Maklumat

Pengekstrakan DNA Pyura

Pengekstrakan DNA Pyura


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya sedang bergelut dengan pengekstrakan DNA genomik daripada sampel Pyura chilensis yang berbeza; DNA terdegradasi seperti yang boleh dilihat pada gel.

Kami sentiasa menggunakan Kit penulenan DNA Genomik GeneJET (oleh ThermoFisher), dan ia berfungsi dengan baik untuk sampel daripada spesies lain; jadi kit itu bukan masalahnya.

Kami sentiasa menggunakan sampel tisu yang disimpan dalam 95% Etanol (yang dibasuh dengan air sebelum pengekstrakan DNA), tetapi masalah ini berterusan tanpa mengira sama ada sampel itu berumur satu hari atau beberapa tahun. Kaedah penyimpanan nampaknya berfungsi dengan baik untuk pengekstrakan gDNA daripada spesies lain.

Kemudian, tekaan saya adalah bahawa masalahnya adalah dengan Pyura sendiri. Jadi saya perlu memikirkan sama ada pengekstrakan atau penyimpanan tidak sesuai untuk Pyura. Saya membaca bahawa Pyura mempunyai banyak tembaga di dalamnya. Kami merancang untuk menggunakan penimbal baharu untuk menyimpannya: garam DMSO Tepu, mengandungi EDTA.

Saya ingin bertanya jika ada di antara anda yang pernah bekerja dengan organisma ini (dan jika anda pernah, maka bagaimana anda berjaya mengekstrak DNA daripadanya). Adakah anda mempunyai sebarang cadangan tentang mana-mana protokol penulenan DNA?

Lorong pertama ialah tangga (1kb) dan 3 lorong terakhir dengan perkara kabur yang panjang dan bukannya jalur adalah sampel DNA saya.


Merujuk kepada foto gel anda, DNA genomik (dalam tiga lorong sampel Pyura) tidak kelihatan rosak teruk. Jika penanda saiz ialah tangga 1 Kb, maka majoriti DNA adalah bersaiz molekul tinggi. Semasa pengekstrakan, adalah perkara biasa untuk DNA dengan berat molekul tinggi menjadi "tercukur" pada tahap tertentu (secara mekanikal dipecahkan kepada serpihan yang lebih kecil). Ini boleh muncul sebagai pengsan sapuan ke bawah. Lorong mungkin agak terlebih muatan juga. Anda boleh cuba menggunakan teknik pengekstrakan yang lebih lembut dan lihat sama ada ia membantu untuk kepuasan anda. Mana-mana yang anda sebutkan akan berfungsi.

DNA genomik yang terdegradasi teruk akan muncul sebagai "smear" yang lebih sengit berhampiran bahagian bawah standard saiz 1 Kb.


Ini adalah daripada karya yang diterbitkan oleh Segovia et al. 2017:

Tisu mantel (0.2 g) daripada setiap individu digunakan untuk mengekstrak DNA menggunakan DNeasy Blood® & Tissue Kit (QIAGEN®, USA) mengikut arahan pengilang. Kuantiti/ketulenan DNA diukur dalam Nanodrop 2,000 (Thermo, USA).

Mereka telah melakukan pengenalan SNP daripada genom. Jadi saya mengandaikan bahawa gDNA mereka akan mempunyai kualiti yang baik.


Pengekstrakan DNA Pyura - Biologi

Laporan Praktikum Makmal Zoologi Sistematik, Ogos, 2010

Sitokrom c subunit oksidase I jujukan separa daripada copepod calanoid diduga diperolehi daripada Pyura vittata (Chordata: Ascidiacea: Pleurogona: Pyuridae)

Bahagian Biologi, Jabatan Sains Biologi, Pusat Pengajian Sains, Universiti Hokkaido, Sapporo 060-0810, Jepun

Bahan dan Kaedah
Ascidian diperoleh secara subtidal di Teluk Oshoro, Hokkaido, Jepun, kira-kira 43°12&primeN, 140°51&primeE, pada 31 Mei 2010 oleh Shin Hayase, difoto dan dikenal pasti oleh Hiroshi Kajihara sebagai Pyura vittata berdasarkan Nishikawa (1992: 600, pl. 144-1) sebelum ditetapkan dalam 99% EtOH. DNA telah diekstrak daripada saluran pencernaan spesimen, menggunakan kaedah silika (Boom et al. 1990) dengan beberapa pengubahsuaian. DNA yang diekstrak telah dilarutkan dalam 30 &mikrol air ternyahion dan telah dipelihara pada &ndash20°C. Baki spesimen baucar morfologi telah disimpan di Muzium Universiti Hokkaido di bawah nombor katalog ICHU22080146 (hubungi: Dr. Hiroshi Kajihara, [email protected]).
Serpihan kira-kira 600-bp sitokrom mitokondria c gen subunit I oksidase (COI) telah dikuatkan oleh tindak balas rantai polimerase (PCR) menggunakan LCO1490 (5&prime-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3&prime) dan HCO2198 (5&prime-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3&prime) (Folmer et al. 1994). PCR permulaan panas dilakukan oleh kitar haba, iCycler (Bio-Rad), dalam isipadu tindak balas 20-&mikrol yang mengandungi 1 &mikrol jumlah DNA templat (kira-kira 10&ndash100 ng) dan 19 &mikrol pracampuran dibuat dengan 632-&mikrol air ternyahion, 80-&mikro Cth Taq Penampan (TaKara Bio), 64-&mikrol dNTP (setiap 25 mM), 8-&mikrol setiap primer (setiap 10 &mikroM), dan 0.1-&mikrol TaKara Ex Taq (5 U/&mikrol, TaKara Bio). Keadaan kitaran terma terdiri daripada denaturasi awal pada 95°C selama 30 saat 30 kitaran denaturasi pada 95°C selama 30 saat, penyepuhlindapan pada 45°C selama 30 saat, dan pemanjangan pada 72°C untuk 45°C dan pemanjangan min terakhir pada 72°C.
Produk PCR telah ditulenkan dengan kaedah silika (Boom et al. 1990). Kedua-dua helai disusun dengan Kit Penjujukan Kitaran BigDye® Terminator v3.1 (Biosistem Gunaan) mengikut protokol pengilang, menggunakan set primer yang sama seperti amplifikasi PCR awal. Penjujukan telah dilakukan dengan Penganalisis DNA ABI Prism 3730 (Biosistem Gunaan). Kromatogram dan data jujukan dikendalikan dengan perisian MEGA v4 (Tamura et al. 2007).

Keputusan dan perbincangan
Sebanyak 606 bp jujukan COI diperolehi. Walau bagaimanapun, carian BLAST nukleotida bagi jujukan ini di Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan menunjukkan bahawa jujukan itu mungkin datang daripada copepod calanoid, bukannya ascidian. Disimpulkan bahawa penjagaan mesti dibayar untuk mengelakkan saluran pencernaan untuk pengekstrakan DNA daripada asid.

Taksonomi
Filum Chordata
Kelas Ascidiacea
Keluarga Pyuridae Hartmeyer, 1908
Genus Pyura Molina, 1782
Pyura vittata (Stimpson, 1852)
(Rajah 1)



Rajah 1. Pyura vittata (Stimpson, 1852) (ICHU22080146), pandangan sisi.

Boom, R., Sol., C. J. A., Salimans, M. M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M. E., dan van der Noordaa, J. 1990. Kaedah cepat dan mudah untuk penulenan asid nukleik. Jurnal Mikrobiologi Klinikal28: 495&ndash503.

Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. dan Vrijenhoek, R. 1994. Primer DNA untuk penguatan sitokrom mitokondria c subunit oksidase I daripada pelbagai invertebrata metazoa. Biologi dan Bioteknologi Marin Molekul 3: 294&ndash299.

Nishikawa, T. 1999. Chordata. Pp. 573&ndash608. Dalam: Nishimura, S. (Ed.) Panduan untuk Haiwan Pantai Jepun dengan Gambar Berwarna dan Kunci. Vol. II. Hoikusha, Osaka. xii+pls 73&ndash144+663 ms.

Tamura, K.,Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. 2007. MEGA4: perisian Molecullar Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi 4.0. Filogenetik Molekul dan Evolusi 24: 1596&ndash1599.


Lampiran
Urutan COI daripada ICHU22080146 (dikenal pasti sebagai ascidian Pyura vittata), walaupun kemungkinan besar mewakili copepod calanoid.


Aktiviti pendek ini membantu pelajar menggambarkan salah satu molekul terpenting di planet ini, DNA. Aktiviti itu boleh dilakukan dengan bahan mudah yang terdapat di kebanyakan rumah. Kami menggunakan pisang, tetapi strawberi atau buah lain yang cukup lembut untuk menjadi bubur juga boleh digunakan. Aktiviti ini ditulis untuk pelajar di peringkat sekolah menengah atau lebih tinggi, tetapi dengan bimbingan yang lebih sengit, aktiviti ini berguna untuk pelajar dari sebarang umur.

Masa Diperlukan : 45 minit

  • Satu bekas sabun dan garam sepatutnya lebih daripada cukup untuk kegunaan kelas yang besar, tetapi kami cadangkan mempunyai dua daripada setiap bekas di tangan untuk berjaga-jaga.
  • Aktiviti ini secara amnya berfungsi dengan lebih baik dengan kumpulan kecil pelajar masing-masing bekerja pada perahan pisang mereka sendiri. Ini juga menyebabkan sekurang-kurangnya satu kumpulan akan mempunyai DNA yang sangat kelihatan.
  • Pastikan anda mempunyai beg zip tambahan dan penapis kopi tambahan di tangan, sekiranya berlaku kerosakan.
  • Jika penapis kopi pecah dan bubur pisang jatuh ke bahagian bawah gelas, tuangkannya semula ke dalam beg, pasangkan penapis baharu dan tuangkan bubur kembali dengan lebih perlahan, biarkan ia mengalir semasa anda menuang.

Sambungan:

Apabila digabungkan dengan bacaan tambahan daripada Ask A Biologist, atau tugasan pendek tambahan, aktiviti pengekstrakan DNA ini boleh memenuhi beberapa standard pembelajaran.

  • Cerita “DNA ABC” akan membantu pelajar memahami kepentingan DNA kepada kehidupan, serta struktur kimia dan fizikal DNA.
  • Halaman cerita "Mendapatkan Genetik Lurus" akan membantu pelajar membezakan antara gen dan kromosom serta memahami alel.
  • Bagi pelajar sekolah menengah, cerita "Mengawal Gen" akan membantu mereka memahami sintesis protein.
  • Pelajar boleh cuba memikirkan berapa banyak DNA dalam tubuh manusia dewasa. Anda boleh sama ada memberikan maklumat berikut kepada mereka atau minta mereka mencarinya dalam talian:

      Selular

      • Cerita "Blok Binaan Kehidupan" akan membantu pelajar memahami struktur dan fungsi sel.
      • Cerita “Sel Hidup dalam Sel” akan membantu pelajar memahami jenis sel berbeza yang wujud.
      1. Pelajar akan memahami bahawa molekul kecil adalah ketara.
      2. Pelajar akan mengikut arahan dan memahami bahawa bahan kimia asas (garam dan detergen) boleh digunakan untuk memecahkan sel dan bahagian sel serta membuat molekul melekat pada molekul lain.
      3. PENERANGAN: Pelajar akan mendapat pemahaman asas tentang struktur DNA.
      4. SAMBUNGAN: Pelajar akan memahami sel dan bahawa mereka memecahkan membran sel dan membran nuklear untuk mencapai DNA.

      Teknik Pengekstrakan DNA

      Dalam eksperimen ini, matlamatnya adalah untuk mengekstrak DNA daripada sampel buah. Beberapa pengetahuan tentang latar belakang saintifik di sebalik pengekstrakan DNA diperlukan untuk melakukan ini.

      Proses pengekstrakan DNA ialah prosedur biokimia yang agak mudah yang boleh dibahagikan kepada tiga langkah utama: memecahkan sel terbuka (lisis), memusnahkan membran dalam sel, dan memendakan DNA keluar daripada larutan.

      Bahagian berikut menerangkan bagaimana setiap langkah berkaitan dengan sifat fizikal dan biokimia DNA.


      • Penampan Pengekstrakan DNA: 1000 ml air ternyahion, 50 ml detergen pinggan mangkuk jernih, 1 sudu teh garam
      • Strawberi (buah-buahan lain juga berfungsi)
      • Beg ziploc, Penapis kopi dan corong
      • Tabung uji, bikar atau cawan untuk mengumpul turasan
      • Etanol atau 91% isopropil alkohol (disejukkan)

      1. Tambah strawberi (atau separuh) ke dalam beg simpanan Ziploc.
      2. Tambah 10 ml penimbal pengekstrakan DNA dan tumbuk strawberi dan penimbal selama kira-kira satu minit.
      3. Gunakan corong dan penapis kopi untuk menapis jus strawberi ke dalam bikar.
      4. Pindahkan tapis ke tabung uji, anda hanya perlu mengisi tabung uji kira-kira separuh penuh dan elakkan memindahkan sebarang buih.
      5. Perlahan-lahan tuangkan atau titiskan alkohol sejuk ke atas bahagian atas adunan strawberi. Anda mahu satu lapisan di atas campuran strawberi.
      6. Helai putih akan terbentuk dalam lapisan etanol, gunakan batang kacau atau pencungkil gigi untuk mengelilingi helai.


      Pengenalan

      Dengan beribu-ribu spesies yang diterangkan, ascidian atau pancutan laut (filum: Chordata, subfilum: Tunicata, kelas: Ascidiacea) membentuk kumpulan unik kordat bukan vertebrata marin sesil (Shenkar dan Swalla 2011 Shenkar et al. 2012). Oleh kerana kedudukan sistematik utama mereka sebagai kakak-kakak vertebrata (Delsuc et al. 2006 Singh et al. 2009), ascidians mempunyai peranan penting dalam kajian perkembangan evolusi dan telah menjadi model haiwan yang penting dalam genomik perbandingan (Dahlberg et al. 2009) . Dari sudut ekologi, kitaran hayat mereka yang agak pendek, keupayaan mereka untuk berkembang maju dalam persekitaran eutrofik (kaya nutrien) dan kekurangan pemangsa yang ketara menyumbang kepada kejayaan mereka dalam persekitaran yang baru diperkenalkan (Lambert 2001 Shenkar dan Loya 2008). Akibatnya ialah ascidians adalah antara spesies invasif marin yang paling teruk dan kadar pengenalannya telah meningkat sepanjang dekad yang lalu (Lambert 2009). Oleh itu, adalah penting untuk membangunkan alat yang membolehkan kita membezakan bukan asli daripada spesies asli dan memastikan populasi sumber spesies yang diperkenalkan. Malangnya, sistematik ascidian terkenal sukar, kerana spesies kebanyakannya dikelaskan berdasarkan watak anatomi dalaman seperti bentuk dan kedudukan gelung gonad atau usus, dan struktur kantung bercabang (Monniot et al. 1991). Akibatnya, kesilapan pengecaman spesies ascidian adalah kerap (Mastrototaro dan Dappiano 2008 Lambert 2009). Jujukan molekul menyediakan cara untuk melengkapkan pengenalan spesies, terutamanya dalam situasi di mana diskriminasi taksa berasaskan morfologi tradisional tidak mencukupi (Geller et al. 2010). Penanda molekul, dan khususnya jujukan DNA mitokondria (mt), dengan itu memberikan alternatif yang kuat kepada pendekatan morfologi. Sebagai contoh, DNA mt telah berjaya digunakan untuk menunjukkan dengan jelas kewujudan dua spesies samar dalam ascidian kosmopolitan. Ciona intestinalis (Iannelli, Pesole, et al. 2007). Walau bagaimanapun, ascidian ialah spesies yang berkembang pesat (Yokobori et al. 1999, 2005 Tsagkogeorga, Turon, et al. 2010), satu ciri yang merumitkan penggunaan watak molekul mereka untuk membuat kesimpulan sejarah evolusi mereka (Delsuc et al. 2006). Lebih khusus lagi, genom ascidian mt adalah hipervariable dalam hampir semua ciri genom, yang termasuk contohnya, kadar jujukan yang sangat tinggi dan penyusunan semula susunan gen yang berleluasa, walaupun pada tahap taksonomi yang rendah seperti dalam spesies konggenerik dan samar (Iannelli, Griggio, et al. 2007 Gissi et al. 2010). Evolusi genom ascidian mt yang sangat pantas ini menjadikan penguatan jujukannya sebagai tugas yang mencabar, yang seterusnya menerangkan kekurangan genom terjujukan ini. Oleh itu, kami berhasrat untuk membangunkan kaedah yang mudah dan cekap yang membolehkan genom mt ascidian lengkap boleh diperoleh dengan mudah.

      Teknologi penjujukan generasi akan datang (NGS) telah merevolusikan pemerolehan data dalam biologi. Walaupun protokol penjujukan pada asalnya dibangunkan untuk mengekstrak genom atau transkrip dari organisma tunggal, adalah mungkin untuk mencampurkan beberapa sampel dalam sel aliran tunggal (iaitu, penjujukan multipleks) selagi urutan daripada sampel yang berbeza boleh dipisahkan kemudiannya. Kaedah multipleks standard membenarkan pengumpulan sehingga 96 sampel berbeza dengan memperkenalkan kod bar (atau tag) semasa penyediaan perpustakaan DNA (Binladen et al. 2007). Mengikuti langkah penjujukan, bacaan dipisahkan berdasarkan tag kod bar mereka, supaya pemasangan dilakukan untuk setiap sampel secara berasingan. Kelebihan pendekatan ini ialah kemungkinan untuk mewujudkan pertukaran antara jumlah bilangan bacaan yang tersedia daripada satu larian NGS dan bilangan bacaan yang diperlukan untuk mendapatkan liputan yang dikehendaki bagi setiap sampel individu. Walau bagaimanapun, kelemahan pendekatan sedemikian ialah ia memerlukan pembinaan perpustakaan genomik yang berasingan untuk setiap sampel, yang boleh menelan kos yang tinggi. Beberapa kajian telah mencadangkan mencampurkan beberapa sampel tanpa pengekodan bar dan mengasingkan jujukan hanya selepas langkah pemasangan (Pollock et al. 2000 McComish et al. 2010 Timmermans et al. 2010 Dettai et al. 2012). Kami merujuk di sini hanya kepada kajian bukan teori. Dalam Timmermans et al. (2010), pemisahan selepas pemasangan adalah berdasarkan jujukan umpan, iaitu jujukan pendek (200𠄱,000 bp) yang diperolehi bagi setiap sampel menggunakan jujukan Sanger. Dalam McComish et al. (2010), pemisahan dilakukan dengan membandingkan contigs yang dipasang kepada satu set genom mt rujukan yang berkait rapat. Kedua-dua Timmermans et al. (2010) dan McComish et al. (2010) mengurutkan serpihan yang dikuatkan tindak balas rantai polimerase panjang (PCR) yang meliputi keseluruhan mitogenome. Malangnya, pemerolehan serpihan PCR yang panjang amat sukar dalam tunika kerana penyusunan semula susunan gen yang berleluasa. Di samping itu, artifak PCR kadangkala boleh menimbulkan chimeric mt contigs (Timmermans et al. 2010).

      Dalam kerja ini, kami memilih untuk menggunakan platform Illumina untuk menyusun jumlah ekstrak genomik berbilang spesies yang dicampur bersama. Oleh itu, kedua-dua serpihan DNA nuklear dan mt pelbagai spesies telah disusun bersama, dan jujukan mtDNA diambil secara pengiraan melalui langkah pemasangan. Pendekatan kami adalah serupa dengan yang digunakan oleh Groenenberg et al. (2012), yang memperoleh mitogenome lengkap seekor siput dengan penjujukan Illumina dan pemasangan de novo daripada jumlah DNA yang diekstrak daripada spesimen muzium tunggal. Mengikuti Timmermans et al. (2010), jujukan umpan di sini digunakan untuk mengenal pasti jujukan mt setiap sampel dan bukannya jujukan yang berkait rapat, seperti dalam McComish et al. (2010), kerana kami menyusun, sebagai contoh, wakil pertama keluarga yang kedudukan filogenetiknya diperdebatkan (cth., Corellidae Tsagkogeorga et al. 2009). Kelebihan pendekatan 𠇋rute force” kami ialah ia tidak bergantung pada primer tertentu mahupun pada protokol pengayaan dan ia buta kepada susunan gen mt. Menggunakan pendekatan ini, kami berjaya mengumpulkan lima mitogenom lengkap baharu: Rhodosoma turcicum (Phlebobranchia: Corellidae), Botryloides aff. leachii dan Polycarpa mytiligera (Stolidobranchia: Styelidae), Halocynthia spinosa, dan Pyura gangelion (Stolidobranchia: Pyuridae) ( rajah 1 A dan CF, masing-masing). Di samping itu, menggunakan pendekatan penjujukan PCR dan Sanger standard, kami memperoleh genom mt Ascidiella aspersa (Phlebobranchia: Ascidiidae) ( rajah 1 B). Kami menerangkan dan membincangkan pendekatan baru kami untuk penjujukan mtDNA menggunakan teknologi NGS, bersama-sama dengan ciri-ciri enam genom mt ascidian baru ini dari segi organisasi genom dan isyarat filogenetik.

      Spesies Ascidian disusun dalam karya ini. (A) Rhodosoma turcicum (Corellidae), (B) Ascidiella aspersa (Ascidiidae), (C) Botryloides aff. leachii (Styelidae), (D) Polycarpa mytiligera (Styelidae), (E) Halocynthia spinosa (Pyuridae), dan (F) Pyura gangelion (Pyuridae).


      Pemurnian dan Kepekatan DNA daripada Larutan Berair

      Unit ini membentangkan prosedur asas untuk memanipulasi penyelesaian DNA untai tunggal atau dua melalui langkah penulenan dan penumpuan. Teknik ini berguna apabila protein atau molekul zat terlarut perlu dikeluarkan daripada larutan akueus, atau apabila larutan DNA perlu dipekatkan. The

      , menggunakan pengekstrakan fenol dan pemendakan etanol (atau isopropanol), sesuai untuk penulenan DNA daripada isipadu kecil (<0.4 ml) pada kepekatan lebih rendah daripada 1 mg/ml. Tiga protokol sokongan menggariskan kaedah untuk menampan fenol yang digunakan dalam pengekstrakan, menumpukan DNA menggunakan butanol, dan mengekstrak sisa pelarut organik dengan eter. Alternatif kepada kaedah ini ialah penulenan asid nukleik menggunakan manik kaca dan ini juga dibentangkan. Protokol ini juga boleh digunakan untuk membersihkan RNA. Dua protokol alternatif terakhir digunakan untuk menumpukan RNA dan mengekstrak dan memendakan DNA daripada volum yang lebih besar dan daripada larutan cair, dan untuk mengeluarkan oligonukleotida dan trifosfat berat molekul rendah.


      Pengekstrakan DNA daripada Daun Tumbuhan Menggunakan Tampalan Microneedle

      Pengasingan DNA berkualiti tinggi daripada spesimen tumbuhan yang dijangkiti merupakan langkah penting untuk pengesanan molekul patogen tumbuhan. Walau bagaimanapun, pengasingan DNA daripada sel tumbuhan yang dikelilingi oleh dinding sel polisakarida tegar melibatkan langkah yang rumit dan memerlukan peralatan makmal atas bangku. Akibatnya, pengekstrakan DNA tumbuhan pada masa ini terhad kepada makmal yang serba lengkap dan penyediaan sampel telah menjadi salah satu halangan utama untuk pengesanan molekul di tapak bagi patogen tumbuhan. Untuk mengatasi halangan ini, kaedah pengekstrakan DNA yang mudah daripada tisu daun tumbuhan telah dibangunkan. Tampalan jarum mikro (MN) yang diperbuat daripada polivinil alkohol (PVA) boleh mengasingkan tumbuhan atau DNA patogen daripada spesies tumbuhan yang berbeza dalam masa seminit. Semasa pengekstrakan DNA, patch MN polimer meresap ke dalam tisu daun tumbuhan dan memecahkan dinding sel tumbuhan yang tegar untuk mengasingkan DNA intrasel. DNA yang diekstrak adalah tindak balas rantai polimerase (PCR) yang boleh dikuatkan tanpa penulenan tambahan. Kaedah invasif minima ini telah berjaya diekstrak Phytophthora infestans DNA daripada daun tomato yang dijangkiti. Selain itu, tampalan MN boleh digunakan untuk mengasingkan DNA daripada patogen tumbuhan lain secara langsung di lapangan. Oleh itu, ia mempunyai potensi besar untuk menjadi teknik penyediaan sampel yang pantas di tapak untuk pengesanan patogen tumbuhan. © 2020 oleh John Wiley & Sons, Inc.

      Protokol Asas: Pengekstrakan DNA berasaskan tampalan Microneedle

      Protokol Sokongan 1: Fabrikasi tampalan jarum mikro

      Protokol Sokongan 2: Penguatan PCR masa nyata bagi tampalan microneedle DNA yang diekstrak


      Rujukan

      Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E, Fodor AA, Ren B, Amir A, Schwager E, Crabtree J, Ma S, Abnet CC, et al. Penilaian variasi dalam penjujukan amplikon komuniti mikrob oleh konsortium projek Microbiome Quality Control (MBQC). Nat Biotechnol. 201735:1077–86.

      Costea PI, Zeller G, Sunagawa S, Pelletier E, Alberti A, Levenez F, Tramontano M, Driessen M, Hercog R, Jung FE, et al. Ke arah piawaian untuk pemprosesan sampel tahi manusia dalam kajian metagenomik. Nat Biotechnol. 201735:1069–76.

      Konsortium Projek Mikrobiom Manusia. Struktur, fungsi dan kepelbagaian mikrobiom manusia yang sihat. alam semula jadi. 2012486:207–14.

      Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, Nielsen T, Pons N, Levenez F, Yamada T, et al. Katalog gen mikrob usus manusia yang ditubuhkan oleh penjujukan metagenomik. alam semula jadi. 2010464:59–65.

      Marotz C, Amir A, Humphrey G, Gaffney J, Gogul G, Knight R. Pengekstrakan DNA untuk metagenomik diperkemas bagi sampel persekitaran yang pelbagai. Bioteknik. 201762:290–3.

      Wesolowska-Andersen A, Bahl MI, Carvalho V, Kristiansen K, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Licht TR. Pilihan kaedah pengekstrakan DNA bakteria daripada bahan najis mempengaruhi struktur komuniti seperti yang dinilai oleh analisis metagenomik. Mikrobiom. 20142:19.

      Franzosa EA, Morgan XC, Segata N, Waldron L, Reyes J, Earl AM, Giannoukos G, Boylan MR, Ciulla D, Gevers D, et al. Mengaitkan metatranskriptom dan metagenom usus manusia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111:E2329–38.

      Horz HP, Scheer S, Huenger F, Vianna ME, Conrads G. Pengasingan terpilih DNA bakteria daripada spesimen klinikal manusia. J Kaedah Mikrobiol. 200872:98–102.

      Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, Zaramela LS, Knight R, Zengler K. Memperbaiki metagenomik senapang patah air liur oleh pengurangan DNA perumah kimia. Mikrobiom. 20186:42.

      Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C, Cooper A, Knight R, Weyrich LS. Pencemaran dalam kajian mikrobiom biojisim mikrob rendah: isu dan cadangan. Trend Microbiol. 201927:105–17.

      Salter SJ, Cox MJ, Turek EM, Calus ST, Cookson WO, Moffatt MF, Turner P, Parkhill J, Loman NJ, Walker AW. Pencemaran reagen dan makmal boleh memberi kesan kritikal terhadap analisis mikrobiom berasaskan jujukan. BMC Biol. 201412:87.

      Glassing A, Dowd SE, Galandiuk S, Davis B, Chiodini RJ. Pencemaran DNA bakteria yang wujud pada reagen pengekstrakan dan penjujukan boleh menjejaskan tafsiran mikrobiota dalam sampel biojisim bakteria rendah. Pathog usus. 20168:24.

      Minich JJ, Zhu Q, Janssen S, Hendrickson R, Amir A, Vetter R, Hyde J, Doty MM, Stillwell K, Benardini J, et al. KatharoSeq membolehkan analisis mikrobiom berdaya tinggi daripada sampel biojisim rendah. mSistem. 20183.

      Morales E, Chen J, Rumah Besar KL. Analisis komposisi mikrobiom manusia dalam penyelidikan kanser. Kaedah Mol Biol. 19282019:299–335.

      Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, White JR, Mark Welch JL, Rossetti BJ, Peterson SN, Snesrud EC, Borisy GG, Lazarev M, et al. Organisasi mikrobiota adalah ciri tersendiri bagi kanser kolorektal proksimal. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111:18321–6.

      Bullman S, Pedamallu CS, Sicinska E, Clancy TE, Zhang X, Cai D, Neuberg D, Huang K, Guevara F, Nelson T, et al. Analisis kegigihan Fusobacterium dan tindak balas antibiotik dalam kanser kolorektal. Sains. 2017358:1443–8.

      Huseyin CE, Rubio RC, O'Sullivan O, Cotter PD, Scanlan PD. Sempadan kulat: analisis perbandingan kaedah yang digunakan dalam kajian mycobiome usus manusia. Mikrobiol hadapan. 20178:1432.

      Rosenbaum J, Usyk M, Chen Z, Zolnik CP, Jones HE, Waldron L, Dowd JB, Thorpe LE, Burk RD. Penilaian kaedah pengekstrakan DNA rongga mulut pada mikrobiota bakteria dan kulat. Sci Rep. 20199:1531.

      Shkoporov AN, Ryan FJ, Draper LA, Forde A, Stockdale SR, Daly KM, McDonnell SA, Nolan JA, Sutton TDS, Dalmasso M, et al. Protokol boleh dihasilkan semula untuk analisis metagenomik fageom najis manusia. Mikrobiom. 20186:68.

      Kim D, Hofstaedter CE, Zhao C, Mattei L, Tanes C, Clarke E, Lauder A, Sherrill-Mix S, Chehoud C, Kelsen J, et al. Mengoptimumkan kaedah dan mengelak perangkap dalam penyelidikan mikrobiom. Mikrobiom. 20175:52.

      Hornung BVH, Zwittink RD, Kuijper EJ. Isu dan piawaian kawalan semasa dalam penyelidikan mikrobiom. FEMS Microbiol Ecol. 201995. https://doi.org/10.1093/femsec/fiz045

      Sinha R, Ahsan H, Blaser M, Caporaso JG, Carmical JR, Chan AT, Fodor A, Gail MH, Harris CC, Helzlsouer K, et al: Langkah seterusnya dalam mengkaji mikrobiom manusia dan kesihatan dalam kajian prospektif, Bethesda, MD, 16-17 Mei 2017. Mikrobiom 2018, 6:210.

      Sinha R, Abnet CC, White O, Knight R, Huttenhower C. Projek kawalan kualiti mikrobiom: reka bentuk kajian asas dan hala tuju masa hadapan. Genome Biol. 201516:276.


      Laporan Makmal Biologi mengenai pengekstrakan Klorofil

      Abstrak Eksperimen ini memfokuskan pada mengekstrak dan mengasingkan pigmen Kloroplas. Untuk prosedur, daun hijau dikisar dalam mortar dengan beberapa bahan kimia dan cecair itu ditapis untuk digunakan untuk analisis lanjut. Jalur larutan ini diletakkan di atas kertas turas dan kemudian, setelah dikeringkan, dimasukkan ke dalam suar pelarut. Selepas ini pigmen kloroplas dipisahkan oleh pelarut kepada kumpulan pigmen yang lebih atau kurang larut.

      Matlamat Berapakah jenis pigmen yang terdapat dalam daun hijau? Ia diharap dapat mengenal pasti empat jenis pigmen yang berbeza pada daun.

      Oleh kerana kertas penapis dengan pelarut akan memisahkan pigmen dari segi keterlarutan, pembahagian yang jelas bagi setiap satunya dijangka terserlah. Memandangkan pelbagai bahan kimia telah digunakan dalam keseluruhan proses makmal ini, pembolehubah tertentu mungkin telah mempengaruhi keputusan dari segi ketulenan setiap bahan kimia atau ketulenan turasan yang digunakan.

      Latar Belakang Kloroplas, pada asasnya, adalah organel yang bertanggungjawab untuk fotosintesis.

      Secara struktur ia sangat serupa dengan mitokondria. Ia mengandungi membran luar yang telap, membran dalam yang kurang telap, ruang perantaraan, dan bahagian dalam yang dipanggil ribut. Walau bagaimanapun, kloroplas lebih besar daripada mitokondria. Ia perlu mempunyai saiz yang lebih besar kerana membrannya tidak dilipat menjadi Cristal. Juga membran dalam tidak digunakan untuk rantai pengangkutan elektron.

      Malah, penapisan pertama yang kami gunakan tidak mengandungi pigmen yang mencukupi yang bertindak balas kepada pelarut untuk mencipta sebarang hasil yang berguna. Selepas membuat semula kaedah untuk turasan dan jalur kertas, pelarut mula melakukan Tugasnya. Dalam masa kira-kira 10 minit pelarut telah perlahan-lahan disedut ke dalam kertas sehingga garis pensil kelabu. Kemudian, selepas mengeringkan jalur seseorang hampir tidak dapat mengenal pasti dua warna yang berbeza, setiap satu hanya beberapa milimeter dari setiap satu di sana: hijau kebiruan dan garis hijau kekuningan.

      Guru Glen kemudian memberi kami skala yang mana kami harus mengenal pasti setiap jalur pigmen dengan warna individunya, mengukur jaraknya berhubung dengan asal (garisan pertama yang dilukis dengan turasan) dan kemudian mengira REF. Mula-mula seseorang perlu mengenal pasti warna yang tepat bagi setiap satu, ini agak bermasalah, kerana gamut ton yang berbeza hadir. Seperti yang ditunjukkan dalam rajah 1 atau Jadual Data 2, terdapat susunan set taburan setiap jalur warna. REF dikira berdasarkan formula berikut: REF = Jarak Pigmen berhijrah (mm)

      Jarak depan pelarut berhijrah (mm) Rajah 1 – Karotena (oren) – Karotena – Psikoanalisis Pigmen dalam Kloroplast – Klorofil – Klorofil A (hijau kebiruan) – Klorofil B (kehijauan kekuningan) Seperti yang dijangkakan pelarut telah menyebabkan pigmen berhijrah ke dalam kumpulan keterlarutan mereka. Klorofil B hijau kekuningan ialah jalur pertama yang kami kenal pasti, hanya berhijrah mm dan Klorofil A hijau kebiruan berhijrah mm. Ini memberitahu kami bahawa hanya terdapat Klorofil dalam daun hijau, walaupun pelajar lain yang telah melakukan eksperimen ini juga mencapai keputusan yang berbeza.

      Satu-satunya isu yang boleh disebut tentang reka bentuk makmal keseluruhan ialah sistem pengudaraan bilik’. Selepas membuka botol dengan pelarut, hanya dalam beberapa minit seluruh bilik mempunyai bau yang sangat kuat yang menyebabkan beberapa pelajar berasa pening atau sakit kepala. Tiada cadangan sebenar untuk masalah ini, kecuali bercakap dengan krew penyelenggaraan sekolah dan memberitahu mereka untuk membetulkan peminat. Sebab-sebab keputusan aneh itu hanya boleh diperolehi kerana fakta, bahawa mungkin bahan kimia yang digunakan untuk eksperimen ini tidak cukup tulen, serta turasan buatan sendiri.