan vaksin yang berkesan juga (Wang et al., 2019 Zhou et al., 2019). Selain itu, gabungan gabungan protein RBD dan NTD menyebabkan antibodi peneutral yang sangat kuat dan imuniti perlindungan jangka panjang dalam model haiwan (Song et al., 2018). Memandangkan perspektif keselamatan dan keberkesanan, RBD dan NTD adalah calon yang lebih menjanjikan dalam pembangunan vaksin SARS-CoV-2 berbanding protein S penuh. Kehadiran protein E dan M pada sampul surat boleh meningkatkan tindak balas imun terhadap SARS-CoV (Millet & Whittaker, 2015 Almofti et al., 2018) dan dengan itu, dianggap sebagai calon yang sesuai untuk pembangunan vaksin (Yong et al., 2020 Ahmed , Quadeer & McKay, 2020 Gralinski & Menachery, 2020). Oleh itu, antibodi terhadap epitop protein S, M dan E yang besar secara imunologi bagi SARS-CoV-2 akan memberikan imuniti perlindungan terhadap jangkitan (Yong et al., 2020 Ahmed, Quadeer & McKay, 2020 Gralinski & Menachery, 2020 Shang et al. ., 2020). Oleh itu, tindak balas imun yang menyasarkan RBD dan/atau NTD bagi protein S glikoprotein, M dan E SARS-CoV-2 akan menjadi intervensi profilaksis dan terapeutik yang penting, yang boleh diuji lebih lanjut dalam model yang sesuai sebelum ujian klinikal (Chan et al., 2020).

Imuniti yang berkesan terhadap jangkitan virus sangat bergantung kepada pengaktifan kedua-dua sel B dan T (Shi et al., 2015 Shey et al., 2019). Oleh itu, mendorong imuniti humoral atau selular tertentu terhadap patogen, vaksin yang ideal harus mengandungi kedua-dua epitop sel B dan sel T. Analisis kami mendedahkan bahawa kawasan RBD dan NTD CoV-RMEN yang terpilih mengandungi sejumlah besar epitop sel B pertalian tinggi, Kelas I MHC, Kelas II MHC dan interferon-γ (IFN-γ) dengan skor antigen yang tinggi. Selain itu, epitope sel B membran (MBE) dan epitope sel B sampul surat (EBE) meningkatkan kestabilan keseluruhan, imunogenisiti dan antigenik CoV-RMEN. Perkembangan sel-B memori dan sel-T adalah jelas, dengan ingatan dalam sel-B bertahan selama beberapa bulan. Penemuan ini bertentangan dengan beberapa laporan awal di mana tindak balas imun pengantara sel T dianggap sebagai tindak balas yang tahan lama berbanding dengan sel B (Abdelmageed et al., 2020 Wrapp et al., 2020). Satu lagi penemuan yang mengasyikkan dalam kajian ini ialah pembangunan tindak balas Th1 yang meningkatkan pertumbuhan dan percambahan sel B yang menambah imuniti adaptif (Carvalho et al., 2002). Jika tindak balas sel B yang kuat berlaku dalam ujian haiwan (tikus atau arnab), antibodi ini boleh digunakan dalam tujuan diagnostik, kerana mereka harus mengenali antigen yang menonjol pada permukaan virus (Kibria, Ullah & Miah, 2020). Selain itu, tindak balas sel T CD8+ dan CD4+ memainkan peranan utama dalam imuniti antivirus (Abdelmageed et al., 2020). Satu lagi fakta penting ialah Reseptor Seperti Tol (TLR) boleh mengikat secara berkesan dengan protein spike CoV (Totura et al., 2015 Zander et al., 2017), dan mungkin memainkan peranan penting dalam tindak balas imun semula jadi terhadap SARS- Jangkitan CoV-2 (Shahabi et al., 2020).

Sifat fizikokimia juga mendedahkan chimera sebagai protein asas atau alkali (pI = 8.71) dan akan menjadi termostable apabila dinyatakan, dan oleh itu, vaksin CoV-RMEN yang dicadangkan kami akan paling sesuai untuk kegunaan seluruh dunia di kawasan endemik yang berbeza (Shey et al. , 2019 Ul Qamar et al., 2019). Bentuk struktur (sekunder dan tertier) CoV-RMEN, apabila diuji sebagai peptida sintetik, menunjukkan keupayaan untuk melipat ke dalam struktur asalnya, justeru boleh meniru jangkitan semula jadi oleh SARS-CoV-2 (Almofti et al., 2018 ). Struktur tertier (3D) yang diperhalusi bagi konstruk vaksin akhir menunjukkan ciri-ciri struktur yang diingini berdasarkan ramalan plot Ramachandran (Shey et al., 2019 Srivastava et al., 2019). Analisis dok molekul menunjukkan bahawa protein chimeric yang diramalkan boleh mewujudkan interaksi protein-protein yang stabil dengan TLR (TLR-2, TLR-3, TLR-4) (Totura et al., 2015). Pengaktifan molekul permukaan CoV-RMEN yang cekap adalah sangat penting untuk pengaktifan imun sel dendritik, dan pemprosesan dan pembentangan antigen seterusnya kepada CD4+ dan CD8+ T-sel melalui MHC-II dan MHC-1, masing-masing (Shi et al., 2015 Shey et al., 2019 Shang et al., 2020). Simulasi dinamik molekul juga mendedahkan bahawa kompleks CoV-RMEN-TLR yang berlabuh adalah stabil, dan mempunyai pertalian yang lebih mengikat TLR-3 dan TLR-4 (Abraham et al., 2015). Tambahan pula, CoV-RMEN menunjukkan skor antigenik yang baik pada Vaxijen v2.0 dan ANTIGENpro yang menunjukkan bahawa jujukan peptida ini sepatutnya bersifat sangat antigenik (Shey et al., 2019). Sifat bukan alahan CoV-RMEN mengukuhkan lagi potensinya sebagai calon vaksin (Shey et al., 2019 Ul Qamar et al., 2019).

Simulasi imun CoV-RMEN mempamerkan hasil yang dijangka konsisten dengan tindak balas imun biasa, dan terdapat tindak balas imun yang semakin meningkat selepas pendedahan antigen berulang (Rajah 6). Sitokin antivirus IFN-γ dan tahap IL-2 perangsang sel meningkat dengan ketara, yang juga menyumbang kepada tindak balas imun seterusnya selepas vaksinasi dalam perumah (Almofti et al., 2018). Ini menunjukkan tahap sel T penolong yang tinggi dan akibatnya pengeluaran antibodi yang cekap, menyokong tindak balas humoral (Shey et al., 2019). IC yang lebih rendah50 nilai menunjukkan pertalian pengikatan yang lebih tinggi bagi epitop dengan molekul kelas I dan II MHC. Walaupun kebanyakan kajian terdahulu (Sakib et al., 2014 Adhikari, Tayebi & Rahman, 2018) melaporkan bahawa pertalian yang mengikat (IC50) ambang 250 nM mengenal pasti pengikat peptida yang diiktiraf oleh sel-T, dan ambang ini boleh digunakan untuk memilih peptida, kami terus mengikat pertalian dalam 50 nM untuk mendapatkan tahap keyakinan yang lebih baik dalam meramalkan epitop bagi alel MHC-I dan MHC-II. Indeks Simpson menganggarkan kekhususan klon mencadangkan kemungkinan tindak balas imun yang pelbagai dan ini munasabah memandangkan peptida chimeric yang dihasilkan terdiri daripada epitop sel B dan T yang mencukupi (Rajah 6).

Interaksi antara epitop sel T, dan alel HLA masing-masing menunjukkan pertalian mengikat yang ketara yang mencerminkan pengaktifan imun sel B- dan T seperti yang disokong oleh laporan lain (Srivastava et al., 2019 Jaimes et al., 2020). Epitop sel T dari kawasan RBD dan NTD yang menunjukkan interaksi tinggi dengan alel HLA meliputi lebih daripada 98% populasi dunia dengan kumpulan etnik yang berbeza, dan penemuan ini disokong dengan banyak kajian terdahulu (Huang et al., 2007 Jaimes et al., 2020 Ul Qamar et al., 2019). Penggabungan penyambung GG dan EGGE antara epitop CoV-RMEN yang diramalkan menghasilkan jujukan dengan imunogenisiti persimpangan yang diminimumkan, dan membenarkan pembinaan reka bentuk rasional bagi vaksin berbilang epitope yang kuat (Huang et al., 2007 Badawi et al., 2016 Shey. et al., 2019 Srivastava et al., 2019). Glikosilasi antigen permukaan membantu virus yang diselubungi mengelak daripada pengecaman oleh sistem imun perumah, dan boleh mempengaruhi keupayaan perumah untuk meningkatkan tindak balas imun adaptif yang berkesan (Pereira et al., 2018) atau bahkan dieksploitasi oleh virus untuk meningkatkan infektiviti (Wolfert & Boons, 2013). Selain itu, beberapa antibodi seperti mAb 8ANC195 telah berkembang untuk mengenali epitope peptida tanpa pergantungan pada pengikatan glycan (Kong et al., 2015). Walau bagaimanapun, tiada data tersedia untuk antibodi khusus untuk spike glikoprotein SARS-CoV-2, sama ada pengecamannya diganggu oleh glikosilasi spike atau mungkin diperkuatkan oleh gula yang berdekatan dengan epitope peptida, atau tidak diganggu oleh pengubahsuaian gula ( Zhou et al., 2020b). Tambahan pula, kebanyakan epitop CoV-RMEN tidak mengandungi glikosida selain daripada rantau NTD (Watanabe et al., 2020). Tambahan pula, kebanyakan glycans epitope NTD hadir pada terminii antigen HLA yang diduga, dan mungkin tidak mengganggu persembahan antigen dalam kompleks HLA (Grant et al., 2020). Integriti reseptor ACE2 RBD, epitope sel B protein sampul (EBE) dan epitop sel B protein membran (MBE) dalam CoV-RMEN menunjukkan bahawa vaksin boleh mengekalkan keberkesanan walaupun fenomena hanyut antigen dan glikosilasi, selagi virus itu terus menyasarkan reseptor hos yang sama (Grant et al., 2020).

Salah satu langkah pertama dalam mengesahkan vaksin calon adalah untuk menyaring imunoreaktiviti melalui analisis serologi. Ini memerlukan ekspresi protein rekombinan dalam perumah yang sesuai. Semasa kami memberi tumpuan kepada epitop tanpa glikosilasi atau glikosilasi tidak ketara, ekspresi peringkat tinggi vaksin telah dioptimumkan ke dalam sistem ekspresi prokariotik yang mantap dan kos efektif. E coli Strain K-12 sebagai pilihan pertama menggunakan plasmid pETite yang mengandungi tag SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) ​​dan tag 6x-His memudahkan kedua-dua pelarutan dan penulenan pertalian protein rekombinan (Biswal et al., 2015). Pengoptimuman kodon CoV-RMEN mendedahkan ekspresi peringkat tingginya dalam E coli (tekanan K12). Struktur mRNA yang stabil, indeks kebolehsuaian kodon (0.87), dan kandungan GC (50.26%) adalah baik untuk ekspresi tahap tinggi protein dalam bakteria. Selepas pengklonan gen yang berjaya, plasmid rekombinan boleh dibiakkan dengan cekap menggunakan E coli sel, dan ekspresi protein seterusnya boleh dilakukan dalam E coli Strain K-12 menggunakan IPTG (Isopropyl βinduksi -d-1-thiogalactopyranoside), dan penanaman pada 28 ° C seperti yang juga dilaporkan sebelum ini (Biswal et al., 2015).

Sebagai alternatif kepada E coli, garisan sel eukariotik, HEK-293 telah dipertimbangkan untuk ekspresi CoV-RMEN. Indeks penyesuaian kodon (CAI), kandungan GC masing-masing adalah 1.0 dan 61.60, yang menunjukkan tahap tinggi ekspresi binaan vaksin dalam barisan sel HEK-293. Dalam kes ini, vektor ekspresi mamalia pSec Tag2 boleh digunakan, yang mempunyai isyarat rembesan dari rantau V-J2-C tetikus Ig kappa-rantai untuk rembesan cekap protein rekombinan, teg poli-histidin C-terminal (6xHis). untuk penulenan pantas dengan C-terminal c-myc epitope untuk pengesanan dengan antibodi anti-myc. Untuk mengalih keluar teg perkaitan dan pengesanan (Tag beliau dan epitope c-myc) selepas penulenan, tapak belahan Faktor Xa (LVPR↓GS) boleh ditambah pada terminal C CoV-RMEN (Waugh, 2011).


Vaksin Vektor terhadap Coronavirus

Beberapa kumpulan telah melaporkan penilaian praklinikal terhadap vaksin yang menggunakan virus lain sebagai vektor untuk protein SARS-CoV, termasuk virus parainfluenza chimeric, MVA, virus rabies, virus stomatitis vesikular (VSV) dan adenovirus. Chimeric bovine/human parainfluenza virus 3 (BHPIV3), calon vaksin virus parainfluenza yang dilemahkan hidup, telah digunakan sebagai vektor untuk protein struktur SARS-CoV termasuk S, N, matriks (M), dan sampul (E), secara bersendirian atau dalam gabungan. Kajian dengan vaksin vektor seterusnya menunjukkan bahawa induksi NAbs khusus protein S adalah mencukupi untuk memberikan perlindungan.


Kesimpulan

Ringkasnya, kerja kami menyediakan set epitop sel CD4 + dan CD8 + T yang paling luas yang merangkumi keseluruhan genom SARS-CoV-2 dan mengikat set luas alel HLA-I dan HLA-II. Menggabungkan senarai epitop ini dengan pertimbangan tahap ekspresi protein, liputan populasi dan pemuliharaan jujukan virus akan membawa kepada penjanaan senarai pendek calon epitop vaksin yang berkemungkinan imunogenik dalam majoriti populasi. Senarai ramalan kami bagi epitop sel CD4 + dan CD8 + T akan melengkapkan epitop sel B dan berfungsi sebagai sumber bagi komuniti saintifik untuk menjana epitop vaksin SARS-CoV-2 yang kuat dan menjana imuniti sel T yang tahan lama.


Perbincangan

Terdapat hampir 200 vaksin calon dalam pembangunan berdasarkan 6 platform teknologi: vaksin tidak aktif, vaksin subunit protein, vaksin mRNA, vaksin DNA, vaksin vektor virus tidak mereplikasi/mereplikasi, dan vaksin zarah seperti virus, (laporan landskap WHO menjelang 3 November , 2020) (13). Antaranya, 47 calon sedang memasuki pembangunan klinikal (fasa 1–3). Keputusan awal vaksin ini menunjukkan tindak balas imun yang memuaskan dalam kedua-dua fasa percubaan klinikal praklinikal dan awal. Sebagai contoh, vaksin mRNA yang dibangunkan oleh Moderna, mengekspresikan keseluruhan spike dengan mutasi 2-prolin (mRNA-1273) untuk menstabilkan protein spike dalam bentuk prefusi [28, 29], menunjukkan tindak balas dan perlindungan NAb yang teguh selepas cabaran virus dalam strain tetikus dan primata bukan manusia. Sel CD4 + T dan tindak balas sel pembantu folikel T juga dikesan [29]. Versi jenis liar protein spike yang digunakan dalam vaksin vektor virus, seperti ChAdOx1 nCoV-19, yang dibangunkan oleh Universiti Oxford dan AstraZeneca juga telah diuji. Kera yang diimunisasi mengembangkan tindak balas NAb dan Th1 dan kebanyakannya dilindungi daripada replikasi virus selepas dicabar [30]. Versi spike lain seperti domain trimerisasi RBD menggunakan platform mRNA (BNT162b1) yang dibangunkan oleh BioNTech-Pfizer juga dinilai. Baru-baru ini, Pfizer melaporkan perbandingan langsung antara BNT162b1 dengan BNT162b2 yang mengodkan protein spike penuh dengan mutasi di-proline. Keputusan menunjukkan titer antibodi yang setanding tetapi BNT162b2 memberikan profil keselamatan yang lebih baik [31]. Walaupun titer NAb dilaporkan dalam semua calon vaksin, keputusannya sukar untuk dibandingkan kerana teknik dan bacaan yang berbeza dalam pengukuran NAb [32].

Dalam kajian ini, kami memilih platform vaksin DNA kerana kelebihannya ialah ia boleh dihasilkan dalam masa yang singkat [33]. Tulang belakang plasmid dan sistem ekspresi yang digunakan dalam ini sebelum ini adalah bukti keberkesanannya dalam vaksin DNA denggi [25, 34]. Objektifnya adalah untuk menyiasat imunogenik lonjakan SARS-CoV-2 sama ada sebagai jenis liar penuh atau dipotong sebagai S1 atau S2 dalam platform reka bentuk vaksin DNA dalam model murine ini.

Di sini, kami menunjukkan bahawa calon vaksin DNA SARS-CoV-2 menimbulkan tindak balas imun humoral dan pengantaraan sel khusus virus yang ketara. Walaupun RBD kini merupakan antigen sasaran utama dalam berbilang calon vaksin, kami memilih S atau S1 daripada RBD kerana sebelum ini telah dilaporkan bahawa epitop peneutral SARS-CoV-2 yang kuat juga terletak di luar kawasan RBD. Sebagai contoh, analisis sera pesakit COVID-19 mendedahkan bahawa antibodi peneutralan juga ditujukan terhadap epitop dalam domain N-terminal [35] dan C-terminal [36, 37] protein S1. Kajian terdahulu juga bersetuju dengan penemuan ini bahawa protein S1 rekombinan lebih imunogenik daripada RBD apabila jumlah IgG, IgA dan NAb dianalisis [38]. Analisis subkelas IgG dalam semua binaan vaksin mendedahkan tindak balas bercampur IgG2a dan IgG1 (Rajah 3B). Ini membayangkan bahawa calon vaksin DNA SARS-CoV-2 kami mendorong tindak balas Th1/Th2 yang seimbang yang boleh mengelakkan kebimbangan penyakit pernafasan dipertingkatkan berkaitan vaksin (VAERD) yang disebabkan oleh modaliti vaksin Th2-bias [21].

Walaupun jumlah antibodi pengikat protein spike didapati pada tahap yang sama pada tikus apabila calon vaksin S-, S1- atau S2-DNA diberikan (Rajah 3), aktiviti peneutralan virus hidup yang paling tinggi didapati dalam kumpulan vaksin S-DNA. . Aktiviti peneutralan yang lebih rendah mungkin disebabkan oleh kekurangan struktur trimerik bagi konstruk S1 [11, 39]. Sebaliknya, konstruk S berpotensi membentuk struktur trimerik yang serupa dengan pancang pada struktur virus [11, 39]. Selain itu, keunggulan konstruk S berbanding S1 mungkin juga dimediasi oleh kemasukan rantau S2 [11, 40]. Seperti yang ditunjukkan dalam hasilnya, S2 sangat imunogenik apabila dianalisis oleh ELISA dan ELISpot tetapi tahap rendah NAb dikesan. Oleh itu, antibodi terhadap S2, sekurang-kurangnya, mungkin membantu meningkatkan aktiviti peneutralan virus. Sebagai contoh, antibodi yang diarahkan kepada peptida gabungan boleh menghalang gabungan sel virus [41]. Aktiviti meneutralkan antibodi terhadap peptida gabungan telah didedahkan daripada sera pesakit COVID-19 [42]. Selain itu, antibodi terhadap ulangan heptad penyambung (HR) 1 dan HR2 (asid amino 1148-1159) pada subunit S2 juga mengantarkan peneutralan virus [37].

Tindak balas imun yang dimediasi sel juga memainkan peranan penting dalam kawalan virus kerana tindak balas imun selular tanpa tindak balas antibodi ditemui dalam gejala asimtomatik dan ringan yang disahkan diagnosis COVID-19 pada individu [43]. Selain itu, kajian terdahulu menunjukkan kebanyakan pesakit yang pulih daripada COVID-19 mempunyai sel CD4 + dan CD8 + T khusus protein S dalam darah periferi [44]. Walau bagaimanapun, peranannya dalam perlindungan terhadap jangkitan SARS-CoV-2 masih belum dijelaskan. Kajian terdahulu mengenai kajian vaksin SARS-CoV-1 pada tikus menyokong peranan perlindungan sel T [45]. Dalam kajian ini kami mendapati bahawa magnitud tertinggi bagi tindak balas sel T spesifik SARS-CoV-2 diperhatikan dalam imunisasi DNA spike jenis liar. Maklum balas yang paling banyak diarahkan kepada kumpulan RBD dan HR1peptida. Penemuan ini konsisten dengan keputusan daripada percubaan klinikal fasa 1 bahawa peserta yang telah diimunisasi dengan calon vaksin mRNA spike di-proline menghasilkan tindak balas sel CD4 + T yang baik terhadap kedua-dua peptida terkumpul S1 dan S2 [16]. Selain itu, kajian terdahulu mengenai pemetaan epitope sel T kedua-duanya dalam vivo dan dalam silico mendedahkan bahawa epitop sel T immunodominant juga terdapat di kawasan RBD dan HR1 [46, 47].

Walau bagaimanapun, dalam kajian kami, hanya memberikan respons splenosit keseluruhan, penyiasatan terperinci mengenai tindak balas subset sel T penolong yang berbeza akan memberikan maklumat yang lebih tepat mengenai imuniti sel T yang disebabkan oleh vaksin DNA. Analisis profil sitokin dalam supernatan splenosit kultur yang dirangsang semula dengan peptida bertindih SARS-CoV-2 mendedahkan tindak balas terpesong Th1 dalam calon vaksin S-DNA ini. Oleh itu, penemuan ini boleh meminimumkan kebimbangan imunopatologi yang disebabkan oleh tindak balas Th2-bias yang sebelum ini ditemui dalam vaksin MERS dan SARS CoV-1 [48–50].

Seperti yang dilaporkan dalam MERS dan SARS CoV-1, peningkatan yang bergantung kepada antibodi, ADE adalah salah satu kebimbangan dalam tindak balas antibodi yang disebabkan oleh vaksin [51–53]. Walau bagaimanapun, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa tidak seperti dalam MERS dan SARS CoV-1, S atau RBD penuh SARS CoV-2 menimbulkan tindak balas antibodi peneutralan yang teguh tanpa mendorong ADE dalam kajian imunisasi haiwan [54, 55]. Untuk mengesahkan kebimbangan ini, analisis fenomena ADE adalah wajar terutamanya dalam kajian percubaan klinikal.

Spike jenis liar penuh yang digunakan dalam kajian ini sebelum ini telah membuktikan bahawa ia boleh membentuk struktur trimerik yang sama dengan mutasi 2-prolin [56]. Imunogenisiti serta keberkesanan perlindungan spike jenis liar penuh juga ditunjukkan dalam pelbagai model haiwan [30, 57, 58]. Kajian dalam percubaan klinikal fasa I menunjukkan bahawa vaksin DNA menggunakan spike jenis liar penuh adalah selamat dan boleh mendorong kedua-dua antibodi dan tindak balas sel T [59]. ChAdOx1 nCoV-19, calon vaksin paling maju yang menggunakan spike jenis liar panjang penuh sebagai antigen sedang diuji dalam ujian klinikal fasa III (ISRCTN89951424, NCT04516746). Baru-baru ini, analisis interim ujian vaksin ChAdOx1 nCoV-19 menunjukkan bahawa keberkesanan keseluruhan ChAdOx1 nCoV-19 adalah 70.4% [60]. Ini membawa kepada kelulusan penggunaan kecemasan ChAdOx1 nCoV-19 di Britain, India dan negara lain. Oleh itu, penemuan ini mengesahkan bahawa spike jenis liar penuh juga berfungsi sebagai antigen calon yang baik yang boleh memberikan perlindungan tahap tinggi dalam ujian klinikal yang besar.

Disebabkan oleh had kemudahan ABSL-3, kajian cabaran terhadap calon vaksin ini tidak dapat dilakukan dalam kajian ini. Walau bagaimanapun, dengan membandingkan dengan kajian yang boleh menukar bacaan tahap NAb kepada titer PRNT, titer PRNT pada purata 3log10 boleh melindungi tikus daripada jangkitan saluran pernafasan [61]. This implies that the NAb titers induced by pCMVkan-S DNA immunization in this study is potentially sufficient to provide protection. However, as the correlated protective immunity has not been established for COVID-19, a challenge study in animal model to provide efficacy data is still required.

In conclusion, this study provides crucial information regarding selection of antigens for SARS-CoV-2 vaccine development. SARS-CoV-2 full length S (S1+S2) is more potent in induction of both NAb and T cells responses than the truncated S1 or S2 immunogen. This finding could be further applied for development of other vaccine modalities.


Bidang Penyelidikan Utama

  • Kemasukan virus ke dalam sel
  • Peraturan ekspresi gen virus dan perumah
  • Mekanisme replikasi DNA virus
  • Biogenesis protein dan zarah virus
  • Tindakan faktor pertumbuhan virus dan molekul pertahanan imun
  • Penentu virulensi dan patogenik virus
  • Penjanaan peptida kelas I MHC
  • Kekhususan dan fungsi antibodi antiviral
  • Pembangunan vektor ekspresi rekombinan, vaksin calon, dan agen antivirus
  • Pelbagai virus DNA dan RNA, termasuk virus immunodeficiency manusia/simian, poxvirus, herpesvirus, papillomavirus, coronavirus, virus influenza, alphavirus dan flavivirus
  • Pelbagai kepakaran, termasuk biologi molekul, biologi sel, imunologi selular, imunologi humoral, karsinogenesis, virus rekombinan, vaksin, patogenesis virus dan mikrobiom

Applications of Cell-Free Protein Expression Systems

As our knowledge of cell-free expression systems and their capabilities has continuously expanded, researchers have been able to exploit the various advantages of these systems to develop novel protein technologies. We explore some of these unique applications below.

Functional Genome and Proteome Analysis

Cell-free protein synthesis provides a basic, straightforward tool to aid in the identification of protein and molecular interactions, such as protein-protein, protein-nucleic acid, and protein-ligand. In order to characterize these interactions, one of the desired entities (nucleotide/ligand/protein etc.) is labelled, then incubated in a CFPS system with the other desired entity. The resulting complex is then either isolated utilizing a technique like immunoprecipitation, or detected directly by a electrophoretic mobility-shift assay (EMSA), in which protein interaction complexes are slowed when compared to their unbound counterparts (5).

Cell-free protein expression systems are also valuable tools for manufacturing protein arrays. Protein microarrays are solid-phase ligand binding assay systems that are utilized to track protein activity and interaction, and to determine protein function in a high-throughput format. Traditional cell-based generation of these protein chips is a labor-intensive process which requires expression and purification of each individual protein to be arrayed. Another drawback is long-term functional stability of the immobilized proteins is usually limited. The use of CFPS can circumvent these challenges, through the parallel synthesis of multiple proteins directly in situ (on-chip).

There are several different types of protein microarrays being utilized in current research, including PISA (Protein In Situ Array), NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array) and DAPA (DNA Array to Protein Array) .

Rajah 5. Proteins produced in vitro in cell-free systems exhibit varying degrees of protein function or activity, depending on the factors necessary for correct synthesis, folding and cofactor incorporation. In this illustration the protein demonstrates luminescence once the essential cofactor ATP is present.

The PISA method, the first well-known cell-free in situ protein microarray technology, involves the rapid production of tagged proteins directly from DNA fragments by cell-free expression in solution. The individual DNA constructs that encode for the protein of interest contain a T7 promoter, sequences for translation initiation and termination, as well as an N- or C-terminal tag sequence. The DNA constructs are generated via PCR or RT-PCR utilizing a high fidelity TAQ polymerase, then cell-free coupled transcription and translation expresses the desired tagged proteins (25). Following synthesis, the proteins are simultaneously captured and immobilized in situ, by the tag-capturing coating on the surface of the slide (26).

NAPPA

NAPPA is a label-based technology, in which the DNA template is biotinylated and immobilized onto a slide pre-coated with avidin and an anti-GST antibody that functions as the protein capture reagent (27). The array can then be used for to express targeted proteins in situ by using rabbit reticulocyte lysate or similar CFPS system. Following translation, the targeted proteins are captured by the immobilized antibody in each spot, resulting in a protein array in which each protein is co-localized with its corresponding expression plasmid (28).

The NAPPA method has demonstrated particular value in the characterization of disease biomarkers and study of autoimmune disease. NAPPA-generated microarrays have been used to help identify new antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome, effectively pinpointing 8 proteins with tuberculosis biomarker value (29). NAPPA has also been utilized to characterize autoantibody response in patients with the autoimmune rheumatic disease Ankylosing spondylitis (30), to profile circulating and synovial antibodies in patients with juvenile idiopathic arthritis (31), and to detect antibodies that bind tumor antigens in breast cancer (32).

The DNA array to protein array (DAPA) method was developed as a means of producing protein arrays on demand by printing them from a single DNA array template. In this method, a slide containing an array of immobilized PCR-amplified fragments encoding for a set of tagged proteins is assembled face-to-face with a second slide, pre-coated with a protein tag-capturing reagent. A permeable membrane containing a cell-free lysate is then sandwiched between the two slide surfaces, enabling coupled transcription and translation. Protein synthesis originates from the spots of the immobilized DNA, and the synthesized proteins diffuse through the membrane and are immobilized on the capture slide surface, creating the protein array (33).

Expression of Difficult-to-Express Proteins

Cell-free protein expression systems provide a means to produce functional proteins that are typically difficult to express, such as membrane proteins, toxic proteins and viral proteins. Using a coupled CFPS system, a complex heterotetrameric and multiple disulfide-bridged IgG molecule has been assembled successfully and completely under suitable oxidation and folding conditions (34). Various cell-free systems have also successfully been used to synthesize membrane proteins in vitro, including G-protein-coupled receptors, epidermal growth factor receptor and ATP synthase (35).

In vitro translation systems have also been used to successfully express viral proteins, virus-like particles (VLPs) and vaccine antigens. In one study, 124 P. falciparum genes of interest were synthesized in vitro as potential malaria vaccine candidates, resulting in the successful synthesis of 75% of the products in soluble form, without the need for codon optimization. Cell-free E coli extract systems have been applied to synthesize both VLPs and vaccines, including anti-influenza VLPs, a B-cell lymphoma vaccine and anti-hepatitis B VLPs (35).

In vitro systems have effectively produced infectious encephalomyocarditis virus (EMCV), and the entire open reading frame of hepatitis C virus RNA has been correctly translated and processed when supplemented with canine microsomal membranes (5). These studies demonstrate the enormous potential of cell-free expression systems not only as valuable tools for understanding the mechanisms of viral replication, but also as a means for vaccine discovery and prospective platform for large-scale production of vaccines (5 35).

Protein Evolution and Enzyme Engineering

Proteins are complex, versatile molecules that serve a variety of functions in the cell. Directed protein evolution is a cyclic process of alternating between the selection of functional gene variants and gene diversification, that can be utilized as a means of improving certain types of protein functions, like catalytic activity, binding affinity and thermostability (4 36). Several unique protein technologies in directed evolution, including ribosome display, mRNA display and in vitro compartmentalization, have been developed in the last thirty years using in vitro translation systems. In comparison to cell-based methods, these in vitro technologies offer several advantages, including efficient linking of genetic information (genotype) to their encoded proteins (phenotype) and broader range of library sizes.

Ribosome Display

The ribosome display method involves isolating individual proteins from polypeptide DNA sequence libraries. During in vitro translation, protein-ribosome-mRNA (PRM) complexes are established by connecting the nascent polypeptide to its encoding mRNA (1).

This PRM of interest can then be captured through affinity binding via immobilized ligand, from which the mRNA can then be recovered and reverse transcribed back into cDNA to be mutated as desired. This process can also be repeated without mutating the recovered cDNA as a means of enriching target proteins from large populations (5).

The ribosome display technology (Figure 6) has been a popular method for in vitro selection and evolution of antibodies, as well as transcription factors, receptors, proteases, enzymes, novel peptides, tag sequences and ligand-binding domains and motifs (5). Ribosome display has also been utilized in proteomics applications, leading to the identification of a sequence of 5'-untranslated region that promotes translation efficiency (37), as well as comprehensive determination of antigenic proteins for a cDNA library of Staphylococcus aureus that could be used as potential vaccine candidates (38).

Rajah 6. This illustration depicts antibody-ribosome-mRNA (ARM) complexes, which have been used as display selection particles in an in vitro eukaryotic method for selection of antibody-combining sites. An important feautre of the ARM method is that it preserves the link between the peptide of interest and the gene that encodes it.

In mRNA display technology, a large DNA library encoding the polypeptide of interest is transcribed into mRNA. The 3’ end of mRNA is ligated to a short, single-strand DNA oligonucleotide which carries an adaptor molecule, typically puromycin. The modified mRNA product is translated via cell-free protein synthesis the puromycin enters the ribosome and forms a peptide bond with the nascent polypeptide chain. Then cDNA is generated via reverse transcription to stabilize the nucleic acid component and facilitate recovery of the genetic information following selection. This cDNA can then be amplified via PCR for further study or other use (39).

This mRNA display technology has been employed in the successful directed evolution of ligases as well as ATP-binding domains from artificial random-sequence libraries (40 41). mRNA display has also been applied to obtain antigen-binding proteins that were based on the scaffold fibronectin type III, resulting in production of high-affinity molecules capable of binding TNF-alpha (42) and recognition of specific endogenous phosphorylated IkBalpha (43).

In Vitro Compartmentalization

In vitro compartmentalization (IVC) is a method of directed evolution where the objective is to split up a large reaction into many microscopic compartments, which encapsulate DNA and its associated mRNA and protein(s), in either water-in-oil emulsion microdroplets or on the surface of microbeads. Each of these droplets contain a single gene, in addition to all the necessary molecular components required, which are then transcribed and translated. Proteins that express the desired activity convert substrate into a product that will remain linked to the gene, as they are completely confined to the microdroplet. Genes that are linked to the product are either selectively enriched, amplified and characterized, or linked back to the substrate and subjected to additional rounds of selection via compartmentalization. The IVC strategy has successfully been applied in the engineering of several enzymes, including methyltransferases, polymerase and restriction endonucleases (5 44).

Screenings

Incorporating cell-free expression systems into high-throughput screening applications enables both in situ and on-demand expression of proteins and peptides. These cell-free expression high-throughput screening applications can be categorized broadly into on-chip technologies and in vitro displays, several selection methods previously discussed in the Protein Evolution and Enzyme Engineering section.

In the in vitro display selection technologies, the expressed complexes are directly screened and tested for activity, and the linked genetic sequence is used in successive rounds of enrichment. On-chip selection technologies immobilize expressed proteins in treated surfaces without their source DNA or RNA (45).

There are a variety of high-throughput screening methods currently available, all of which are capable of streamlining the traditional screening process. These screening methods include microtiter plates, digital imaging, fluorescence-activated cell sorting (FACS), cell surface display, IVTC and resonance energy transfer (46).

In vitro translation followed by screening has largely been employed in medical applications, enabling the development of the Protein Truncated Test (PTT) (Figure 7) which utilizes open reading frames of genetic diseases caused by translation-terminating mutations as diagnostics (5). Cell-free protein expression systems have also enabled screening of toxic reagents (47) and identification of translation inhibitors as potential drugs (48). Screening and production of potential vaccine candidates via in vitro protein expression led to the identification of some effective vaccines that protected mice against tumors with the same efficacy as those produced in a mammalian cell (49).

Rajah 7. This diagram illustrates production of a truncated protein (right) as compared to a normal length protein (left) using the Protein Truncation Test. This test has been used, in vitro, to determine whether a gene mutation results in a shortened translation product that may lead to a cancerous cell.

Protein Labeling and Detection

Detection of proteins expressed using cell-free systems is necessary for most applications such as protein:protein interaction and protein:nucleic acid interaction studies. Traditionally, radioactive [ 35 S]methionine has been added to cell-free expression reactions, and the methionine is incorporated into the expressed protein, allowing detection by autoradiography. Many researchers are moving away from radioactivity due to high costs, regulations, radioactive exposure and waste disposal issues. Traditional Western blot analysis provided researchers with a non-radioactive method for detection but, if performed improperly, could result in high backgrounds. However, detection methods such as FluoroTect™ GreenLys in vitro Translation Labeling System (Cat.# L5001) and the Transcend™ Non-Radioactive Translation Detection System (Cat.# L5070, L5080) allow Western blotting with sensitive detection and low backgrounds (50).

The FluoroTect™ System employs a tRNA charged with a lysine that is labeled at the e position with the BODIPY ® -FL fluorophore. These fluorescently labeled lysine residues are incorporated into synthesized proteins during in vitro translation. The Transcend™ System relies on incorporation of biotinylated lysine residues into nascent proteins during translation. The biotinylated lysine is added to the translation reaction as a charged e-labeled biotinylated-lysine:tRNA complex (Transcend™ tRNA) rather than a free amino acid. After SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and electroblotting, biotinylated proteins can be visualized by binding Streptavidin-AP or Streptavidin-HRP, followed by colorimetric or chemiluminescent detection, respectively. Typically, these methods can detect 0.5–5ng of protein, with a sensitivity equivalent to that achieved with [ 35 S]methionine incorporation and autoradiographic detection.

Transcend&trade Non-Radioactive Translation Detection Systems

The Transcend&trade Non-Radioactive Translation Detection Systems enable non-radioactive detection of proteins synthesized in vitro. Using this system, biotinylated lysine residues are incorporated into nascent proteins during translation, eliminating the need for labeling with [ 35 S]methionine or other radioactive amino acids. Biotinylated lysine is added to the translation reaction as a pre-charged e-labeled biotinylated lysine-tRNA complex (Transcend&trade tRNA) rather than a free amino acid. After SDS-PAGE and electroblotting, the biotinylated proteins can be visualized by binding either Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Streptavidin-AP) or Streptavidin-Horseradish Peroxidase (Streptavidin-HRP), followed either by colorimetric or chemiluminescent detection. Typically, 0.5&ndash5ng of protein can be detected within 3&ndash4 hours after gel electrophoresis. This sensitivity is equivalent to that achieved with [ 35 S]methionine incorporation and autoradiographic detection 6&ndash12 hours after gel electrophoresis. For a detailed protocol and background information, please see Technical Bulletin #TB182 .

Rajah 8. Schematic representation of Transcend&trade tRNA structure.

The use of Transcend™ tRNA offers several advantages:

  • No radioisotope handling, storage or disposal is needed.
  • The biotin tag allows detection (0.5–5ng sensitivity).
  • The biotin tag is stable for 12 months, both as the Transcend™ tRNA Reagent and within the labeled proteins. It is not necessary to periodically resynthesize biotin-labeled proteins, unlike [ 35 S]-labeled proteins, whose label decays over time.
  • Labeled proteins are detected as sharp gel bands, regardless of the intensity of labeling or amount loaded on the gel, thus allowing the detection of poorly expressed gene products.
  • Results can be visualized quickly, using either colorimetric or chemiluminescent detection.

The precharged E coli lysine tRNAs provided in this system have been chemically biotinylated at the e-amino group using a modification of the methodology developed by Johnson et al. (1976). The biotin moiety is linked to lysine by a spacer arm, which greatly facilitates detection by avidin/streptavidin reagents (Figure 8). The resulting biotinylated lysine tRNA molecule (Transcend™ tRNA) can be used in either eukaryotic or prokaryotic in vitro translation systems such as the T N T ® Coupled Transcription/Translation Systems, Rabbit Reticulocyte Lysate, Wheat Germ Extract or E coli S30 Extract (52). Lysine is one of the more frequently used amino acids. On average, lysine constitutes 6.6% of a protein’s amino acids, whereas methionine constitutes only 1.7% (53).

Effects of Biotinylated Lysine Incorporation on Expression Levels and Enzyme Activity

Lysine residues are common in most proteins and usually are exposed at the aqueous-facing exterior. The presence of biotinylated lysines may or may not affect the function of the modified protein. In gel shift experiments, c-Jun synthesized in T N T ® Reticulocyte Lysate reactions and labeled with Transcend™ tRNA performed identically to unlabeled c-Jun (54).

Estimating Incorporation Levels of Biotinylated Lysine

Incorporation of radioactively labeled amino acids into proteins typically is quantitated as percent incorporation of the label added. This value can include incorporation of radioactivity into spurious gene products such as truncated polypeptides. Thus, percent incorporation values provide only a rough estimate of the amount of full-length protein synthesized and do not provide any information on translation fidelity. With Transcend™ tRNA reactions, it is difficult to directly determine the percent incorporation of biotinyl-lysines into a translated protein. An alternative means of estimating translation efficiency and fidelity in Transcend™ tRNA reactions is to determine the minimum amount of products detectable after SDS-PAGE. In all cases tested, we detected translation products in 1µl of a 50µl translation reaction using as little as 0.5µl of Transcend™ tRNA (Figure 9). The amount of biotin incorporated increases linearly with the amount of Transcend™ tRNA added to the reaction, up to a maximum at approximately 2µl.

Figure 9. Effects of Transcend&trade tRNA concentration on detection of proteins synthesized in vitro. Coupled transcription/translation reactions were performed. The indicated amounts of Transcend&trade tRNA (equivalent to 2.0, 1.0, 0.5 or 0µl) were added to the translation reactions prior to incubation at 30°C for 1 hour. One microliter of the reaction was used for SDS-PAGE. The separated proteins were transferred to PVDF membrane (100V for 1 hour). The membrane was blocked in TBS + 0.5% Tween ® 20 for 15 minutes, probed with Streptavidin-AP (45 minutes), washed twice with TBS + 0.5% Tween ® 20 and twice with TBS, and incubated with Western Blue ® Substrate for 2 minutes.

Capture of Biotinylated Proteins

Biotinylated proteins can be removed from the translation reaction using biotin-binding resins such as SoftLink™ Soft Release Avidin Resin (Cat.# V2011, V2012). Nascent proteins containing multiple biotins bind strongly to SoftLink™ Resin and cannot be eluted using “soft-release” nondenaturing conditions. SoftLink™ Resin is useful, however, as a substitute for immunoprecipitation.

Colorimetric and Chemiluminescent Detection of Translation Products

Biotin-containing translation product can be analyzed in either of two ways. The product can be resolved directly by SDS-PAGE, transferred to an appropriate membrane and detected by either a colorimetric or chemiluminescent reaction (Figure 10). Alternatively, biotinylated protein can be captured from the translation mix using a biotin-binding resin such as SoftLink™ Resin. This approach is useful as a replacement for immunoprecipitation of protein complexes.

Rajah 10. Schematic of colorimetric and chemiluminescent detection of translation products.

The FluoroTect™ Green Lys in vitro Translation Labeling System

The FluoroTect™ GreenLys in vitro Translation Labeling System uses a charged lysine tRNA molecule labeled with the fluorophore BODIPY ® -FL at the epsilon (e) amino acid position of lysine (Figure 11). For the FluoroTect™ System, lysine was chosen as the labeled amino acid because it is one of the more frequently used amino acids, comprising, on average, 6.6% of a protein’s amino acids. Detection of the labeled proteins is accomplished in 2–5 minutes directly “in-gel” by use of a laser-based fluorescent gel scanner. This eliminates any requirement for protein gel manipulation such as fixing/drying or any safety, regulatory or waste disposal issues such as those associated with the use of radioactively labeled amino acids. The convenience of non-isotopic “in-gel” detection also avoids the time-consuming electroblotting and detection steps of conventional non-isotopic systems. For a detailed protocol and background information about this system, please see Technical Bulletin #TB285.

Rajah 11. Structure of FluoroTect&trade Green Lys tRNA.


Tonton video: Tahapan dan Mekanisme Transkripsi DNA. Transkripsi DNA, Tahapan Awal Ekspresi Gen (Disember 2022).