Maklumat

1.14: Pemisahan Phosphatidylcholines Menggunakan HPLC Fasa Songsang - Biologi

1.14: Pemisahan Phosphatidylcholines Menggunakan HPLC Fasa Songsang - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

14.1 Objektif Pembelajaran

Makmal ini mempunyai 2 matlamat, (1) untuk mempelajari lebih lanjut tentang struktur lipid membran dengan bekerja dengan fosfatidilkolin dan (2) untuk mempelajari asas teknik kromatografi cecair (HPLC) berprestasi tinggi yang sangat penting, HPLC fasa terbalik. Anda harus menggunakan pengetahuan anda tentang struktur fosfatidilkolin untuk merasionalkan corak elusi daripada HPLC.

14.2 Fosfatidilkolin

Phosphatidylcholine ialah kelas penting lipid (biokimia hidrofobik). Kelas ini adalah salah satu juzuk utama membran biologi. Phosphatidylcholines mempunyai struktur yang sama. Untuk membina fosfatidilkolin, mulakan dengan gliserol. Komponen lain disambungkan kepada gliserol menggunakan ikatan ester. Dua asid lemak (asid karboksilik rantai panjang) diesterikan kepada dua kedudukan teratas gliserol. Kedudukan ketiga mengandungi fosfat dan kolin. Setiap fosfatidilkolin berbeza daripada kelasnya yang lain berdasarkan ciri-ciri molekul rantai asid lemak (Rajah 14.1).

14.3 Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)

Pemisahan fosfatidilkolin adalah sukar, tetapi boleh dilakukan menggunakan kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC). Teknik pemisahan ini bergantung pada melepasi penyelesaian (fasa bergerak) melalui lajur yang dibungkus dengan zarah yang sangat kecil (fasa pegun). Sesetengah zat terlarut tertarik dengan kuat kepada zarah ini, dan bergerak melalui lajur perlahan-lahan. Bahan larut ini melekat pada zarah untuk jangka masa tertentu dan kemudian "melompat" ke zarah seterusnya. Berbanding dengan gerakan fasa mudah alih, bahan terlarut ini adalah terencat. Bahan larut lain hanya tertarik kepada zarah dengan lemah dan boleh bergerak melalui lajur dengan cepat.

Pergerakan pembezaan zat terlarut membawa kepada pemisahan zat terlarut. Ini sering ditunjukkan sebagai kromatogram (Rajah 14.2).

Anda akan menggunakan HPLC fasa terbalik. Zarah dalam teknik ini diperbuat daripada silika (pasir) yang telah disalut dengan rantai alkana. Zat terlarut yang lebih hidrofobik lebih kuat tertarik kepada fasa pegun dan bergerak lebih perlahan melalui lajur. Anda akan mengasingkan lima sebatian fosfatidilkolin dengan struktur yang hampir sama (Rajah 14.3).

Fosfatidilkolin dengan rantaian asid lemak yang lebih panjang lebih kuat tertarik kepada fasa pegun. Panjang rantai asid lemak bergantung kepada:

- bilangan karbon,

– kehadiran ikatan rangkap cis. Setiap ikatan berganda cis menjadikan rantai bertindak seolah-olah ia adalah satu hingga dua karbon lebih pendek (kurang hidrofobik).

Antara lima fosfatidilkolin yang manakah akan anda ramalkan paling tertarik kepada fasa pegun? Yang manakah anda akan ramalkan akan paling kurang tertarik? Berdasarkan struktur PC, ramalkan susunan elusi daripada lajur.

14.4 Mengukur Kromatografi

Kejayaan perpisahan boleh diukur dalam beberapa cara yang berbeza. Pertama, pemisahan yang lebih cepat cenderung menjadi lebih baik, kerana penguji tidak perlu menunggu keputusannya terlalu lama. Bagi setiap bahan terlarut, masa pengekalan diukur. Ini ialah masa berlalu dari awal hingga apabila puncak zat terlarut meninggalkan lajur. Biasanya, masa ini dilaporkan relatif kepada masa elusi terpantas (masa yang diperlukan untuk pelarut melalui lajur, masa lompang). Jadi, kepantasan pemisahan diukur dengan pengekalan relatif atau faktor kapasiti (k´).

Menggunakan kromatogram dalam Rajah 14.2, Puncak A mempunyai masa pengekalan 9.3 min. Masa lompang untuk kromatogram ini ialah 2.0 min.

Puncak A dikekalkan pada lajur 3.6 kali lebih lama daripada fasa mudah alih.

Satu lagi ukuran kejayaan ialah memantau bentuk setiap puncak. Puncak tajam bermakna pemisahan yang lebih baik. Ini diukur dengan menentukan lebar puncak berbanding berapa lama puncak dikekalkan pada lajur.

Puncak A daripada Rajah 14.2 mempunyai masa pengekalan 9.3 min dengan lebar puncak 0.8 min.

[mathrm{N}=16kiri(frac{9.3 mathrm{~min}}{0.8 mathrm{~min}}kanan)^{2}=2162]

Pemisahan yang dilakukan dengan baik akan memberikan kecekapan dalam beribu-ribu.

Ukuran kejayaan ketiga adalah untuk mengukur berapa banyak pemisahan berlaku antara puncak jiran. Selektiviti ini dikira sebagai nisbah faktor kapasiti

Puncak A mempunyai k´= 3.6 manakala Puncak B mempunyai k´= 4.3. Ini bermakna, pemisahan antara Puncak A dan Puncak B ini mempunyai selektiviti 1.2. Puncak B dikekalkan 20% lebih lama daripada Puncak A. Pemisahan yang baik akan memberikan nilai selektiviti lebih daripada 1.1.

PROSEDUR

Reagen dan keperluan peralatan dikira setiap enam pasukan pelajar. Terdapat ~20% lebihan disertakan.

Peralatan/barang kaca yang diperlukan:

  1. Sistem HPLC standard 1 setiap 2 pasukan pelajar
  2. Lajur HPLC fasa terbalik C-18

Reagen yang diperlukan:

  1. 98% metanol
  2. 100 μl campuran fosfatidilkolin dilarutkan dalam metanol. Kepekatan stok untuk setiap fosfatidilkolin dalam campuran disenaraikan di bawah
    1. DMPC 10 mg/ml
    2. DPoPC 5 mg/ml
    3. DLPC 1 mg/ml
    4. POPC 5 mg/ml
    5. DOPC 5 mg/ml

Prosedur eksperimen:

  1. Lajur HPLC fasa terbalik analisis standard (C-18) diseimbangkan dengan 98% metanol - 2% air. Kadar aliran 1 ml/min adalah mudah.
  2. Setiap pemisahan menggunakan 10 μl sampel campuran fosfatidilkolin.
  3. Sampel mengandungi 10 mg/ml DMPC, 5 mg/ml DPoPC, 1 mg/ml DLPC, 5 mg/ml POPC, 5 mg/ml DOPC dalam metanol.
  4. Setiap pemisahan memerlukan kira-kira empat puluh minit.
  5. Ikut arahan pengajar anda mengenai pengendalian kromatografi HPLC.

Analisis data:

  1. Kira faktor kapasiti (pengekalan relatif) bagi setiap fosfatidilkolin.
  2. Tentukan kecekapan lajur (N) yang dikira menggunakan puncak DLPC.
  3. Kira selektiviti (α) antara (a) DMPC lwn. DPoPC, (b) DPoPC lwn. DLPC, (c) DLPC lwn POPC dan (d) POPC lwn DOPC.

Nota kepada Pengajar

Makmal ini dijadualkan untuk memaksimumkan penggunaan bilangan kromatografi yang terhad. Di institusi pengarang, kami menggunakan tiga mesin HPLC secara serentak. Dua pasukan pelajar (setiap pasukan terdiri daripada pasangan pelajar) diberikan kepada setiap kromatografi. Semasa satu pasukan menjalankan kromatografi, pasukan yang lain sedang menyelesaikan set masalah HPLC dalam makmal. Oleh itu, menjelang akhir tempoh, semua pasukan telah menyelesaikan percubaan kromatografi dan mempraktikkan pengiraan biasa yang diperlukan untuk menganalisis kromatogram.

HPLC Lipid Prelab

1. Lukiskan struktur setiap fosfatidil kolin yang akan anda asingkan semasa makmal (terdapat lima)!

2. Bulatkan bahagian hidrofobik setiap molekul!

3. Susun molekul ini berdasarkan hidrofobik daripada sekurang-kurangnya (5) kepada kebanyakan hidrofobik (1)!

4. Manakah antara lima PC yang anda akan ramalkan paling tertarik kepada fasa pegun? Yang manakah anda akan ramalkan akan paling kurang tertarik?

5. Berdasarkan struktur PC, ramalkan susunan elusi daripada lajur.

HPLC PhosphatidylcholinesRangka Laporan Makmal dan Pengagihan Mata

pengenalan

1. Beberapa ayat mentakrifkan matlamat/tujuan eksperimen ini. (3 mata)

Data

  1. Salinan kromatogram anda dengan setiap puncak dilabelkan dengan fosfatidilkolin tertentu. (10 mata.)

Keputusan (sila tunjukkan semua pengiraan)

  1. Faktor kapasiti (pengekalan relatif) untuk setiap fosfatidilkolin. (10 mata)
  2. Kecekapan lajur (N) dikira menggunakan puncak DLPC. (4 mata)
  3. Selektiviti (α) antara (a) DMPC lwn POPC dan (d) POPC lwn DOPC. (8 mata)

Analisis

  1. Fosfatidilkolin manakah yang boleh dipisahkan dengan jelas pada lajur ini. Jelaskan secara ringkas. (5 mata)
  2. Masalah (10 mata)

Set Masalah HPLC

(Ihsan Dikma Technologies. Chromatorex ialah tanda dagangan berdaftar Fuji Silysia Chemical Ltd. Dikma Technologies Inc. tidak bergabung dengan syarikat di atas.

1. (5 mata.) Kromatogram daripada Chromatorex-SMB kelihatan tidak sebaik kromatogram daripada Inspire. Kira kecekapan lajur (N) berdasarkan puncak 3. (Gunakan pembaris dan penukaran, 1 minit/6 mm.) Adakah ini bersetuju dengan kesimpulan dalam ayat pertama? Jelaskan secara ringkas.

(Ihsan daripada SIELC Technologies)

2. (5 mata.)Dengan hanya melihat kromatogram, susunkannya daripada pemisahan terbaik kepada pemisahan yang paling teruk. Menggunakan dua kromatogram yang boleh diukur, tentukan masa pengekalan untuk setiap puncak. (Anggarkan masa kepada 0.1 minit yang terdekat.) Kira faktor kapasiti untuk setiap puncak menggunakan 1.1 min sebagai masa lompang. Kemudian, hitung faktor selektiviti (α) untuk Puncak 1 lwn Puncak 2 dan Puncak 2 lwn Puncak 3. Adakah faktor selektiviti bersetuju dengan kedudukan anda? Jelaskan secara ringkas.


1.14: Pemisahan Phosphatidylcholines Menggunakan HPLC Fasa Terbalik - Biologi

Kaedah kromatografi cecair berprestasi tinggi telah diwujudkan untuk pengasingan alkenilasil, alkilasil, dan diasil asetilgliserol yang diperoleh daripada etanolamin gliserofosfolipid (EGP) dan untuk pengasingan spesies molekul individu daripada setiap kelas yang diasingkan. EGP telah diasingkan daripada otak lembu, dihidrolisiskan dengan fosfolipase C, dan asetilasi dengan anhidrida asetik. Tiga kelas diradylacetylglycerols diasingkan secara kuantitatif pada lajur silika mu Porasil. Kelas individu dipecahkan lagi pada lajur fasa terbalik Zorbax ODS. Dengan kuantiti kromatografi gas--cecair bagi setiap puncak, 29-33 spesies molekul berbeza telah dikenal pasti dalam setiap kelas. Untuk alkenylacyl-GPE, spesies utama ialah 18:1-18:1, 21.8%, dan 16:0-18:1, 14.8%. Asid lemak polienoik mendominasi pada kedudukan 2 diasil-GPE. Spesies utama ialah 18:0-22:6 (n-3), 25.5%, dan 18:0-20:4 (n-6), 15.8%. Tiga spesies alkylacyl-GPE, 18:0-20:6 (n-3), 16:0-22:4 (n-6), dan 18:0-22:4 (n-6), masing-masing menyumbang 10%.


Ringkasan

Aplikasi kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) menggunakan C30 matriks pegun fasa terbalik telah membolehkan pemisahan serentak karoten, xantofil, ubiquinon, tokoferol dan plastokuinon dalam satu kromatogram. Pengesanan tatasusunan fotodiod berterusan (PDA) memastikan pengenalpastian dan kuantifikasi sebatian selepas elusi. Aplikasi kaedah untuk pencirian varieti tomato transgenik dan mutan dengan kandungan isoprenoid yang diubah, saringan biokimia Arabidopsis thaliana, dan penjelasan cara tindakan racun herba peluntur diterangkan untuk menggambarkan kepelbagaian prosedur.


Penentuan RP-hPLC/ESI MS kedudukan rantai asil dalam fosfolipid

Jabatan Spektrometri Jisim Biomolekul, Institut Utrecht untuk Sains Farmaseutikal (UIPS) dan Pusat Penyelidikan Biomolekul Bijvoet, Universiti Utrecht, Peti Surat 80 082, 3508 TB Utrecht, Belanda

OctoPlus B.V., Zernikedreef 12, 2333 CL Leiden, Belanda

Makmal Biokimia Veterinar dan Institut Biomembran, Universiti Utrecht, Peti Surat 80 176, 3508 TD Utrecht, Belanda

Jabatan Spektrometri Jisim Biomolekul, Institut Utrecht untuk Sains Farmaseutikal (UIPS) dan Pusat Penyelidikan Biomolekul Bijvoet, Universiti Utrecht, Peti Surat 80 082, 3508 TB Utrecht, Belanda

OctoPlus B.V., Zernikedreef 12, 2333 CL Leiden, Belanda

Abstrak

Oleh kerana fosfolipid digunakan sebagai eksipien dalam banyak produk farmaseutikal, terdapat keperluan untuk strategi yang disahkan untuk mencirikan konstituen fosfolipid. Kami menerangkan kaedah spektrometri jisim pengionan HPLC/elektrospray fasa terbalik yang merupakan alternatif kepada rawatan fosfolipase A2 yang susah payah yang biasa digunakan untuk menentukan kedudukan rantai asil dalam fosfolipid. Sistem spektrometri jisim HPLC/elektrospray fasa terbalik ini (a) menunjukkan resolusi kromatografi yang baik untuk spesies molekul fosfatidilkolin, (b) membolehkan penentuan komposisi campuran kompleks fosfatidilkolin, dan, yang paling penting, (c) membenarkan penetapan yang jelas bagi kedudukan rantai asil pada tulang belakang gliserol dalam campuran POPC dan OPPC dan dalam campuran POPE dan OPPE.


Gabungan HPLC Fasa Terbalik, Spektroskopi Jisim dan Spektroskopi NMR untuk Pemisahan Pantas dan Pengenalpastian Cekap Phosphatidylcholines

Berkenaan dengan penglibatan manifold lipid dalam proses biokimia, analisis lipid utuh dan kurang tetivasi cecair badan serta ekstrak sel dan tisu masih merupakan tugas yang mencabar, jika maklumat molekul terperinci diperlukan. Oleh itu, kelebihan gabungan penggunaan kromatografi cecair tekanan tinggi (HPLC), spektrometri jisim (MS), dan spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR) akan ditunjukkan menganalisis tiga jenis ekstrak berbeza komponen membran fosfatidilkolin di mana-mana. Pada mulanya, pengubahsuaian fasa terbalik yang berbeza telah diuji pada fosfatidilkolin (PC) dengan nombor karbon berkesan (ECN) yang sama untuk kebolehgunaannya dalam analisis lipid. Keputusan telah diambil untuk memperbaiki pengasingan tiga jenis ekstrak PC semula jadi dan kaedah fasa terbalik (RP)-HPLC baharu telah dibangunkan. Spesies individu dicirikan oleh NMR satu dan dua dimensi dan mod ion positif atau negatif masa penerbangan empat kali ganda (q-TOF)-MS serta teknik MS/MS. Tambahan pula, kesan penindasan ion semasa pengionan elektrospray (ESI), kesukaran, had, dan kelebihan teknik analisis individu ditangani.

1. Pengenalan

Analisis lipid asli dan tidak diivatisasi dalam cecair badan serta ekstrak sel dan tisu masih merupakan tugas yang mencabar, khususnya, jika struktur molekul komponen individu perlu dikenal pasti dalam masa yang singkat. Komposisi lipid terdiri daripada kelas utama yang berbeza seperti asid lemak, lipid neutral, dan lipid dengan kumpulan kepala bercas positif atau negatif dengan subkelas manifold kepelbagaian struktur. Variasi dalam komposisi lipid dikaitkan dengan patologi yang berbeza seperti penyakit neoplastik dan neurodegeneratif, diabetes mellitus, dan banyak lagi. Tambahan pula, beberapa kelas lipid terlibat dalam kematian sel (apoptosis, nekrosis), isyarat selular dan merupakan prekursor untuk lisophospholipid (iaitu, lisophosphatidylcholine), diasilgliserol, dan asid fosfatik dan arakidonik [1-25].

1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (PC) mewakili konstituen utama membran sel. Ia terdiri daripada fosforilkolin kumpulan kepala polar yang dilekatkan pada kedudukan sn-3 gliserol dan asid lemak tepu dan tak tepu yang berbeza yang diesterkan kepada kedudukan sn-1 dan sn-2, di mana asid lemak dalam kedudukan sn-1 lebih disukai tepu sebagai peraturan. . Banyak kajian berurusan dengan PC pada masa lalu kerana kepentingan biokimia dan klinikalnya yang sangat tinggi dan banyak teknik analisis yang berbeza telah dicadangkan untuk mendapatkan gambaran tentang perolehan metabolik atau untuk mencirikan sisihan patofisiologi komposisi lipid asli. Kebanyakan teknik ini mengalami pelbagai kelemahan seperti memakan masa, tidak sensitif, merosakkan, atau tidak berkaitan dengan substruktur individu. Kromatografi gas (GC) [26–28], kromatografi lapisan nipis (TLC) [29–31], dan kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) [32–37] biasanya digunakan untuk analisis lipid. Teknik berasaskan GC adalah kuantitatif tetapi memerlukan teknik penyediaan sampel yang memakan masa. GC sering digunakan dalam kombinasi dengan TLC untuk pemisahan kelas lipid. Tompok-tompok pada plat TLC tercalar dan sisa-sisa asid lemaknya dianalisis apabila derivatisasi menjadi substrat yang meruap dan direkodkan oleh GC. Walau bagaimanapun, struktur molekul tepat lipid individu hilang kerana hidrolisis lipid sebelumnya. Pembelahan enzimatik ikatan ester menggunakan fosfolipase membolehkan hidrolisis berturut-turut bagi asid lemak sn-2 dan sn-1, tetapi ia agak memakan masa kerana kerja makmal yang sengit dan pencemaran kecil enzim membawa kepada keputusan palsu. HPLC menawarkan pengasingan kelas lipid menggunakan mod fasa biasa (NP) dan tambahan pula pengasingan mengikut residu asid lemak berbeza bagi lipid individu dalam mod fasa terbalik (RP). Dalam kes ini, pemisahan yang berjaya bergantung dengan jelas pada pemilihan fasa pegun yang sesuai. Sebagai alternatif, teknik berasaskan MS digunakan secara meluas, kerana ia pantas, sensitif dan hanya memerlukan penyediaan sampel kecil [38]. Penggunaan sistem MS resolusi tinggi memberikan akses kepada formula molekul. Di samping itu, pemecahan ciri mengenal pasti kelas lipid dan struktur molekul. Apabila digabungkan dengan sistem HPLC selektiviti mereka adalah lebih tinggi dan mendapat manfaat daripada kedua-dua teknik. Spektroskopi NMR mampu mengukur biomaterial utuh tanpa merosakkan tanpa sebarang derivatisasi sebelumnya. Terutamanya 31 P-NMR sangat sesuai untuk mengukur analisis kelas fosfolipid dan hanya memerlukan kurang penyediaan sampel [39-44]. Sekali lagi hanya maklumat kecil diperolehi berkenaan dengan sisa asid lemak. 1 Ukuran H-NMR juga digunakan secara meluas, kerana ia mengandungi lebih banyak maklumat tentang asid lemak secara umum, tetapi sambungan kepada tulang belakang gliserol hilang disebabkan pertindihan isyarat besar-besaran. 2D-NMR yang melibatkan nukleus 13 C memberikan lebih banyak resolusi dan lebih banyak maklumat tentang spesies individu, tetapi sensitiviti NMR yang rendah bagi isotop 13 C menghalang penggunaan pantas dan meluas teknik ini dalam analisis rutin [44-48].

Makalah ini membentangkan persediaan RP-HPLC yang cekap untuk memisahkan fosfatidilkolin, yang akhirnya boleh dilanjutkan untuk memisahkan fosfolipid kutub yang lain. Selepas itu alat HPLC digabungkan dengan potensi penugasan molekul yang sangat bermaklumat MS dan NMR [49]. Lima jenis pengubahsuaian fasa terbalik berasaskan silika telah diuji berkenaan dengan keupayaannya untuk memisahkan lipid yang mengandungi asid lemak dengan nombor karbon setara (ECN), iaitu bilangan atom karbon dalam rantai asid lemak tolak dua kali ganda bilangan bon. Lanjutan lipid oleh ikatan berganda C=C tidak akan mengubah hidrofobisiti. Prestasi semua lajur telah diuji pada campuran lima PC dengan ECN yang sama manakala dua daripadanya adalah isomer perlembagaan mengenai 1,2-kedudukan gliserol, yang lebih menghalang pemisahan.

Kemudian, lajur HPLC dengan prestasi terbaik digunakan untuk mencapai pemisahan garis dasar yang cekap bagi tiga ekstrak PC asli (kacang soya, otak lembu dan kuning telur). Tambahan pula, tingkah laku pemecahan MS dalam mod ion positif dan negatif disiasat untuk PC individu untuk mengenal pasti corak pemecahan ciri untuk kelas lipid ini dan sisa asid lemaknya. Spektrum NMR resolusi tinggi 1D dan 2D juga diperoleh untuk mengesahkan struktur molekul.

2. Bahan dan Kaedah

2.1. Bahan kimia

Metanol-d4 dan kloroform yang dinyahuteri, metanol (gred LC-MS), semua asid lemak, sebatian campuran ujian dipalmitoyl-phosphatidylcholine (DPPC), palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC), oleoyl-palmitoyl-phosphatidylcholine (OPPC), dioleoyl- phosphatidylcholine (DOPC), stearoyl-linoleoyl-phosphatidylcholine (SLPC), dan juga ekstrak kacang soya, otak lembu, dan kuning telur telah dibeli daripada Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Jerman). Air suling berganda diambil daripada sistem dalaman.

2.2. Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi

Sistem HPLC siri HP 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Jerman) telah digunakan. Isipadu suntikan ialah 3

L daripada piawaian yang disediakan dalam metanol. Lima lajur dengan fasa pegun berbeza telah diuji berkenaan dengan prestasi pemisahan mereka untuk analisis lipid: (1) jenis A bertutup berasaskan silika C18 (Nukleosil 100-5 C18, 250

3 mm), (2) jenis A fenil berasaskan silika (Nukleosil 100-5 C6H5, 250 4 mm), (3) jenis B berasaskan silika ketumpatan tinggi C18 (Nukleodur C18 Graviti, 5 m, 250 3 mm), (4) jenis B polimer berasaskan silika/berpaut silang C18 (Nukleodur C18 Isis, 5 m, 250 3 mm), (5) mod campuran fenil/C berasaskan silika jenis B18 (Nucleodur Sphinx RP, 5 m, 250 3 mm).

Semua lajur dan bahan HPLC adalah hadiah baik Macherey-Nagel (Düren, Jerman).

Lajur 3 mm dikendalikan pada kadar aliran 0.6 mL/min dan lajur 4 mm pada 1 mL/min. Fasa mudah alih telah dioptimumkan dengan menyesuaikan kandungan metanol dalam larian berbeza antara 90% dan 100% untuk fasa alkil dan antara 80% dan 100% untuk fasa fenil berkenaan dengan interaksi hidrofobik analit dengan pembungkusan RP.

Nucleodur Sphinx RP 8 mm dikendalikan dalam keadaan isokratik pada aliran 4.1 mL/min dengan fasa bergerak yang terdiri daripada metanol dan air (90 : 10) untuk pendekatan separuh persediaan. Untuk mengumpul spesies individu untuk pengukuran NMR, pengendali cecair Gilson 215 (Gilson International B.V., Bad Camberg, Jerman) telah digunakan. Suhu lajur dikekalkan pada 4

2.3. Spektrometri Jisim

Sistem perangkap ion LC esquire (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Jerman) digunakan untuk pengesanan spektrometri jisim bagi jisim mod ion positif dan negatif dan spektrum MS/MS setiap sebatian PC telah direkodkan. Voltan kapilari ditetapkan kepada

3800 V dan plat hujung diimbangi kepada 500 V dalam mod ion positif. Untuk HPLC, gas nebulizer ditetapkan kepada 40 psi, gas kering dan haba kering masing-masing ditetapkan kepada 10 L/min dan 30 C. Dalam kes infusi terus melalui pam picagari, gas kering dan nebulizer dikurangkan kepada 5 L/min dan 5 psi, masing-masing. Tenaga perlanggaran untuk eksperimen MS/MS telah dioptimumkan berkenaan dengan kestabilan ion prekursor.

MikroOTOF-Q yang dilengkapi dengan sumber ion Apollo ESI (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Jerman) telah digunakan untuk pengesanan jisim ketepatan. Voltan kapilari ditetapkan kepada 4500 V dan plat hujung diimbangi kepada 500 V dalam mod ion negatif. Gas nebulizer ditetapkan kepada 0.4 bar, gas kering dan haba kering masing-masing ditetapkan kepada 4 L/min dan 20 C. Untuk eksperimen MS/MS, tenaga perlanggaran kuadrupole ialah 42 eV/z. Formula molekul dijana dengan memadankan ketepatan jisim tinggi dan corak isotop (SigmaFit, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Jerman).

2.4. Resonans Magnet Nuklear

Semua sampel disimpan pada suhu 8 C sebelum pengukuran. Dalam kes sampel terlarut, pelarut telah disejat oleh aliran nitrogen yang lembut dan dilarutkan semula dalam CDCl3/ CD3OD (2 : 1). Spektrum NMR 1D ( 1 H, 13 C) dan 2D resolusi tinggi (HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC) dengan resolusi digital 1k titik data dalam F1 dan 4k titik data dalam dimensi F2 bagi setiap spesies PC telah diperoleh pada Bruker Spektrometer NMR DRX 600 MHz dilengkapi dengan probe TXI 5 mm (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten/Karlsruhe, Jerman).

3. Keputusan

3.1. Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi

Perbandingan lima lajur fasa terbalik yang berbeza mendedahkan tingkah laku berikut: Pengasingan campuran ujian pada bahan berasaskan silika jenis A menunjukkan hanya keputusan yang buruk untuk semua sebatian PC. Walaupun, nampaknya bahan Nukleosil memisahkan semua puncak dengan baik (lihat Jadual 1), pelebaran puncak yang melampau dan tailing yang berbeza merosakkan pemisahan puncak yang dipura-pura. Sebaliknya, bahan berasaskan silika jenis B memisahkan DPPC, DOPC, SLPC, dan POPC atau OPPC dengan baik. Walau bagaimanapun, dua isomer lipid POPC dan OPPC hanya dipisahkan dengan baik (Jadual 1) pada pembungkusan RP pautan silang polimer (ISIS). Dengan semua bahan RP adalah mungkin untuk memisahkan lipid yang mengandungi dua asid lemak tak tepu tunggal daripada lipid dengan satu atau dua asid lemak tepu atau satu asid lemak tak tepu. Masa pemisahan terpendek dengan puncak kromatografi yang tajam dicapai oleh fasa pegun mod campuran (Sphinx). Oleh itu, fasa pegun ini dipilih untuk memisahkan sebatian individu dalam ekstrak lipid sumber semula jadi.


Abstrak

Sphingomyelins dicirikan menggunakan gabungan kaedah HPLC fasa terbalik isokratik novel dengan pengesanan spektrometri jisim masa penerbangan semburan elektrik dan MS/MS dalam talian pilihan. Perlembagaan sphingomyelins ditentukan oleh eksperimen MS/MS. Pemisahan garis dasar bagi 17 sebatian ekstrak otak lembu (2 sebatian utama dan 15 sebatian kecil atau surih) telah dicapai dengan fasa bergerak yang terdiri daripada metanol, 2-propanol, THF dan air pada lajur RP-18-fenil. Secara selari, pecahan HPLC telah disampel kepada spektrometer NMR 600-MHz untuk memperoleh spektrum NMR 1D dan 2D dan untuk menjelaskan struktur molekul komponen sphingomyelin individu.

Kepada siapa surat-menyurat harus ditujukan. Telefon: 0049-421-218-2818. Faks: 0049-421-218-4264. E-mel: [emel protected]


4 KROMATOGRAFI CECAIR OF FLOROTANIN DAN TEKNIK SEHIFENA UNTUK ANALISIS KUANTITATIF

Penggunaan kromatografi cecair (LC) untuk mengukur komposisi phlorotannin dalam ekstrak makroalga dihadkan oleh kekurangan piawaian yang tersedia secara komersial. Satu-satunya standard untuk penentukuran yang boleh didapati secara komersial ialah monomer phloroglucinol.

Koivikko et al. mengukur kepekatan phlorotanin melalui penyepaduan puncak dalam ekstrak mentah daripada Fucus vesiculosus. 38 Ujian F-C digunakan untuk mengira TPC sebatian ini dan kemudian pekali korelasi Pearson dikira antara jejak individu kromatogram dan kandungan jumlah phlorotanin. Analisis statistik selanjutnya dilakukan untuk menilai sejauh mana variasi dalam profil kromatografi phlorotannin dapat menjelaskan variasi kandungan jumlah phlorotannins dengan menjalankan analisis regresi berganda. Percubaan pada kuantifikasi ini bagaimanapun tidak lengkap kerana kawasan puncak dalam profil kromatografi dipengaruhi oleh kepekaan sebatian terhadap pengesanan dan kestabilan sebatian di bawah keadaan analisis. 38 Oleh itu kajian lanjut perlu dilakukan dengan piawaian yang dicirikan untuk membangunkan sepenuhnya kaedah kualitatif analisis kromatografi cecair (HPLC) berprestasi tinggi.


1.14: Pemisahan Phosphatidylcholines Menggunakan HPLC Fasa Terbalik - Biologi

sebuah Institut Kimia, Universiti Graz, Universitaetsplatz 1, 8010 Graz, Austria
E-mel: [email protected]
Tel: +43 316 380 5318

Abstrak

Amanita muscaria, juga dikenali sebagai cendawan fly agaric, boleh mengumpul vanadium (V), dengan sehingga beberapa ratus mg V kg −1 jisim kering. Sudah lama diketahui bahawa V hadir dalam A. muscaria sebagai kompleks yang dipanggil amavadin, tetapi kaedah untuk penyiasatan pengedaran dan biosintesis amavadin dalam cendawan hilang. Di sini, kami menerangkan pembangunan kaedah sensitif pertama untuk penentuan amavadin dan sebatian lain yang mengandungi V dalam sampel persekitaran dengan menggunakan kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC) dan spektrometri jisim plasma (ICPMS) berganding induktif. Lajur pertukaran anion yang kuat berfungsi sebagai fasa pegun, dan fasa bergerak terdiri daripada penimbal ammonium sitrat berair dan etilenadiaminetetraacetate (EDTA). Kepekatan dan pH fasa mudah alih serta suhu lajur dinilai untuk mengoptimumkan pengasingan. Dengan kaedah terakhir, amavadin dielusi dalam masa kurang daripada 17 minit, dan had pengesanannya ialah 0.05 μg V L −1 . Selain itu, dua isomer sebatian dipisahkan antara satu sama lain dan boleh dikira secara bebas. Kaedah ini digunakan untuk ekstrak sampel badan buah-buahan A. muscaria. Kecekapan pengekstrakan ialah 74 ± 12%, dan amavadin menyumbang 75–96% daripada V yang diekstrak. Di samping itu, kepekatan ketara spesies V lain boleh dikesan, yang tidak pernah diterangkan sebelum ini. Keputusan kami menunjukkan bahawa spesiasi V dalam cendawan adalah lebih kompleks daripada yang diandaikan sehingga kini dan penyiasatan yang lebih mendalam mengenai perkara ini diperlukan. Kaedah yang dibangunkan membolehkan penyiasatan spesies V organik dan bukan organik dalam persekitaran, walaupun pada kepekatan rendah.


Rujukan

Pertubuhan Kesihatan Dunia. Demensia: Keutamaan Kesihatan Awam (Pertubuhan Kesihatan Sedunia, Geneva, 2012).

Sperling, R.A. et al. Ke arah mentakrifkan peringkat praklinikal penyakit Alzheimer: cadangan daripada kumpulan kerja Persatuan Penuaan-Alzheimer Kebangsaan mengenai garis panduan diagnostik untuk penyakit Alzheimer. Alzheimer & Dementia: Jurnal Persatuan Alzheimer 7, 280–292 (2011).

Hulstaert, F. et al. Peningkatan diskriminasi pesakit AD menggunakan tahap β-amyloid(1-42) dan tau dalam CSF. Neurologi 52, 1555–1562 (1999).

Small, S.A., Perera, G.M., De La Paz, R., Mayeux, R. & Stern, Y. Disfungsi serantau yang berbeza bagi pembentukan hippocampal di kalangan warga tua dengan penurunan ingatan dan penyakit Alzheimer. Ann. Neurol. 45, 466–472 (1999).

Klunk, W.E. et al. Pengimejan amiloid otak dalam penyakit Alzheimer dengan Pittsburgh Compound-B. Ann. Neurol. 55, 306–319 (2004).

Franceschi, C. et al. Meradang-penuaan. Perspektif evolusi mengenai immunosenescence. Ann. NY Acad. Sci. 908, 244–254 (2000).

Thambisetty, M. & Lovestone, S. Biomarker berasaskan darah bagi penyakit Alzheimer: mencabar tetapi boleh dilaksanakan. Biomark. Med. 4, 65–79 (2010).

Tibshirani, R. Regresi pengecutan dan pemilihan melalui laso. J. R. Stat. Soc. Ser. B Stat. Kaedah. 58, 267–288 (1996).

Hastie, T., Tibshirani, R. & Friedman, J. Elemen Perlombongan Data Pembelajaran Statistik, Inferens dan Ramalan. (Springer-Verlag, New York, 2008).

van Meer, G. & de Kroon, A.I. Peta lipid sel mamalia. J. Sel Sci. 124, 5–8 (2011).

Jones, L.L., McDonald, D.A. & Borum, P.R. Acylcarnitines: peranan dalam otak. Prog. Lipid Res. 49, 61–75 (2010).

Nitsch, R.M. et al. Bukti untuk kecacatan membran dalam otak penyakit Alzheimer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1671–1675 (1992).

Schaefer, E.J. et al. Kandungan asid docosahexaenoic plasma fosfatidilkolin dan risiko demensia dan penyakit Alzheimer: Kajian Jantung Framingham. Gerbang. Neurol. 63, 1545–1550 (2006).

Mulder, C. et al. Penurunan nisbah lysophosphatidylcholine/phosphatidylcholine dalam cecair serebrospinal dalam penyakit Alzheimer. J. Transm Neural. 110, 949–955 (2003).

Walter, A. et al. Glycerophosphocholine dinaikkan dalam cecair serebrospinal pesakit Alzheimer. Neurobiol. Penuaan 25, 1299–1303 (2004).

Prasad, M.R., Lovell, M.A., Yatin, M., Dhillon, H. & Markesbery, W.R. Perubahan fosfolipid membran serantau dalam penyakit Alzheimer. Neurokim. Res. 23, 81–88 (1998).

Pettegrew, J.W., Panchalingam, K., Hamilton, R.L. & McClure, R.J. Perubahan fosfolipid membran otak dalam penyakit Alzheimer. Neurokim. Res. 26, 771–782 (2001).

Haughey, N.J., Bandaru, V.V., Bae, M. & Mattson, M.P. Peranan untuk metabolisme sphingolipid yang tidak berfungsi dalam neuropatogenesis penyakit Alzheimer. Biochim. Biophys. Acta 1801, 878–886 (2010).

Kordower, J.H. & Fiandaca, M.S. Tindak balas sistem septohippocampal kolinergik monyet kepada transeksi forniks: analisis histokimia dan sitokimia. J. Comp. Neurol. 298, 443–457 (1990).

Kordower, J.H. et al. Otak depan basal monyet yang berumur: menyelamat dan menumbuhkan neuron otak depan basal yang diakstomisasi selepas cantuman sel berkapsul merembeskan faktor pertumbuhan saraf manusia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10898–10902 (1994).

Whitehouse, P.J., Price, D.L., Clark, A.W., Coyle, J.T. & DeLong, M.R. Penyakit Alzheimer: bukti kehilangan selektif neuron kolinergik dalam nukleus basalis. Ann. Neurol. 10, 122–126 (1981).

Hansson, O. et al. Persatuan antara biomarker CSF dan penyakit Alzheimer yang baru pada pesakit dengan gangguan kognitif ringan: kajian susulan. Neurol Lancet. 5, 228–234 (2006).

Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M. & Zetterberg, H. Cecair serebrospinal dan biomarker plasma dalam penyakit Alzheimer. Nat. Rev. Neurol. 6, 131–144 (2010).

Irizarry, M.C. Biomarker penyakit Alzheimer dalam plasma. NeuroRx 1, 226–234 (2004).

Ray, S. et al. Klasifikasi dan ramalan diagnosis Alzheimer klinikal berdasarkan protein isyarat plasma. Nat. Med. 13, 1359–1362 (2007).

Doecke, J.D. et al. Biomarker protein berasaskan darah untuk diagnosis penyakit Alzheimer. Gerbang. Neurol. 69, 1318–1325 (2012).

Roe, C.M. et al. Meningkatkan ketepatan biomarker CSF dalam meramalkan penyakit Alzheimer yang lazim dan kejadian. Neurologi 76, 501–510 (2011).

Fagan, A.M. et al. Nisbah tau / β-amyloid42 cecair serebrospinal sebagai ramalan penurunan kognitif pada orang dewasa yang lebih tua yang tidak mengalami kerosakan. Gerbang. Neurol. 64, 343–349 (2007).

Albert, M.S. et al. Diagnosis kemerosotan kognitif ringan akibat penyakit Alzheimer: cadangan daripada kumpulan kerja Persatuan Penuaan-Alzheimer Kebangsaan mengenai garis panduan diagnostik untuk penyakit Alzheimer. Demen Alzheimer. 7, 270–279 (2011).

Petersen, R.C. et al. Kemerosotan kognitif ringan: pencirian klinikal dan hasil. Gerbang. Neurol. 56, 303–308 (1999).

Espinosa, A. et al. Susulan membujur 550 pesakit gangguan kognitif ringan: bukti penukaran besar kepada kadar demensia dan pengesanan faktor risiko utama yang terlibat. J. Alzheimers Dis. 34, 769–780 (2013).

McKhann, G.M. et al. Diagnosis demensia akibat penyakit Alzheimer: cadangan daripada kumpulan kerja Persatuan Penuaan-Alzheimer Kebangsaan mengenai garis panduan diagnostik untuk penyakit Alzheimer. Demen Alzheimer. 7, 263–269 (2011).

Mahu, E.J. et al. Prosedur pemprofilan metabolik global untuk air kencing menggunakan UPLC-MS. Nat. Protoc. 5, 1005–1018 (2010).

Grebe, S.K. & Singh, R.J. LC-MS/MS di makmal klinikal - dari mana hendak dari sini? Clin. Biokim. Rev. 32, 5–31 (2011).

Illig, T. et al. Perspektif genom luas variasi genetik dalam metabolisme manusia. Nat. Genet. 42, 137–141 (2010).

Römisch-Margl, W.P.C., Bogumil, R., Röhring, C. & Suhre, K. Prosedur untuk penyediaan sampel tisu dan pengekstrakan metabolit untuk metabolomik disasarkan throughput tinggi. Metabolomik 7, 1–14 (2011).

Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M. & Speed, T.P. Perbandingan kaedah normalisasi untuk data tatasusunan oligonukleotida ketumpatan tinggi berdasarkan varians dan bias. Bioinformatik 19, 185–193 (2003).

Ma, S. & Huang, J. Kaedah ROC yang diselaraskan untuk klasifikasi penyakit dan pemilihan biomarker dengan data microarray. Bioinformatik 21, 4356–4362 (2005).

Liu, Z. & Tan, M. pemaksimuman fungsi utiliti berasaskan ROC untuk pemilihan ciri dan pengelasan dengan aplikasi kepada data protease berdimensi tinggi. Biometrik 64, 1155–1161 (2008).

Friedman, J., Hastie, T. & Tibshirani, R. Laluan penyelarasan untuk model linear umum melalui keturunan koordinat. J. Stat. Softw. 33, 1–22 (2010).


2. BAHAN-BAHAN DAN CARA-CARA

2.1 Bahan

Standard 3-hydroxybutyric acid (3-OH-FA (4:0)) garam natrium, (±)−3-hydroxyhexanoic acid (3-OH-FA (6:0)), (±)−3-hydroxyoctanoic acid (3-OH-FA (8:0)), (±)−3-hidroksidekanoik asid (3-OH-FA (10:0)), (±)−3-hidroksidodekanoik asid (3-OH-FA (12 :0)), (±)−3-hydroxy myristic acid (3-OH-FA (14:0)), dan rhamnolipid (R-95), dominan di-rhamnolipid (Rha), diperoleh daripada Sigma Aldrich (Steinheim , Jerman). Pelarut dan bahan tambahan yang digunakan untuk pengesanan MS adalah gred LC-MS. Metanol (MeOH), asetonitril (ACN), dan asid asetik (AcOH) diperoleh daripada Carl Roth (Karlsruhe, Jerman).

2.2 Penyediaan sampel piawaian

Disebabkan keterlarutan yang berbeza dalam air, akibat daripada panjang rantai yang berbeza-beza, 3-OH-FA (4:0), 3-OH-FA (6:0), dan 3-OH-FA (8:0) telah dibubarkan dalam H2O, manakala 3-OH-FA (10:0), 3-OH-FA (12:0), dan 3-OH-FA (14:0) telah dilarutkan dalam MeOH/H2O (6:4, v/v), kedua-duanya pada kepekatan 2 μg/mL.

2.3 Hidrolisis rhamnolipid

Untuk hidrolisis berasid, 5 mg rhamnolipid (R-95) digantung dalam 0.5 mL 2.7 M H2JADI4 dalam botol kaca bertutup skru. Isipadu 0.5 mL CHCl3 telah ditambah dan sistem dwifasa yang diperoleh dipanaskan pada 110°C selama 140 minit. Lapisan kloroform yang mengandungi asid lemak dikumpul, disejat hingga kering, dan seterusnya, dilarutkan dalam 1 mL MeOH.

Untuk hidrolisis alkali, larutan stok 5 mg rhamnolipid (R-95) dalam 0.5 mL MeOH (10 mg/mL) telah disediakan. Larutan stok (50 μL) dan larutan metanol 2N NaOH (50 μL) masing-masing ditambah kepada 900 μL larutan THF/MeOH (9:1, v/v) dan dikacau selama 2 jam pada suhu bilik (≈25 °C). Pelarut kemudian dikeluarkan di bawah vakum, sisa dicairkan dengan 200 μL air dan diasidkan dengan HCl 0.1 M kepada pH 2–3. Larutan itu kemudiannya diekstrak tiga kali dengan 200 μL etil asetat, gabungan lapisan organik tersejat hingga kering dan disusun semula dengan 100 μL MeOH/H2O (3:7, v/v). Larutan dicairkan sepuluh kali ganda (H2O) untuk analisis LC-MS.

2.4 Hidrolisis lipopeptida

Lipopeptida pertama kali dibubarkan dalam MeOH untuk mendapatkan larutan stok (10 mg/mL). Aliquot 50 μL (bersamaan dengan 500 μg) telah ditambah sehingga 1 mL dengan larutan 6 M asid hidroklorik deuterated (DCl/D).2O, 1:1, v/v) dalam botol kaca bertutup skru dan dipanaskan selama 24 jam pada 110°C. Asid hidroklorik telah disejat dalam penyejat berprestasi tinggi EZ-2 dari GeneVac (Ipswich, UK). Sisa diekstrak dengan 200 μL campuran air dan kloroform dalam nisbah 1:1 (v/v). Lapisan kloroform yang mengandungi asid 3-hidroksialkanoik telah disejat hingga kering menggunakan Genevac, dan sisanya disusun semula dengan 100 μL MeOH. Larutan dilarutkan sepuluh kali ganda dengan H2O untuk RP dan MeOH untuk ukuran HILIC. Lapisan berair juga telah disejat hingga kering dan digunakan untuk analisis asid amino (dilaporkan di tempat lain).

2.5 Instrumentasi

Pemisahan kromatografi kiral telah dilakukan pada sistem Agilent 1290 Infinity UHPLC (Waldbronn, Jerman) yang dilengkapi dengan pam binari (G4220A), termostat lajur (G1316A), dan autosampler PAL (CTC Analytics AG, Switzerland). Pemisahan dilakukan pada lajur CHIRALPAK IA-U (100 × 3.0 mm, 1.6 μm). Fasa mudah alih terdiri daripada air (MP-A) dan asetonitril (MP-B), kedua-duanya mengandungi 0.1% (v/v) asid asetik. Kecerunan berikut digunakan jika tidak dinyatakan sebaliknya: 0–2 min 10% MP-B, 2–20 min 10–100% MP-B, 20–22 min 100% MP-B, 22-22.1 min 100–10% MP-B dan 22.1-25 min 10% MP-B. Kadar alir ialah 300 μL/min, suhu lajur 40°C, dan isipadu suntikan 10 μL.

Pengesanan MS dilakukan pada spektrometer jisim AB SCIEX API 4000 MS/MS yang dilengkapi dengan TurboIonSpray (SCIEX, Ontario, Kanada) dalam mod pemantauan tindak balas terpilih (SRM).Parameter peralihan pemantauan tindak balas yang dipilih, termasuk masa tinggal, tenaga perlanggaran, dan potensi delustering (DP), telah dioptimumkan untuk setiap sebatian secara individu dan dipaparkan dalam Jadual 1. Jumlah masa kitaran ialah 385 ms. Semua pengukuran dijalankan dalam mod kekutuban negatif. Potensi keluar sel ditetapkan kepada -15 V, potensi masuk kepada -10 V, voltan sumber ion kepada -4500 V, suhu kepada 400°C, gas nebulizer dan tekanan gas pemanas kepada 30 psi, gas tirai ke 35 psi, dan gas pemisahan yang diaktifkan secara perlanggaran kepada 6 psi. Perisian PeakView 2.2 digunakan untuk analisis data.

Nama S1 S3 Masa tinggal (ms) CE DP
3-OH-FA (4:0) 103 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (6:0) 131.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (8:0) 159.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (10:0) 187.1 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (12:0) 215.2 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (14:0) 243.2 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (12:0) [M+1-H] – 132.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (14:0) [M+1-H] – 160.1 59.1 50 −15 −80

Kaedah Kromatografi dalam Pemisahan Asid Lemak Mono dan Politaktepu Rantai Panjang

Kajian ini membentangkan pelbagai sistem kromatografi, TLC, HPLC, GC, dan juga SFC, yang dibangunkan untuk pengenalpastian dan kuantifikasi yang tepat bagi asid lemak mono dan politaktepu rantai panjang daripada sampel yang berbeza dengan penekanan pada kesusasteraan terpilih yang diterbitkan pada dekad yang lalu. Hampir semua aspek seperti langkah pengasingan asid lemak (cis dan trans), fasa pegun, sistem pelarut, dan mod pengesanan dibincangkan.

1. Pengenalan

Asid lemak rantai panjang (LC-FA) ialah sebatian organik di mana panjang rantai hidrokarbon mungkin berbeza dari 10 hingga 30 karbon. Rantai hidrokarbon boleh tepu atau tidak tepu (mengandungi satu atau lebih ikatan berganda). Berdasarkan bilangan ikatan berganda, asid lemak tak tepu dikelaskan kepada kumpulan berikut [1, 2]: (i) asid lemak tak jenuh tunggal (asid monoenoik, MUFA), mengandungi satu ikatan berganda, contohnya, asid oleik, (ii) asid lemak tak tepu (asid polienoik, PUFA), mempunyai dua atau lebih ikatan rangkap, contohnya, γ-asid linolenik, (iii) eicosanoids, yang berasal daripada asid lemak polienoik, contohnya, prostaglandin.

Data literatur terkini menunjukkan bahawa kedua-dua asid lemak tak jenuh tunggal dan tak tepu politaktepu adalah sebatian penting biologi yang memainkan peranan penting untuk organisma hidup [3-17]. Kajian pemakanan manusia selama sepuluh tahun yang lalu menunjukkan bahawa PUFA serta MUFA adalah komponen utama diet penurun kolesterol [4, 7, 9]. Lebih-lebih lagi, terdapat banyak minat dalam kesan MUFA dan PUFA pada sistem imun dan keradangan [13]. Di antara pelbagai asid lemak tak jenuh tunggal, yang paling popular ialah asid oleik (C18:1n-9). Ia ditemui dalam tumbuhan (cth., minyak zaitun), haiwan, dan mikroorganisma. Penggunaan minyak zaitun mempunyai manfaat untuk pencegahan kanser kolon dan payudara [8]. Kajian semasa menunjukkan bahawa asid oleik memainkan peranan penting dalam pencegahan penyakit koronari (keupayaan untuk mengurangkan LDL-kolesterol) [7, 9]. Asid lemak tak tepu yang serupa dengan asid lemak tak tepu mono diedarkan secara meluas dalam alam semula jadi [18]. Terdapat tiga kelas asid lemak tak tepu yang biasa dalam tisu manusia [5]: yang ω-3 (n-3 PUFA), ω-6 (n-6 PUFA), dan ω-9 (n-9 PUFA) asid lemak. Bagi kumpulan asid lemak tak tepu yang dibincangkan juga tergolong dalam asid demospongik, campuran asid lemak rantaian sangat panjang, terutamanya C24–C30 dengan sistem ketidaktepuan 5,9 atipikal. Ia wujud dalam mikroorganisma, invertebrata laut, dan tumbuhan darat [19]. Sumber utama omega-3 adalah ikan, beberapa tumbuhan, dan alga hijau [20]. Alga oleaginous hijau adalah sumber berpotensi berikut ω-3 asid: eicosapentaenoic (EPA), docosahexaenoic (DHA), dan juga asid arakidonik (AA) daripada ω-6 kumpulan [21–23]. Omega-6 PUFA terdapat dalam kepekatan tinggi dalam bijirin serta dalam banyak biji dan daging. Dari sebab ini kita dapat melihat peningkatan dalam penggunaan makanan laut oleh manusia selama beberapa tahun lepas. Mikroorganisma oleaginous, sebagai sumber alternatif PUFA kepada yang lain seperti produk minyak haiwan, telah dikaji secara meluas. Protista kulat marin (Thraustochytrid) seperti Schizochytrium telah didapati sebagai novel, DHA dan EPA yang sangat baik ω-3 pengeluar asid lemak [24, 25]. Kertas kajian cemerlang yang dilakukan oleh Nichols menunjukkan bahawa banyak mikroorganisma termasuk bakteria marin telah dianggap sebagai pengeluar de novo utama n-3 PUFA [26]. Data literatur yang ada menunjukkan bahawa sejak beberapa tahun kebelakangan ini penyelidikan yang meluas telah dibuat untuk pengeluaran PUFA oleh kulat [27, 28]. Seperti yang dilaporkan oleh Arjuna di kalangan pelbagai mikroorganisma, sumber optimum asid lemak tak tepu omega-6 khususnya γ-asid linolenik (GLA) boleh menjadi kulat tertentu [27].

Umum mengetahui bahawa PUFA boleh menjejaskan banyak proses fisiologi termasuk kardiovaskular, saraf, dan fungsi imun, serta kanser. Penggunaan minyak yang kaya dengan n-3 LC-PUFA semasa kehamilan mengurangkan risiko kelahiran pramatang awal [12]. Kajian dengan primata bukan manusia dan bayi baru lahir manusia menunjukkan bahawa DHA adalah penting untuk perkembangan fungsi normal retina dan otak, terutamanya pada bayi pramatang [13, 29]. Kertas baru yang disediakan oleh Kaczmarski et al. menunjukkan peranan penting asid linoleik dan juga α-asid linolenik dalam beberapa gejala dermatitis atopik [17]. Oleh itu, dapat diperhatikan bahawa PUFA adalah sasaran nutraseutikal dan farmaseutikal yang penting [22].

Sehingga hari ini terdapat kekurangan pengetahuan tentang fungsi LC-PUFA dalam tisu dan sel mamalia di mana ia ditemui. Walau bagaimanapun, dinyatakan bahawa asid lemak tak tepu rantaian sangat panjang diketahui terkumpul dalam dua jenis penyakit peroksisom genetik utama, sindrom Zellweger dan adrenoleukodystrophy (X-ALD) berkaitan X, yang dicirikan oleh fenotip neurodegeneratif [30, 31]. Kajian Hama dan rakan sekerja menunjukkan kewujudan banyak jenis LC-PUFA dalam spesimen daripada pesakit Zellweger yang mencadangkan kemungkinan biomarker baru untuk penyakit peroksisom [31]. Kertas ulasan yang dilakukan oleh Agbaga dan rakan sekerja [32] meringkaskan pengetahuan semasa VLC-PUFA kepada peranan fungsi mereka dalam retina yang sangat diperkaya dalam PUFA dengan penekanan khusus pada elongases yang bertanggungjawab untuk sintesisnya oleh protein ELOVL4. Minat terhadap LC-PUFA telah dihidupkan semula pada tahun 1987 selepas LC-PUFA pada mulanya dikesan dalam retina lembu oleh Aveldano [33]. Kesan LC-PUFA retina pada fotoreseptor rod dan kon juga diterangkan oleh Bennett et al. [34]. Satu lagi kertas kerja yang disediakan oleh Butovich mengesahkan bahawa, antara tisu mamalia yang berbeza, meibum adalah campuran yang sangat kompleks pelbagai asid lemak [35].

Oleh kerana kebanyakan LC-PUFA termasuk asid lemak omega-3 dan omega-6 tidak dapat disintesis dalam kuantiti yang mencukupi oleh organisma manusia, ia mesti dibekalkan dalam diet. Masalah penambahan LC-PUFA dan penerokaan sumber baru (alternatif kepada ikan minyak) LC-PUFA (cth., mikroalga marin) diterangkan secara meluas selama beberapa tahun dalam banyak kertas kerja. Atas sebab ini, terdapat keperluan untuk mencari kaedah yang berkesan dan pantas untuk mengenal pasti dan mengkuantifikasi asid lemak mono dan poli tak tepu rantai panjang yang baru dibangunkan dalam tumbuhan dan makanan laut. Satu set pelbagai alat seperti kaedah kromatografi juga diperlukan untuk melengkapkan ciri struktur penuh PUFA dalam sampel mamalia, contohnya, dalam plasma manusia, otak, retina atau meibum. Ini penting untuk tujuan diagnosis klinikal.

Oleh itu, ulasan ini membentangkan pelbagai sistem kromatografi, TLC, HPLC, GC, dan juga SFC, sesuai untuk pengasingan dan kuantifikasi tepat asid lemak mono dan politaktepu rantai panjang daripada sampel yang berbeza dengan penekanan pada literatur terpilih yang diterbitkan pada dekad yang lalu.

2. Kromatografi Lapisan Nipis (TLC) Asid Lemak Mono dan Politaktepu Rantai Panjang

Asid lemak rantai panjang tepu dan tak tepu (MUFA dan PUFA) adalah unsur struktur asas lipid. Oleh itu, penentuan kromatografi komposisi asid lemak oleh TLC termasuk kandungan LC-MUFA dan LC-PUFA adalah wajib untuk analisis lipid dalam makanan, pertanian, dan juga dalam sampel biologi [36-39]. Selain itu, asid lemak mono dan politaktepu boleh ditentukan secara kromatografi oleh TLC dalam lipid daripada organisma akuatik (cth., ikan laut dan air tawar, ikan kerang, dan alga laut) [40].

Telah diketahui umum bahawa kromatografi lapisan nipis adalah kaedah klasik pengasingan, pengenalpastian, dan kuantifikasi asid lemak [41]. Tinjauan literatur dari dekad lalu yang didedikasikan untuk analisis lipid menunjukkan bahawa, antara kaedah analisis yang berbeza, kromatografi lapisan nipis (TLC) dan kromatografi lapisan nipis berprestasi tinggi (HPTLC) versi modennya masih merupakan alat yang sangat penting dalam lipid dan juga dalam lemak. analisis asid. Seperti yang dilaporkan oleh Fuchs et al. [41], terdapat banyak kelebihan yang menjadikan TLC sangat kompetitif dengan HPLC (kromatografi cecair berprestasi tinggi) dalam bidang asid lemak seperti kesederhanaan penggunaan, kos yang lebih murah, penggunaan pelarut yang kecil berbanding dengan HPLC, ketersediaan analisis beberapa sampel secara selari, dan kemungkinan visualisasi mudah asid lemak tak tepu selepas pecahan TLC dengan menggunakan pewarna yang sesuai [41]. Laporan Sherma mengenai analisis TLC dalam sampel makanan dan pertanian mengesahkan bahawa HPTLC kuantitatif yang dilengkapi dengan densitometer boleh menghasilkan keputusan yang setanding dengan yang diperoleh melalui penggunaan kromatografi gas (GC) atau kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC) [42].

Topik moden dalam analisis TLC bagi asid lemak mono dan poli tak tepu ialah penggunaan kromatografi lapisan nipis berprestasi tinggi dalam kombinasi dengan pengesanan spektrometri jisim, contohnya, HPTLC-MALDI-TOF/MS [43-48]. Kajian penyelidikan menunjukkan bahawa pengesanan MS adalah alat yang berkuasa untuk mengenal pasti bintik-bintik TLC dengan lebih terperinci berbanding dengan kaedah pewarnaan tradisional [41].

Banyak jenis fasa pegun yang dikelaskan sebagai normal (NP) dan terbalik (RP) digunakan untuk analisis TLC asid lemak (MUFA dan PUFA). Lapisan NP yang paling popular ialah gel silika, alumina, selulosa, kanji, poliamida, dan kieselguhr [42]. Daripada semua fasa pegun yang disebutkan di atas, yang terbaik ialah gel silika, yang boleh diubah suai tambahan dengan impregnasi dengan agen yang berbeza. TLC fasa terbalik biasanya dilakukan pada lapisan RP-18, RP-2, atau RP-8 yang terikat secara kimia [42].

Banyak kertas penyelidikan oleh Nikolova-Damyanova dan pengarang lain menunjukkan bahawa sebab utama yang menjelaskan mengapa TLC memainkan peranan penting dalam analisis asid lemak ialah ketersediaan pelbagai penjerap komersil dan buatan sendiri termasuk plat TLC yang diresapi [36, 41, 49-51] . Impregnasi plat TLC dengan reagen yang betul boleh meningkatkan resolusi kelas sebatian organik yang berbeza termasuk asid lemak. Di antara pengubahsuaian berbeza fasa pegun yang digunakan dalam TLC, gel silika yang diresapi adalah penjerap yang sangat sesuai untuk analisis MUFA dan PUFA [41].

2.1. Pemisahan MUFA dan PUFA dengan Penggunaan Plat TLC yang Diresapi

Salah satu prosedur impregnasi TLC yang digunakan terutamanya untuk mengasingkan asid lemak dalam sampel lipid kompleks ialah TLC ion perak (Ag-TLC). Maklumat terperinci tentang Ag-TLC asid lemak tepu dan tak tepu telah dilakukan dalam beberapa kertas dan buku [36, 49-51]. Kromatografi ion perak adalah berdasarkan keupayaan Ag + untuk membentuk kompleks pemindahan cas boleh balik yang lemah dengan

elektron ikatan berganda asid lemak tak tepu [36, 52]. Pengekalan asid lemak tak tepu rantai panjang bergantung kepada kekuatan kompleksasi dengan Ag (I), pada bilangan ikatan berganda dan konfigurasinya, dan juga pada jarak antara ikatan berganda. Data literatur menunjukkan bahawa kedua-dua plat kaca buatan sendiri dan prasalut digunakan dalam Ag-TLC [51]. Prosedur am penyediaan fasa pegun untuk teknik kromatografi ion perak telah dikaji oleh Momchilova dan Nikolova-Damyanova, pada tahun 2003 [53]. Di antara pelbagai penjerap TLC yang ada, gel silika adalah bahan sokongan utama [53]. Impregnasi lapisan nipis dilakukan dengan menyembur atau merendam plat dalam larutan perak nitrat pada kepekatan 0.5–20% (dalam kes rendaman), manakala untuk prosedur penyemburan 10–40% larutan perak nitrat disyorkan [51, 53]. Fasa bergerak yang digunakan dalam TLC argentasi biasanya terdiri daripada dua atau tiga komponen, contohnya, heksana, eter petroleum, benzena, dan toluena. Selain itu, sejumlah kecil aseton, dietil eter, etanol, metanol, atau asid asetik boleh ditambah kepada fasa mudah alih ini [40]. Daripada pelbagai agen visualisasi tompok, yang paling popular untuk Ag-TLC asid lemak ialah 50% larutan etanol asid sulfurik, asid fosfomolibdik dan campuran asid kuprum-asetat-fosforik. Kaedah visualisasi lain ialah menyembur plat dengan penunjuk pendarfluor sebanyak 2',7'-dichlorofluorescein dalam etanol dan seterusnya melihat bintik-bintik di bawah cahaya UV [36]. Peraturan penghijrahan am dalam analisis Ag-TLC asid lemak diterangkan oleh Nikolova-Damyanova dan rakan sekerja [53, 54]. Menurut cadangan Nikolova-Damyanova, pengekalan asid lemak dengan lebih daripada satu ikatan berganda bergantung kepada jarak antara ikatan dan susunan elusi adalah seperti berikut: ikatan rangkap dua yang dipisahkan asid lemak > ikatan rangkap dua terputus > ikatan rangkap dua terkonjugasi rantaian lebih panjang asid lemak tak tepu. (LC-PUFA) dipegang kurang kuat daripada asid lemak rantai pendek dan asid lemak dengan trans ikatan rangkap dua dipegang kurang kuat daripada asid lemak dengan cis ikatan berganda [53, 54].

Salah satu analisis Ag-TLC pertama bagi asid lemak telah dilakukan oleh Wilson dan Sargent pada tahun 1992 untuk memisahkan PUFA yang mempunyai kepentingan fisiologi. Ester metil PUFA diasingkan pada gel silika 60 plat TLC yang diresapi dengan AgNO3. Plat telah dibangunkan dengan toluena-acetonitrile (97 : 3, v/v). Visualisasi bintik-bintik dibuat dengan menggunakan 3% kuprum asetat-8% asid ortofosforik. Telah dinyatakan bahawa teknik ini amat berguna untuk kajian metabolik rantai PUFA memanjang [55]. Dalam kerja lain Wilson dan Sargent menunjukkan bahawa plat TLC yang diresapi perak nitrat membantu dalam pengasingan asid lemak tak tepu tunggal (sebagai metil ester) daripada politaktepu dan juga daripada asid lemak tepu, masing-masing, dalam kajian metabolik asid lemak oleh fibroblas kulit manusia [56]. ]. Kerja seterusnya oleh Lin et al. menunjukkan bahawa gel silika dan heksana-kloroform-dietil eter-asetik asid (80 : 10 : 10 : 1, v/v/v/v) adalah baik dalam analisis asid docosahexaenoic (22 : 6 DHA) dalam spermatozoa monyet [ 57]. Fosfolipid individu daripada sampel ini diasingkan oleh sistem lain seperti kloroform-metanol-petroleum eter-asid-borik asid (40 : 20 : 30 : 10 : 1.8, v/v/v/v/v). Data literatur lain mengesahkan bahawa kromatografi gel silika argentat membolehkan mendapatkan asid eicosapentaenoic ketulenan tinggi yang diekstrak daripada mikroalga dan minyak ikan [58]. Kajian literatur baru-baru ini yang tertumpu pada kromatografi TLC menunjukkan bahawa, antara bahan kromatografi yang berbeza, Ag-TCM-TLC (gel silika perak-thiolat) adalah sangat stabil (berbanding dengan plat Ag-TLC yang sangat sensitif cahaya) untuk analisis TLC bagi tak tepu. sebatian organik termasuk MUFA dan PUFA. Dillon et al. [59] mengesahkan bahawa sistem Ag-TCM-TLC beroperasi serupa dengan Ag-TLC dengan mengasingkan asid lemak pada tahap tak tepu (bilangan ikatan berganda). Keputusan analisis ini adalah setanding dengan yang diperolehi oleh Ag-TLC. Kaedah Ag-TCM-TLC digunakan untuk menganalisis beberapa polihidrokarbon dan juga metil ester asid lemak tak tepu yang mengandungi daripada 0 hingga 6 ikatan berganda dalam bentuk metil ester. Campuran yang terdiri daripada heksana-etil asetat (9 : 1, v/v) digunakan sebagai fasa bergerak. Di bawah keadaan ini pengasingan lengkap asid lemak dengan 0-5 ikatan berganda diperhatikan. Resolusi asid lemak yang terdiri daripada 6 ikatan rangkap daripada yang lain tidak dicapai dalam kes ini [59].

Keputusan yang dibentangkan dalam bahagian ini menunjukkan bahawa pelbagai plat gel silika komersial digunakan dalam pengasingan asid lemak tak tepu, tetapi sebahagian daripadanya tidak sesuai untuk proses derivatisasi melalui metilasi asid lemak pada plat TLC dan seterusnya kuantifikasinya dengan kromatografi gas, kerana ia menyebabkan kehilangan asid lemak yang dipisahkan [60]. Prosedur metilasi asid lemak selepas pecahan sebelumnya pada gel silika argentat digunakan dalam analisis asid lemak tak tepu daripada biji yang kaya dengan lipid. Dalam kes ini campuran asid heksana-dietil eter-asetik dan 70 : 30 : 1 (v/v/v) digunakan sebagai fasa bergerak. Plat telah disembur dengan larutan etanol 2', 7'-dichlorofluorescein dan seterusnya dikenal pasti di bawah lampu UV (pada 365 nm) [60]. Kesan gel Ag-silika pada analisis TLC bagi asid lemak metilasi, contohnya, c9,t11-CLA (isomer asid linoleik) dalam plasma manusia sebagai langkah awal sebelum pengiraan GC ditunjukkan oleh Shahin et al. [61]. Satu lagi kertas kerja disediakan oleh Kramer et al. menunjukkan bahawa teknik terbaik untuk menganalisis CLA dan trans 18 : 1 isomer dalam produk sintetik dan haiwan ialah gabungan kromatografi gas dengan Ag-TLC atau dengan Ag-HPLC [62]. Selain itu, penggunaan Ag-TLC dalam pengasingan bentuk isomer EPA dan DHA yang diperolehi selepas pengisomeran kimia mereka (semasa penyahbauan minyak ikan) boleh didapati dalam kertas oleh Fournier et al. [63].

Aplikasi baharu Ag-TLC ialah bioanalisis. Kaedah TLC yang mudah dan pantas untuk analisis tahap PUFA dalam darah manusia telah dibangunkan oleh Bailey-Hall et al. [64].

Perlu dinyatakan bahawa, selain pengubahsuaian gel silika dengan ion Ag +, garam logam berikut, Cu(I), Cu(II), Co(III), dan Zn(II), boleh digunakan untuk impregnasi Plat TLC [41, 65]. Satu lagi jenis agen impregnasi untuk analisis TLC asid lemak (MUFA dan PUFA) ialah asid borik. Telah dinyatakan bahawa metabolit asid arakidonik telah diasingkan dengan memuaskan pada gel silika yang diresapi dengan asid borik sebagai agen pengkompleks dan oleh fasa mudah alih: heksana-dietil eter (60 : 40, v/v) [41, 65]. Pengubahsuaian fasa pegun seterusnya yang memberi kesan ke atas kesan resolusi asid lemak dan terbitannya seperti metabolit (cth, fosfolipid) ialah EDTA dan fasa bergerak yang mengandungi air asid kloroform-metanol-asetik dalam komposisi isipadu 75 : 45 : 3 : 1 [ 41, 66]. Kerja lain menunjukkan bahawa pemisahan yang cekap lima fosfolipid berbeza boleh dicapai dengan impregnasi plat TLC dengan 0.4% ammonium sulfat. Campuran kloroform-metanol-asid aseton-air dalam komposisi isipadu 40 : 25 : 7 : 4 : 2 adalah sesuai untuk prosedur ini [67].

Selain sistem TLC dalam fasa normal (NP-TLC), asid lemak tak tepu dan metabolitnya boleh diasingkan pada plat RP-TLC. Salah satu laporan pertama yang memberi tumpuan kepada analisis RP-TLC PUFA telah dibuat oleh Beneytout dan rakan sekerja pada tahun 1992 [68]. Beneytout et al. asid arakidonik dipisahkan dan metabolitnya pada lapisan fasa terbalik. Plat adalah gel silika yang disalut dengan fenilmetilvinilklorosilane.Campuran asid heptana-metil formate-dietil eter-asetik (65 : 25 : 10 : 2, v/v/v/v) digunakan sebagai fasa bergerak [68].

2.2. 2D-TLC MUFA dan PUFA

TLC dua dimensi (2D-TLC) ialah salah satu alat berkuasa yang baru dibangunkan untuk memisahkan pelbagai campuran lipid dan asid lemak yang datang daripada lipid. Adalah diketahui bahawa 2D-TLC meningkatkan kualiti pemisahan, tetapi ia lebih memakan masa berbanding dengan 1D-TLC yang sangat popular [41]. Kajian literatur menunjukkan bahawa 2D-TLC adalah kaedah pilihan untuk pemisahan lipid daripada polyphosphoinositides membran sel dan juga produk pengoksidaan lipid dalam campuran. Analisis ini biasanya dilakukan pada gel silika yang diresapi dengan magnesium asetat (7.5%) dan oleh sistem pelarut kloroform-metanol-ammonia (5 : 25 : 5, v/v/v) dalam arah pertama dan kloroform-acetone-methanol-acetic. air asid (6 : 8 : 2 : 2.1, v/v/v/v) dalam dimensi kedua [69].

2.3. Pengesanan Bintik dan Kaedah Kuantifikasi MUFA dan PUFA

Pengesanan asid lemak dengan kaedah TLC adalah berdasarkan visualisasinya dengan mengikat kepada pewarna. Seperti yang dilaporkan dalam ulasan yang sangat baik oleh Fuchs et al. [41] banyak reagen visualisasi yang sesuai untuk pengesanan asid lemak diterangkan dalam literatur. Antaranya, reagen yang paling popular ialah wap iodin, 2′,7′-dichlorofluorescein, rhodamine 6G, yang menghasilkan bintik-bintik berwarna, dan juga primulin, yang memberikan sensitiviti dalam julat nanomole [41]. Dalam kes PUFA kegelapan sengit dicapai selepas pemisahan mereka pada AgNO3 plat TLC yang diresapi (sebagai kesan pengurangan Ag + kepada perak koloid), tetapi kaedah pengesanan ini memerlukan kehadiran hidrokarbon aromatik sebagai komponen fasa mudah alih [70]. Reagen penggambaran lain adalah seperti berikut: asid sulfurik, kalium dikromat dalam 40% asid sulfurik, atau 3–6% larutan kuprik asetat dalam asid fosforik. Selain itu, pengesanan asid lemak yang berbeza adalah mungkin oleh PMA (asid phosphomolybdic) dan oleh wap sulfuril klorida [41]. Visualisasi bintik asid lemak dilakukan dengan menyembur atau mencelupkan plat dalam larutan agen visualisasi masing-masing. Seterusnya, bintik-bintik diperhatikan di bawah cahaya UV atau dikenal pasti dengan densitometri. Untuk pencirian asid lemak yang lebih terperinci yang telah dipisahkan oleh kromatografi lapisan nipis, TLC digabungkan dengan spektrometer jisim (TLC-MS) boleh digunakan. Dalam kaedah ini bintik-bintik dielusi daripada plat kromatografi dengan pelarut masing-masing dan asid lemak yang diperoleh seterusnya dianalisis oleh MS. Penggunaan TLC ditambah dengan MS membolehkan resolusi tinggi bagi puncak yang dikenal pasti. Selain itu, tidak ada keperluan untuk mengekstrak sampel daripada plat sebelum analisis ini [41]. Kebaharuan dalam instrumentasi kromatografi lapisan nipis ialah TLC dalam kombinasi dengan spektrometer MALDI MS (TLC MALDI) [44, 71, 72]. Teknik ini agak pantas dan menyediakan spektrum yang boleh dianalisis secara relatif dan bertolak ansur dengan pencemaran sampel yang tinggi [41]. Had pengesanan asid lemak yang ditentukan oleh TLC MALDI mungkin kurang daripada 1 nanogram [41]. Telah dinyatakan bahawa TLC MALDI boleh digunakan dengan memuaskan untuk campuran lipid yang sangat kompleks (contohnya, ekstrak daripada sel stem) [47]. Contohnya, melalui gabungan kromatografi lapisan nipis dan analisis MALDI-TOF/MS bagi jumlah ekstrak lipid arkeon hipertermofilik. Pyrococcus furiosus telah dilakukan [45]. Trend moden seterusnya dalam analisis profil lipid ialah penggunaan kaedah TLC ditambah dengan FID (pengesan pengionan api) [73]. Chromarod/Iatroscan TLC-FID telah berjaya digunakan dalam analisis kelas lipid dan konstituennya bagi asid lemak yang diekstrak daripada makanan laut. Seperti yang diterangkan dalam kertas oleh Sinanoglou et al. [73], Iatroscan ialah instrumen yang menggabungkan resolusi TLC dengan kapasiti kuantifikasi oleh FID. Pemisahan TLC-FID yang cekap boleh dicapai dengan penambahan sistem pelarut polar tanpa mengubah fasa pegun. Walau bagaimanapun, radas ini membolehkan analisis dalam masa yang singkat (2-3 jam) berbanding dengan GC atau HPLC kira-kira 30 sampel [73].

2.4. TLC Pemisahan daripada cis dan trans Isomer MUFA dan PUFA

Oleh kerana dilaporkan bahawa asid lemak tepu menunjukkan korelasi dengan penyakit kardiovaskular, asid lemak tak tepu telah disyorkan untuk menggantikan asid lemak tepu dalam diet. Atas sebab ini, peningkatan minat dalam asid lemak tak tepu seperti asid lemak n-6 dan n-3 diperhatikan. Adalah diketahui bahawa asid lemak tak tepu yang dibincangkan membentuk isomer geometri tertentu. Mereka boleh jadi trans atau cis bergantung pada orientasi ikatan berganda. Daripada semua asid lemak tak tepu yang trans PUFA yang terdiri daripada panjang rantai C18, C20 dan C22 biasanya merupakan sebahagian daripada diet manusia. Oleh itu, adalah sangat penting untuk mengesan dan mengukurnya dalam produk makanan. Salah satu kaedah yang paling popular untuk mendapatkan asid lemak mono-, di-, dan tritaktepu dalam bentuk isomer geometri (cis dan trans), masing-masing, adalah proses terma atau kimia [63]. Sintesis daripada trans isomer biasanya dibuat oleh pembuatan makanan (pemurnian, penghidrogenan). Sebagai contoh, trans isomer terbentuk semasa penyahbauan (langkah penapisan penting) minyak sayuran atau ikan. Seperti yang dilaporkan oleh Fournier et al. [63], metodologi berkenaan pengasingan dan kuantifikasi yang tepat bagi trans isomer asid lemak mono-, di-, dan tritaktepu melalui kaedah kromatografi telah dibangunkan dalam dekad yang lalu. Ag-TLC ialah salah satu teknik kromatografi yang paling berkuasa digunakan secara meluas untuk memisahkan cis dan trans isomer LC-PUFA kerana ia dicirikan oleh kesederhanaan, kos rendah dan kecekapan. Isomer geometri dipisahkan mengikut bilangan ikatan bergandanya. Keberkesanan Ag-TLC untuk pemisahan isomer EPA dan DHA telah disahkan oleh Fournier et al., pada tahun 2006 [63]. Untuk tujuan ini plat TLC disalut dengan gel silika dan diresapi oleh AgNO3 telah digunakan. Campuran toluena-metanol dalam komposisi isipadu 85 : 15 digunakan sebagai mudah alih untuk resolusi EPA mono-, di-, tri-, tetra-, penta-trans dan DHA heksa-trans isomer [63]. Dalam kerja lain, untuk menentukan profil cis dan trans isomer CLA dalam hati dengan kaedah TLC, campuran asid etanoik triklorometana-n-heksana-glasial 65 : 35 : 1 (v/v/v) dan juga plat gel silika digunakan. Larutan rhodamine digunakan sebagai agen visualisasi. Dalam langkah selanjutnya, selepas metilasi asid lemak yang dipisahkan, ia dikira dengan kaedah GC [74].

Kertas seterusnya menunjukkan bahawa kromatografi lapisan nipis perak nitrat persediaan telah berjaya digunakan untuk menganalisis cis,cis-asid oktadecadienoik (18 : 2) dalam sampel komersial lemak mentega lembu. Yang dikesan oleh Ag-TLC cis,cis-5,9-18 : 2 isomer ditemui buat kali pertama dalam lemak mentega [54]. Dalam kajian makanan lain, sembilan puluh tiga sampel komersial lemak mentega Bulgaria yang dihasilkan secara sama rata sepanjang tahun telah tertakluk kepada perak nitrat-TLC kuantitatif komponen asid lemak (sebagai ester isopropil), dengan perhatian khusus kepada trans kandungan asid lemak monoenoik [75]. Semua keputusan yang dilakukan menunjukkan bahawa TLC argentasi harus menjadi teknik analisis yang berkesan dalam pecahan dan pengenalpastian isomer geometri asid lemak tak tepu seperti PUFA.

Jadual 1 menunjukkan sistem TLC yang paling cekap digunakan untuk pengasingan dan pecahan asid lemak daripada pelbagai matriks.

3. Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)

Terdapat beberapa kertas dan ulasan asal yang sangat baik sehingga hari ini yang memberi tumpuan kepada penggunaan kromatografi lajur cecair untuk analisis asid lemak (tepu dan tak tepu) dan juga bahan berkaitannya dalam sampel biologi, makanan dan ubat [18, 93–96] . Dalam kertas kerja ini prinsip HPLC termasuk penyediaan sampel, fasa bergerak, fasa pegun dan kaedah pengesanan telah dilakukan secara meluas. Di antara kertas kajian terdahulu, hanya tiga daripadanya meninjau pengetahuan tentang asid lemak rantai panjang. Salah satunya disediakan oleh Rao et al. [94] menunjukkan analisis LC-PUFA dengan penggunaan HPLC tetapi sejak 1974 hingga 1995. Kertas kerja seterusnya yang disokong oleh Rezanka dan Votruba [96] menunjukkan penggunaan kromatografi termasuk HPLC untuk analisis asid lemak rantaian sangat panjang dari 1982 hingga 2001. Kajian ketiga yang disediakan oleh Kolanowski dan rakan sekerja [97] menerangkan kaedah instrumental penting seperti HPLC dan juga GC untuk analisis asid lemak tak tepu rantai panjang omega-3 tetapi dalam makanan sahaja. Kekurangan gambaran keseluruhan tentang pencapaian baru dalam analisis HPLC bagi asid lemak mono dan politaktepu dengan penekanan pada analisis asid lemak politaktepu rantai panjang seperti omega-3 dan omega-6 menyebabkan terdapat keperluan untuk melaksanakan tinjauan literatur dari 2002 hingga 2013 (dekad lepas) dengan penekanan pada penggunaan HPLC untuk analisis semua LC-MUFA dan LC-PUFA penting biologi pada peringkat analisis dalam pelbagai matriks. Kertas kerja ini menyerlahkan pencapaian moden HPLC termasuk prinsip analisis MUFA dan PUFA dalam matriks berbeza: mod pemisahan dan sistem pengesanan baharu yang membolehkan kuantifikasi LC-PUFA pada tahap nanogram. Pengetahuan semasa analisis HPLC bagi asid lemak mono dan politaktepu telah diterangkan berdasarkan karya yang diterbitkan dalam dekad yang lalu (2002–2013).

Penggunaan HPLC untuk pengasingan dan kuantifikasi asid lemak meningkat sejak tahun 1950, apabila ia digunakan buat kali pertama oleh Haward dan Martin untuk analisis beberapa asid lemak [98]. Dari masa ini sehingga hari ini kemajuan yang sangat cepat dalam analisis HPLC semua asid lemak termasuk LC-MUFA dan LC-PUFA diperhatikan. Adalah diketahui bahawa, berdasarkan sifat fasa pegun (pepejal atau cecair), kromatografi cecair prestasi tinggi dibahagikan kepada [18] kromatografi cecair-cecair (LLC), kromatografi penjerapan (LSC), dan kromatografi fasa terbalik (RP) , yang merupakan gabungan LSC dan LLC.

Antara teknik kromatografi cecair prestasi tinggi yang dinyatakan di atas RP-HPLC memainkan peranan penting dalam analisis LC-PUFA [94]. Teknik ini membolehkan mengasingkan asid lemak yang tidak boleh dipisahkan oleh HPLC fasa normal. Seperti yang dilaporkan awal oleh Rao et al. [94] pengekalan asid lemak dalam RP-HPLC bergantung kepada kekutuban fasa pegun, fasa bergerak, dan struktur kimia asid lemak yang diperiksa. Secara umum, masa pengekalan adalah berkadar dengan panjang rantai dan bilangan ikatan berganda yang terdapat dalam asid lemak yang diperiksa. Selain itu, pengaruh pengisomeran geometri asid lemak memainkan peranan yang sangat penting dalam analisis HPLC fasa terbalik. Dilaporkan bahawa cis isomer asid lemak biasanya dicairkan sebelum ini trans isomer. Kesan yang sama diperhatikan dalam kes perbezaan bilangan karbon dalam asid lemak yang dikaji. Mereka yang mempunyai sejumlah kecil karbon (rantai pendek) dielusi terlebih dahulu berbanding dengan asid lemak rantai panjang [94]. Literatur semasa menunjukkan bahawa HPLC fasa terbalik adalah salah satu kaedah popular yang digunakan dalam bidang analisis asid lemak MUFA dan PUFA kerana kesederhanaan, kebolehulangan dan kredibilitinya. Keputusan yang diperolehi oleh HPLC biasanya setanding dengan yang ditentukan menggunakan kaedah GC. Selain itu, masa analisis adalah setanding dengan teknik GC [94]. Walau bagaimanapun, pembangunan mod pengesan baharu seperti pengesan pengionan nyalaan (FID) atau pengesan elektrokimia (ED) meningkatkan kebolehgunaan HPLC untuk analisis MUFA dan PUFA [93].

3.1. Kaedah Derivatisasi Asid Lemak untuk Analisis HPLC

Masalah yang paling penting dalam kajian HPLC LC-MUFA dan juga LC-PUFA adalah keperluan untuk mengesannya pada tahap kepekatan yang lebih rendah seperti nanogram atau picogram. Derivatisasi asid lemak boleh meningkatkan kepentingan untuk parameter analisis HPLC seperti kepekaan, ketepatan, selektiviti, dan juga had pengesanan dan kuantifikasi [18, 95]. Kaedah derivatisasi berbeza yang digunakan untuk penentuan kuantitatif dan kualitatif asid lemak telah diterangkan secara meluas dalam kertas ulasan oleh Rosenfeld pada tahun 2002 [99]. Secara amnya, jenis agen derivatisasi bergantung pada jenis pengesan yang digunakan dalam analisis PUFA termasuk penyerapan UV, pendarfluor, penyerakan cahaya, dan pengesan indeks biasan [94].

Pengesan UV-VIS ialah sistem pengesanan yang paling popular digunakan dalam kromatografi cecair kerana ia sensitif dan khusus. Pada tahun 1983 Aveldano dan rakan sekerja [100] telah menggunakan kromatografi cecair tekanan tinggi fasa terbalik dengan pengesanan UV pada lajur octadecylsilyl untuk memisahkan campuran asid lemak tak tepu dan tepu yang tidak diivatisasi serta ester metilnya yang datang daripada tisu mamalia.

Secara amnya untuk memudahkan pengesanan melalui penyerapan UV-VIS, reagen terbitan berikut untuk asid lemak digunakan [93]: phenacyl bromide (PB), p-bromophenacyl bromide (BPB), p-chlorophenacyl bromide (CPB), p-nitrophenacyl bromida yang digunakan dalam analisis asid lemak dalam minyak, piawaian, dan darah dalam julat dari ng hingga pmol [97]. Ester naphthyl (diperolehi oleh 2-naphthyl bromide, p-nitrophenacyl, dan p-dichlorophenacyl membolehkan pengesanan asid lemak picograms dalam campuran standard. 2-Nitrophenylhydrazine (NPH) dan 2-bromoacetophenone (atau α,p-dibromoacetophenone, BAP) menukarkan asid lemak kepada derivatif khusus yang boleh dikesan dalam sampel biologi (serum) dengan had pengesanan dalam fmol. PNB (p-nitrobenzyl) dan p-methylthiobenzyl chloride (MTBC) derivatif asid lemak dengan had pengesanan dalam pmole adalah penting dalam analisis minyak kelapa. Reagen terbitan yang ideal untuk pemisahan kiral asid lemak ialah 3,5-dinitrophenyl isocyanate (DNPI) [96].

Sistem pengesanan yang sangat popular seterusnya digunakan dalam HPLC ialah pengesan pendarfluor yang mempunyai kepekaan yang lebih tinggi berbanding dengan pengesan UV-VIS. Atas sebab ini, ia boleh mengukur komposisi asid lemak pada tahap picomole dan femtomole. Beberapa reagen pendarfluor digunakan untuk derivatisasi asid lemak seperti 9-diazomethylanthracene (9-DMA) dan 9-anthryldiazomethane (ADAM). Anthryl metil ester asid lemak boleh dikesan dengan mudah dalam plasma manusia dan serum dalam picomoles. Derivatif lain yang lebih sensitif daripada ADAM ialah ester pyrenyldiazomethane (PDAM). Coumarins dan 9-aminophenanthrene (9-AP) adalah penting dalam pengesanan asid lemak dalam persekitaran dan dalam sampel biologi dalam julat dari pmoles hingga fmol. Derivatif lain seperti dansyl piperazines dan acetamides asid lemak boleh dikesan dalam serum di bawah julat 100 fmol [93, 94, 97]. Kajian terbaru yang dilakukan oleh Wang dan rakan sekerja pada tahun 2013 menunjukkan bahawa menggunakan reagen pelabelan pendarfluor baharu bernama 1,3,5,7-tetramethyl-8-butyrethylendiamine-difluororoboradiaza-s-indacene (TMBB-EDAN) merupakan teknik HPLC yang sensitif dan pantas untuk penentuan asid lemak dalam biosampel (cth, serum manusia) telah dibangunkan. Dengan prosedur yang dicadangkan, had pengesanan derivatif asid lemak adalah dalam julat 0.2-0.4 nM [101].

Satu lagi jenis pengesanan asid lemak ialah chemiluminescence. Kaedah ini adalah berdasarkan prapelabelan kumpulan –COOH dengan reagen kemiluminogenik yang betul. Dalam amalan luminal dan sebatian isoluminalnya yang berkaitan telah digunakan secara meluas sebagai reagen derivatisasi chemiluminescence untuk asid lemak kerana sifat chemiluminescentnya. Sistem pengesanan yang diterangkan adalah cekap untuk pengesanan sensitif asid lemak dalam serum manusia dan plasma dalam picomoles [93].

Untuk mengesan bahan dengan sifat pengoksidaan atau pengurangan termasuk asid lemak, pengesan elektrokimia (ED) boleh digunakan. Mod pengesanan ini membolehkan pengukuran asid lemak dalam sampel biologi kompleks yang mengandungi komponen berbeza pada tahap nanogram. Untuk mendapatkan sensitiviti yang lebih tinggi, reagen terbitan berikut untuk ED boleh digunakan: p-aminophenol 2,4-dimethoxyaniline 2-bromo-2′-nitroacetophenone ferrocene derivatives 2,4-dinitrophenylhydrazine dan 3,5-dinitrobenzoyl chloride. Aplikasi klinikal HPLC-ED ditunjukkan dalam kertas oleh Kotani et al. [80]. Dalam kerja ini penentuan asid lemak plasma termasuk PUFA seperti asid arakidonik dan juga linoleik oleh kromatografi cecair prestasi tinggi ditambah dengan pengesan elektrokimia (HPLC-ED) telah dilakukan [80]. Prosedur ini mungkin didapati sesuai untuk memantau asid lemak plasma dalam pesakit diabetes.

Di antara pelbagai jenis pengesan yang digunakan dalam analisis asid lemak HPLC, sangat berguna ialah pengesan yang tidak memerlukan prosedur derivatisasi awal bagi sebatian yang dikaji seperti, contohnya, pengesan serakan cahaya penyejatan (ELSD) atau spektrometer jisim (MS) [93]. ]. Seperti yang telah diterangkan dalam kertas oleh Lima dan Abdalla [93] pengesan serakan cahaya penyejatan adalah sensitif kepada jisim analit terwap dan sistem operasinya tidak dihadkan oleh ciri-ciri penyerapan komponen individu dan sifat eluen. Oleh itu, ELSD boleh digunakan untuk menyelesaikan masalah pemisahan asid lemak yang mempunyai kumpulan penyerapan lemah [93].

3.2. Pengesanan Spektrometri Jisim Asid Lemak

Penggunaan HPLC-MS dalam analisis asid lemak hanya diketahui dari dekad yang lalu. Spektrometer jisim digunakan secara meluas dalam analisis asid lemak terutamanya dalam kes sampel biologi. Salah satu kelebihan utama kaedah HPLC-MS adalah kemungkinan untuk menganalisis sebatian tidak meruap termasuk asid lemak [93]. Banyak mod pengionan dan pengesanan boleh digunakan untuk analisis asid lemak seperti pengionan elektrospray (ESI), pengionan kimia tekanan atmosfera (APCI), dan juga masa penerbangan (TOF). Kemungkinan baharu dalam spektrometri jisim HPLC ialah tandem MS (HPLC-MS-MS) atau gabungan pengionan elektrospray dengan spektrometer jisim tandem seperti teknik HPLC-ESI-MS-MS. Kelebihan utama LC-ESI ialah pemisahan besar asid lemak dalam matriks kompleks seperti plasma darah. HPLC-MS-MS adalah alat yang berkuasa dalam penentuan kedudukan ikatan berganda atau titik bercabang dalam rantai asid lemak tak tepu [93]. Kaedah HPLC seterusnya yang dibangunkan untuk pengesanan asid lemak rantai panjang ialah kaedah HPLC-MS digabungkan dengan APCI, yang digunakan dalam pengesanan asid lemak rantaian sangat panjang dalam bentuk ester picolinyl yang datang daripada lilin tebu [102]. HPLC-MS ditambah dengan tiga sistem pengionan, impak elektron (EI), pengionan kimia tekanan atmosfera, dan pengionan semburan elektro, adalah sesuai untuk penentuan tepat PUFA dan juga metabolit oksidatifnya seperti eicosanoid dalam sampel biologi dalam julat pg [103]. ]. Menurut kertas kerja yang disediakan oleh Řezanka et al., yang tertumpu pada analisis asid lemak dalam organisma yang lebih rendah, spektrometri jisim kromatografi cecair ditambah dengan mod pengionan APCI adalah kaedah paling berkesan yang digunakan untuk pengenalpastian dan kuantifikasi asid lemak tak tepu rantaian sangat panjang daripada marin. organisma (yang mempunyai keupayaan untuk menghasilkan VLC-PUFA) seperti dinoflagellat marin Amphidinium carterae dan alga hijau Chlorella kessleri [81, 104–106] dan juga dalam minyak yang diperoleh daripada Ximenia buah-buahan (bahan mentah untuk industri kosmetik) [107]. Seperti yang dilakukan dalam kertas ini, sistem HPLCMS-APCI terdiri daripada lajur Hichrom (HIRPB-250AM) dan program pelarut kecerunan dengan asetonitril (MeCN), diklorometana (DCM), dan propionitril (EtCN) yang sesuai untuk pemisahan 13 ester picolinyl bagi VLCPUFA daripada organisma yang lebih rendah. Pemisahan yang sangat baik bagi metil ester asid lemak tak tepu yang datang daripada krustasea air tawar dicapai dengan fasa mudah alih yang sama dan lajur kromatografi padat dengan fasa oktadecylsilyl (Supelcosil LC-18) [108]. Kajian menyeluruh terhadap politaktepu yang sangat panjang yang diterbitkan oleh Řezanka dan Sigler menunjukkan bahawa kaedah analisis moden seperti HPLC-MS membolehkan pengesanan dan pengenalpastian VLC-PUFA mungkin dalam kelas lipid yang berbeza termasuk kerajaan mikrob dan kulat [109]. HPLC fasa terbalik dengan elusi kecerunan sistem pelarut yang mengandungi asetonitril dan kloroform serta dilengkapi dengan pengesan serakan cahaya (ELSD) digunakan untuk membersihkan dan mengenal pasti metil ester C16–C28 PUFA termasuk asid oktakosaoctaenoik dalam kuantiti miligram daripada mikroalga marin [82] . Kaedah mudah berdasarkan kromatografi cecair prestasi tinggi pasangan ion fasa terbalik (RP-HPLC) telah digunakan dengan jayanya untuk mengasingkan pelbagai monoepoksida asid eikosatrienoik, arakidonik, eicosapentaenoic, dan docosahexaenoic [110]. Sebatian ini mudah dikenal pasti oleh spektrometri jisim kromatografi cecair (HPLC-MS) dengan pengionan kimia tekanan atmosfera (APCI) dalam julat nanogram [110]. Kerja ini menunjukkan bahawa kaedah berdasarkan APCI-MS ditambah dengan HPLC sangat dipercayai untuk analisis pelbagai monoepoksida PUFA dalam kajian metabolisme mereka. Satu lagi sistem HPLC seperti kromatografi cecair prestasi tinggi fasa terbalik bukan akueus (NARP-HPLC) dengan pengionan kimia tekanan atmosfera (APCI-MS) adalah sesuai untuk pengesanan 5 asid lemak terputus polimetilena tak tepu seperti cis-5,9-octadecadienoic (taksoleik), cis-5,9,12-octadecatrienoic (pinolenik), cis-5,11-eikosadienoik (keteleeronik), dan cis-5,11,14-asid eicosatrienoik (sciadonik) yang diasingkan daripada minyak biji konifer (diperolehi daripada European Larch, Norway Spruce, dan European Silver Fir) [111]. Gabungan dua kaedah kromatografi seperti TLC dan HPLC digunakan untuk menganalisis asid lemak n-3 dalam makanan tambahan minyak ikan. Pecahan EPA dan DHA yang diperoleh melalui kaedah Ag-TLC telah dianalisis selanjutnya oleh HPLC. Lajur kromatografi ODS (3.9 mm × 30 cm, 10 μm), fasa mudah alih yang mengandungi asid tetrahydrofuran-acetonitrile-air-acetic 25 : 35 : 75 : 0.4 (v/v/v/v), dan pengesan tatasusunan fotodiod dalam julat 190–240 nm telah digunakan dalam analisis ini [112]. ]. Sistem HPLC yang dilengkapi dengan lajur analisis Supelcosil C18 (4.6 mm × 25 cm) dan pengesan tatasusunan fotodiod (DAD) digunakan untuk analisis hidroperoksi PUFA sebagai produk peroksidasi yang datang daripada plasma manusia. Campuran asid asetik-acetonitrile-tetrahydrofuran 52 : 30 : 18 (v/v/v) sebagai fasa bergerak telah digunakan. Analisis dipantau pada 200-300 nm. Kawalan kuantiti melalui prosedur gunaan derivatif PUFA yang diperolehi mungkin berguna sebagai penanda klinikal tekanan oksidatif pada sistem biologi [113]. Dalam kromatografi cecair fasa terbalik kecerunan kertas lain (C18 ODS 25 cm × 0.46 cm, 5 μm) dengan menggunakan air metanol dan pengesan ELSD universal dibenarkan untuk pengasingan dan pecahan asid lemak bebas tepu, tak tepu dan beroksigen sebagai metil ester yang diekstrak daripada biji benih. Crepis alpina dan Vernonia anthelmintica, masing-masing [114]. Kerja ini menunjukkan bahawa fasa terbalik C18 adalah sesuai untuk penulenan dan pecahan PUFA sebelum kuantifikasi mereka oleh GC-MS. Selain sistem HPLC yang dilengkapi dengan jenis mod pengesan yang dinyatakan di atas seperti ECD, MS, ELSD, DAD, dan UV, pengesan pendarfluor juga sangat berguna [115, 116] yang membolehkan penentuan tepat bagi asid lemak tak tepu rantai panjang termasuk linolenik. , asid arakidonik, eicosapentaenoic, dan docosahexaenoic dalam serum manusia pada kepekatan rendah seperti fmoles. Sebagai contoh, kaedah yang diterangkan pada tahun 1986 oleh Yamaguchi et al. melakukan penukaran LC-PUFA kepada derivatif pendarfluor melalui tindak balas dengan 3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinone. Proses pengasingan dilakukan pada lajur fasa terbalik (YMC Pack C8) dengan elusi isokratik menggunakan akueus 72% (v/v) asetonitril [115]. Literatur semasa menunjukkan bahawa HPLC dengan sistem pelarut yang berbeza adalah sesuai dalam analisis ester hidroksil lemak dan asid fosforik novel 10-hydroxy-2-decenoic acid (9-HAD) yang berasal daripada jeli diraja lebah madu (Apis mellifera). Analisis HPLC telah dijalankan pada sistem lajur Diaion HP-20, Sephadex LH-20, dan Cosmosil 75C18-OP. Fasa mudah alih yang berbeza yang mengandungi asetonitril telah digunakan. Pengesan indeks biasan digunakan untuk memantau profil elusi asid lemak yang diperiksa [117].

3.3. HPLC Ion Perak dalam Kuantiti dan Pengenalpastian Isomer Geometri Asid Lemak

Seperti yang dilaporkan oleh Nikolova-Damyanova dan Momchilova [118], ion perak HPLC (Ag-HPLC) digunakan secara meluas oleh ramai saintis sebagai langkah awal untuk pecahan campuran kompleks asid lemak ke dalam kumpulan mereka sebelum analisis kuantitatif oleh GC kaedah. Penyelesaian asid lemak melalui Ag-HPLC dicapai mengikut bilangan dan geometri ikatan berganda [118]. Pemisahan adalah berdasarkan pembentukan boleh balik kompleks pemindahan cas yang lemah antara ion perak dan ikatan berganda. Masalah utama dalam Ag-HPLC ialah pengenalan Ag + ke dalam sistem ini. Oleh itu, sama dengan kes Ag-TLC percubaan pertama dilakukan pada lajur yang dibungkus makmal dengan buburan fasa pegun (cth., gel silika) yang diresapi dengan AgNO.3. Kaedah kedua ialah menambah larutan ion perak (AgNO3) ke dalam fasa mudah alih. Kaedah ketiga ialah menggunakan lajur pertukaran kation berasaskan silika yang tersedia secara komersial (Nukleosil 5 SA), atau lajur yang dihasilkan oleh Chrompack (lipid ChromSpher 5). Sistem lajur komersial ini memberikan hasil yang lebih baik (kebolehulangan yang lebih baik) analisis asid lemak daripada makmal yang disediakan [118]. Satu lagi kajian cemerlang kaedah kromatografi yang digunakan untuk menganalisis isomer geometri dan kedudukan asid lemak oleh Aini et al. [119] menunjukkan bahawa faktor berikut mempengaruhi resolusi asid lemak dalam HPLC ion perak seperti kaedah impregnasi lajur, komposisi fasa bergerak, dan juga suhu lajur [119]. Pilihan komposisi fasa mudah alih yang digunakan dalam Ag-HPLC biasanya berasaskan toluena, berasaskan asetonitril, berasaskan heksana, atau berasaskan diklorometana [118, 120]. Keputusan yang baik telah dicapai dengan penggunaan isopropanol dan tetrahydrofurane sebagai pengubahsuai. Suhu lajur yang lebih rendah biasanya menghasilkan masa elusi yang lebih pendek dalam Ag-HPLC. Selain itu, peningkatan dalam resolusi asid lemak monoenoik dan polienoik diperoleh dengan menukarkannya kepada ester fenasil, benzil, n-propil, n-butil, dan etil isopropil [52]. Pemisahan oleh Ag-HPLC ditambah dengan pengesan UV bagi cis- dan trans-asid oktadekanoik yang diterangkan oleh Momchilova dan Nikolova-Damyanova [83] menunjukkan bahawa kecekapan pengasingan meningkat dalam susunan berikut: phenethyl < phenacyl < p-methoxyphenacyl esters. Namun, pengekalan dan penyelesaian asid lemak ini oleh Ag-HPLC boleh dipengaruhi oleh perubahan kecil diklorometana dalam fasa mudah alih. Di antara pelbagai sistem kromatografi resolusi terbaik bagi cis- dan trans-isomer kedudukan asid oktadesenoik selepas menukarkannya kepada ester p-methoxyphenacyl dicapai pada lajur ion perak melalui elusi isokratik dengan fasa bergerak yang mengandungi heksana-diklorometana-asetonitril dalam komposisi isipadu 60 : 40 : 0.2 (v/v/v) [120]. Fasa mudah alih yang serupa telah digunakan oleh Momchilova dan Nikolova-Damyanova pada tahun 2000 untuk menganggarkan sifat kromatografi isomer kedudukan asid lemak oktadesenoik selepas menukarkannya kepada terbitan 2-naphthyl, 2-naphthylmethyl, dan 9-anthrylmethyl [83]. Menurut keputusan yang diperoleh dalam kertas ini, diklorometana-acetonitrile 100 : 0.025 (v/v) sebagai fasa mudah alih memberikan resolusi yang lebih baik bagi terbitan 9-antrimetil 6-, 9-, dan 11–18 : 1. Resolusi tinggi oleh Ag- HPLC diperolehi untuk isomer kedudukan PUFA seperti asid eicosapentaenoic, asid docosahexaenoic, dan juga asid docosapentaenoic yang berasal daripada triasilgliserol yang mengandungi PUFA. Sistem pelarut heksana-isopropanol-asetonitril adalah sesuai untuk pemisahan sebatian ini [84]. Pengasingan beberapa PUFA daripada minyak yang boleh dimakan oleh kromatografi gel silika argentat (Ag-TLC dan Ag-HPLC) telah dilakukan oleh Guil-Guerrero et al. [121]. Menggunakan kaedah ini isomer asid lemak berikut, asid linoleik, α-linolenik, γ-linolenik, dan asid stearidonik, dan asid eicosapentaenoic dan docosahexaenoic, telah diasingkan dalam bentuk metil ester daripada minyak biji rami, bunga matahari, dan borage dan daripada minyak hati mako sirip pendek. Begitu juga, seperti yang diterangkan dalam bahagian sebelumnya, Ag-HPLC berguna untuk analisis isomer geometri asid eicosapentaenoic dan docosahexaenoic yang terbentuk semasa penyahbauan minyak ikan [63]. Keputusan yang diperolehi menunjukkan bahawa teknik ini tidak boleh digunakan untuk menentukan isomer dalam minyak ikan yang telah terbentuk pada suhu lebih tinggi daripada 180°C (cth., pada 220°C), kerana gangguan antara isomer yang diperolehi, terutamanya di-trans DHA dan semua-cis EPA, diperhatikan. Analisis yang cekap bagi trans isomer asid linoleik terkonjugasi dalam produk sintetik dan haiwan (daripada babi, daging ayam) juga dicapai dengan teknik kromatografi termasuk Ag-HPLC [62]. Kesusasteraan terkini menunjukkan bahawa kuantifikasi dipisahkan oleh isomer geometri Ag-HPLC bagi asid lemak dilakukan terutamanya oleh GC-MS atau oleh GC ditambah dengan FID (pengesan pengionan api). FID, UV, dan pengesan biasan biasanya digunakan untuk pengkuantitian langsung isomer asid lemak sebagai metil ester. Seperti yang dilaporkan oleh Nikolova-Damyanova dan Momchilova [118] ester aromatik asid lemak boleh dikesan oleh Ag-HPLC digabungkan dengan pengesan UV-VIS dalam julat 0-200 μg. Kertas kerja yang disediakan pada tahun 2013 oleh Sun dan rakan sekerja menunjukkan bahawa kromatografi cecair/ozonolisis dalam talian/spektrometri jisim (LC/O3-MS) ialah pendekatan baharu yang praktikal dan mudah digunakan untuk penentuan langsung kedudukan ikatan berganda dalam lipid yang dibentangkan dalam campuran kompleks. Untuk menguji kaedah ini dalam ekstrak lipid kompleks, sampel lemak lembu dengan jumlah isomer kedudukan yang diketahui dan cis/trans isomer asid lemak tak tepu telah dianalisis. Kelebihan utama ozonolisis dalam talian ialah kebolehgunaannya dalam kombinasi dengan pelbagai spektrometer jisim tanpa pengubahsuaian instrumental [122].

Tinjauan beberapa keadaan HPLC terpilih yang berguna untuk pengasingan dan pengenalpastian MUFA dan PUFA daripada pelbagai sampel disenaraikan dalam Jadual 2.


Tonton video: Membuat Metode HPLC Shimadzu LC20AD (Disember 2022).