Maklumat

Endonuklease sekatan terdapat dalam?

Endonuklease sekatan terdapat dalam?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Memetik dari: Scientific American Julai 1975 Manipulasi gen oleh Stanley Cohen:

Endonuklease sekatan (dan metilase pengubahsuaian) meluas dalam mikroorganisma; gen untuk membuat mereka dijumpai di kromosom virus dan DNA plasmid ekstrakromosom serta pada banyak kromosom bakteria.

Mengapa gen untuk membuat RE terdapat pada kromosom virus? Juga, bolehkah anda memberikan beberapa contoh di mana ia ditemui pada plasmid?


Terdapat banyak cadangan untuk peranan ekologi sistem pengubahsuaian sekatan (RM), dan sebab ia akan wujud pada unsur genetik mudah alih (cth. plasmid dan virus). Dalam kes ini, saya secara khusus bercakap mengenai virus yang menjangkiti bakteria (aka, bacteriophage).

1) Sistem RM mungkin mempunyai fungsi anti-virus. Biasanya kita akan menganggap sistem seperti itu adalah sebahagian daripada kromosom inang, tetapi seperti yang dicadangkan oleh Alan Boyd, setelah fag yang beriklim sedang mengintegrasikan dirinya ke dalam kromosom, kecergasannya terikat pada tuan rumahnya. Oleh itu, sistem RM yang terdapat dalam ramalan dapat mencegah jangkitan melalui fage tambahan. Lihat di sini untuk perbincangan mengenai isu ini: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23471617

2) Sistem RM mungkin mempunyai sifat "ketagihan" dengan bertindak sebagai sistem toksin-antitoksin. Pada asasnya, ini bermakna jika gen untuk sistem RM hilang, sel perumah mati. Ini dapat memberikan pilihan untuk pemeliharaan plasmid dan ramalan di dalam sel inang. Lihat di sini untuk perbincangan mengenai isu ini: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3874152/

3) Akhirnya, virus perlu memusnahkan genom inang - baik untuk menekan sebarang tindak balas anti-virus dan untuk melepaskan nutrien untuk replikasi virus. Walaupun ini biasanya dicapai dengan nuklease selain daripada endonuklease sekatan, terdapat sekurang-kurangnya satu keadaan di mana RE kelihatan terlibat. Ini dibincangkan dalam pautan pertama di atas (lihat bahagian bertajuk "Peranan dalam Pemakanan")


Jika anda mempunyai genom dsDNA dan menirunya dengan menggulung bulatan seperti kebanyakan bakteriofaj dan banyak plasmid, endonuklease adalah satu keperluan.


Enzim sekatan yang dikenali EcoRI dikodkan plasmid.

Betlach et al. (1976) Analisis endonuklease sekatan terhadap plasmid bakteria yang mengawal sekatan dan pengubahsuaian DNA EcoRI. Fed. Proc. 35: 2037 - 43.

Untuk contoh sistem yang dikodkan fage, lihat:

Dempsey et al. (2005) Sau421, sistem pengubahsuaian sekatan seperti BcgI yang dikodkan oleh fag42-penukar empat kali ganda Staphylococcus aureus. Mikrobiologi 151: 1301-1311

Makalah kedua ini menunjukkan jawapan mengapa phage mempunyai sistem seperti ini: lisogen Phi42 tahan terhadap jangkitan oleh semua 23 anggota kumpulan standard S. aureus phages. Sebaik sahaja fag dilogogensikan adalah kepentingannya untuk mencegah lisis inangnya.


Sistem pengubahsuaian sekatan

The sistem pengubahsuaian sekatan (sistem RM) terdapat dalam bakteria dan organisma prokariotik lain, dan memberikan pertahanan terhadap DNA asing, seperti yang ditanggung oleh bakteriofag.

Bakteria mempunyai enzim sekatan, juga dipanggil endonuklease sekatan, yang membelah DNA untai berganda pada titik tertentu kepada serpihan, yang kemudiannya didegradasi lebih lanjut oleh endonuklease lain. Ini mencegah jangkitan dengan memusnahkan DNA asing yang diperkenalkan oleh agen berjangkit (seperti bacteriophage). Kira-kira satu perempat bakteria yang diketahui mempunyai sistem RM dan kira-kira satu setengah mempunyai lebih daripada satu jenis sistem.

Oleh kerana urutan yang diakui oleh enzim sekatan sangat pendek, bakteria itu sendiri pasti akan mengandungi beberapa di dalam genomnya. Untuk mengelakkan pemusnahan DNAnya sendiri oleh enzim sekatan, kumpulan metil ditambahkan. Pengubahsuaian ini tidak boleh mengganggu pasangan asas DNA, dan oleh itu, biasanya hanya beberapa bes tertentu diubah suai pada setiap helai.

Endonuklease membelah ikatan fosfodiester dalaman / bukan terminal. Mereka melakukannya hanya setelah mengenali urutan tertentu dalam DNA yang biasanya panjangnya 4-6 pasang asas, dan selalunya palindromik.


Endonuklease sekatan digunakan untuk sintesis DNA in vitro yang disintesis oleh bakteria sebagai sebahagian daripada mekanisme pertahanan mereka

Endonuklease sekatan digunakan untuk sintesis DNA in vitro yang disintesis oleh bakteria sebagai sebahagian dari mechansim pertahanannya yang terdapat dalam sel mamalia untuk penurunan DNA apabila sel mati digunakan dalam kejuruteraan genetik untuk mengikat dua molekul DNA.

Bioteknologi: Prinsip dan Proses

d. Product con 143. Terapi gen klinikal pertama diberikan pada tahun 1990 kepada seorang kanak-kanak perempuan berumur empat tahun yang menghidap SCID. Proses tersebut melibatkan a. Memindahkan gen ADA ke dalam darah b.Rawatan dengan terapi penggantian enzim c. Pengenalan ADAC-DNA berfungsi (menggunakan vektor retroviral) ke dalam limfosit pesakit, yang kemudian dikembalikan kepada pesakit d. Memindahkan gen ADA melalui kaedah vaksin DNA

Bioteknologi: Prinsip dan Proses

S 36. Enzim mana yang akan dihasilkan dalam sel di mana terdapat mutasi omong kosong dalam gen lac Y? (1) Laktosa permease dan transasetilase (2) ß-galactosidase (3) Laktosa permease (4) Transasetilase

Bioteknologi: Prinsip dan Proses

Antara ion berikut, yang manakah merangsang pembebasan elektron dari air dengan cepat? (1) Mg ++ (2) Kucing + (4) Mn ++ (3) CH-


Sekatan dan Pengubahsuaian DNA

Kepelbagaian dan Evolusi

Enzim R-M boleh dibedah ke dalam modul. MTase Jenis II merangkumi TRD dan modul yang bertanggungjawab untuk memangkinkan pemindahan kumpulan metil dari AdoMet ke kedudukan yang ditentukan di pangkalan yang berkaitan. Domain pemangkin berkongsi persamaan jujukan, dan ini paling serupa apabila tindak balas pemangkin adalah sama, iaitu, menghasilkan produk yang sama (cth., 5 mC). Memandangkan kekhususan yang sepadan dengan ENase dan MTase kognitif, kemungkinan TRD mereka akan mempunyai urutan asid amino yang serupa. Ini tidak berlaku, nampaknya kedua-dua enzim menggunakan strategi yang berbeza untuk mengenali urutan sasarannya. Setiap subunit ENase dimerik perlu mengenali separuh daripada urutan simetri putaran sedangkan MTase monomer mesti mengenali keseluruhan urutan. Ketiadaan persamaan antara TRD ENase dan MTase kognitifnya menunjukkan bahawa mereka mungkin telah berkembang dari asal-usul yang berbeza.

Enzim sekatan yang mengenali urutan sasaran yang sama dirujuk sebagai isoschizomer. Jangkaan sederhana adalah bahawa TRD dua enzim tersebut akan serupa. Ini tidak semestinya begitu. Selanjutnya persamaan yang dilihat tidak berkorelasi dengan jarak taksonomi. Urutan asid amino dari isoschizomers HaeIII dan NgoPII, yang diasingkan dari bakteria dalam filum yang sama, menunjukkan sedikit, jika ada, kesamaan sedangkan isoschizomers FnuDI dan NgoPII, yang diasingkan dari bakteria dalam filum yang berbeza, sangat serupa (59% identiti).

Sistem R-M Jenis I adalah kompleks dalam komposisi dan menyusahkan dalam cara tindakannya, tetapi ia sangat sesuai untuk kepelbagaian kekhususan jujukan. Subunit tunggal (HsdS atau S) memberikan kekhususan kepada keseluruhan kompleks R-M dan kompleks tambahan yang lebih kecil yang merupakan MTase. Sebarang perubahan dalam kekhususan menjejaskan sekatan dan pengubahsuaian secara serentak. Selaras dengan potensi mereka untuk mengembangkan kekhususan baru, sistem Jenis I wujud sebagai keluarga di mana ahli, misalnya, EcoKI dan EcoBI, hanya dapat dibezakan oleh subunit S mereka. Pada masa ini, gen alel telah dikenal pasti untuk sekurang-kurangnya tujuh anggota satu keluarga yang setiap ahli mempunyai kekhususan yang berbeza. Lebih mengejutkan apabila mendapati gen alel di E coli, dan saudara-mara, juga menentukan sekurang-kurangnya dua keluarga enzim Jenis I. Walaupun ahli keluarga hanya memasukkan perbezaan jujukan utama dalam polipeptida S mereka, mereka dalam keluarga yang berbeza berkongsi identiti jujukan yang sangat terhad (biasanya 18-30%). Jelas, perbezaan antara urutan gen untuk sistem R-M Jenis I tidak menunjukkan keterkaitan filogenetik strain yang mengekodinya. Adalah menarik untuk diperhatikan bahawa walaupun secara umum tidak terdapat persamaan urutan antara anggota keluarga berlainan enzim Jenis I, persamaan yang jelas telah dikenal pasti untuk TRD dari keluarga yang berbeza apabila mereka memberikan kekhususan urutan yang sama.

Maklumat dari urutan gen untuk kedua-dua sistem Jenis I dan Jenis II, seperti yang dinyatakan oleh Raleigh dan Brooks, pada tahun 1998, 'menghasilkan gambaran kumpulan gen yang telah beredar dengan beberapa batasan taksonomi untuk waktu yang sangat lama'.

Kebolehubahan alel adalah salah satu ciri sistem R-M Jenis I yang paling mencolok. Kedua-dua sifat dwipartit dan asimetri jujukan sasaran menawarkan lebih banyak skop untuk kepelbagaian kekhususan jujukan daripada jujukan pengecaman simetri sistem Jenis II. Subunit S bagi enzim Jenis I termasuk dua TRD, setiap satu menyatakan satu komponen jujukan sasaran. Organisasi domain ini menjadikan subunit sangat sesuai dengan generasi kekhususan baru sebagai akibat dari kombinasi baru TRD atau perubahan kecil dalam jarak antara TRD. Dalam kes pertama, penggabungan semula hanya menyusun semula kawasan yang menyatakan TRD dan, dalam yang kedua, silangan yang tidak sama rata dalam jujukan pendua pendek membawa kepada perubahan dalam jarak antara TRD. Kedua-dua proses ini telah berlaku di makmal secara kebetulan, dan juga secara reka bentuk. Perlindungan urutan sasaran yang tidak diubah dalam kromosom host, dengan pengurangan sekatan, meningkatkan peluang untuk perubahan kekhususan.

Walaupun banyak bakteria mengekalkan hubungan erat tiga gen sistem R-M Jenis I (hsdR, hsdM, dan hsdS Rajah 2 , telah dijelaskan sejumlah bakteria yang mengandungi banyak salinan hsdS yang berubah-ubah fasa. Mengacak urutan DNA yang menyandikan TRD protein HsdS yang berbeza memberikan kaedah dinamik untuk kekhususan yang berbeza-beza. Dalam Mycoplasma pulmonis, terdapat dua contoh 'shufflon', sistem yang bergabung semula hsdS gen. Kedua-dua shufflon mengandungi hsdR dan hsdM gen diapit oleh dua hsdS gen yang terbalik saling menghormati antara satu sama lain. Penggabungan semula antara dua salinan ini hsdS dapat menghasilkan empat spesifisiti sasaran yang berbeza. Shufflon yang lebih kompleks wujud dalam genom komensal manusia Bacteroides fragilis, yang mengandungi hsd lokus dengan kapasiti untuk menjana lapan protein HsdS dengan kekhususan yang berbeza.

Untuk sistem R-M Jenis I, pertukaran atau penukaran semula domain dapat membuat enzim dengan kekhususan baru, tetapi evolusi TRD baru dengan kekhususan yang berbeza belum pernah disaksikan. Dalam satu eksperimen, pemilihan kuat untuk perubahan yang membenarkan degenerasi pada salah satu daripada tujuh kedudukan dalam jujukan sasaran gagal menghasilkan mutan dengan kekhususan yang santai.


11.1: Endonuklease sekatan

  • Disumbang oleh Clare M. O & rsquoConnor
  • Profesor Madya Emeritus (Biologi) di Boston College

Sistem sekatan / pengubahsuaian bakteria melindungi daripada penyerang

Penemuan enzim sekatan, atau endonuklease sekatan (REs), sangat penting untuk pengembangan pengklonan molekul. RE berlaku secara semula jadi pada bakteria, di mana mereka secara khusus mengenali peregangan nukleotida pendek dalam DNA dan menjadi pemangkin rehat dua helai pada atau dekat
laman pengiktirafan (juga dikenali sebagai laman web larangan). Sehingga kini, beribu-ribu RE dengan kekhususan yang berbeza telah diterangkan. Anda mungkin tertanya-tanya mengapa bakteria menyimpan enzim yang berpotensi merosakkan ini. REs adalah sebahagian daripada sistem pertahanan bakteria terhadap DNA asing, seperti bakteriofag berjangkit. Laman RE dalam bakteria & DNA rsquos sendiri dilindungi dari pembelahan kerana mereka telah diubah suai oleh metiltransferase yang secara khusus mengubah laman RE. Kegiatan gabungan dari endonuclease dan methyltransferase disebut sebagai sistem larangan / pengubahsuaian. Hari ini, RE yang paling banyak dijual secara komersial tidak disucikan dari sumber semula jadi .. Sebaliknya, RE biasanya diasingkan dari bakteria yang terlalu banyak mengekspresikan RE dari plasmid. RE rekombinan ini sering direkayasa oleh ahli biologi molekul untuk memasukkan perubahan asid amino yang meningkatkan aktiviti pemangkin atau kestabilan RE.

Untuk memahami cara RE berfungsi, kami akan menggunakan EcoRI, salah satu RE yang paling dikaji, sebagai contoh. Walaupun nama RE individu mungkin kedengaran sedikit seperti bercakap bayi, tatanama sebenarnya sangat sistematik dan berdasarkan sumber biologinya. EcoRI dijumpai secara semula jadi dalam strain RY13 dari Escherichia coli. Namanya bermula dengan genus dan spesies (Eco untuk E coli), diikuti oleh pengenal ketegangan (R untuk RY13), dan diakhiri dengan angka Rom yang membezakan RE yang berbeza yang terdapat dalam regangan. Terikan RY13 daripada E coli mengandungi banyak RE, tetapi hanya EcoRI dan EcoRV, digunakan secara meluas dalam biologi molekul.

Enzim sekatan membelah laman web tertentu dalam DNA

Enzim sekatan seperti EcoRI sering disebut 6-pemotong, kerana mereka mengenali urutan 6-nukleotida. Dengan mengandaikan sebaran rawak A, C, G dan Ts dalam DNA, kebarangkalian meramalkan bahawa laman pengecaman untuk pemotong 6 harus berlaku kira-kira sekali untuk setiap 4096 bp (4 6) dalam DNA. Sudah tentu, pengedaran nukleotida dalam DNA tidak rawak, jadi ukuran sebenar serpihan DNA yang dihasilkan oleh EcoRI berkisar antara ratusan hingga ribuan pasangan asas, tetapi ukuran rata-rata hampir 4000 bp. Serpihan DNA sepanjang ini berguna dalam makmal, kerana ia cukup panjang untuk mengandungi urutan pengekodan untuk protein dan diselesaikan dengan baik pada gel agarose.

EcoRI mengenali urutan G A A T T C dalam DNA untai dua. Urutan pengecaman ini ialah palindrom dengan paksi simetri dua kali ganda, kerana bacaan dari 5&rsquo hingga 3&rsquo pada kedua-dua helai heliks memberikan urutan yang sama. Sifat palindromik tapak sekatan adalah lebih jelas dalam rajah di bawah. Titik di tengah tapak sekatan menandakan paksi simetri. EcoRI memangkinkan hidrolisis ikatan fosfodiester antara G dan A pada kedua-dua helai DNA. Fragmen sekatan yang dihasilkan dalam tindak balas mempunyai ekor helai tunggal pendek di hujung 5 & rsquo. Hujung-ujung ini sering disebut sebagai & ldquosticky hujung, & rdquo kerana kemampuannya membentuk ikatan hidrogen dengan urutan DNA pelengkap.

RE kadang-kadang disebut sebagai gunting molekul kerana kemampuannya menghasilkan serpihan sekatan yang berakhir dengan urutan yang ditentukan. Hujung & ldquosticky & rdquo ini penting untuk teknologi DNA rekombinan, kerana ia membolehkan penyelidik membina molekul DNA pereka. Mana-mana dua molekul DNA dengan hujung melekit yang serasi dapat disatukan oleh ligase DNA yang berfungsi sebagai & ldquopaste & rdquo dengan menutup ikatan fosfodiester yang rosak. Kami tidak akan menghasilkan molekul rekombinan di kelas ini, tetapi penting untuk memahami kepentingannya terhadap biologi moden. Pertimbangkan plasmid pBG1805 dan pYES2.1. Dari peta plasmid dalam Bab 10, anda dapat melihat bahawa plasmid kompleks ini dibina dengan menyatukan urutan DNA dari sumber yang berbeza evolusi.


Pengenalan

Enzim sekatan juga disebut & quot; gunting molekul & quot kerana mereka membelah DNA pada atau dekat urutan pengecaman tertentu yang dikenali sebagai laman sekatan. Enzim ini membuat satu sayatan pada setiap dua helai DNA dan juga disebut endonuklease sekatan. 4

Virus menjangkiti sel inang dengan menyuntik DNA mereka ke dalam sel. DNA virus ini merampas jentera sel perumah untuk pembiakan progeni virus, mengakibatkan kematian sel perumah. Untuk mengatasi jangkitan virus, banyak bakteria dan archaea telah mengembangkan beberapa mekanisme. Mekanisme perlindungan utama melibatkan penggunaan enzim sekatan untuk merendahkan DNA virus yang menyerang dengan membelahnya di tapak sekatan tertentu. Pada masa yang sama, sel perumah melindungi DNAnya sendiri daripada dibelah dengan menggunakan enzim lain yang dipanggil metilasi, yang metilat adenin atau bes sitosin dalam urutan pengecaman perumah. Untuk setiap enzim sekatan, sel inang menghasilkan metilase yang sesuai yang memetilasi dan melindungi DNA inang dari degradasi. Enzim ini membentuk sistem pengubahsuaian sekatan (R-M).

Enzim sekatan memangkinkan hidrolisis ikatan antara atom 3'-oksigen dan atom fosforus dalam tulang belakang fosfodiester DNA. Enzim memerlukan Mg 2+ atau ion divalen lain untuk aktivitinya.


Fungsi Enzim Sekatan

Fungsi enzim sekatan di alam semula jadi adalah untuk mempertahankan bakteria terhadap virus tertentu yang dipanggil bacteriophages. Virus ini menyerang bakteria dengan menyuntikkan RNA virus atau DNA ke dalam plasmid bakteria (cincin kecil, ungu pada gambar di bawah) dan mereplikasi di sana. Jika RNA atau DNA virus dikesan dalam sel prokariot, sel itu selalunya boleh menghentikan proses replikasi dengan menghiris maklumat genetik asing. Ini menjadikannya tidak berguna. Pada masa yang sama, DNA bakteria dilindungi dari tindakan pemotongan endonuklease sekatannya di dalam kawasan larangannya. Mekanisme ini menambahkan metil (H3C) mengelompokkan ke sitosin dan adenin DNA bakteria tanpa mempengaruhi urutan DNA yang dikodkan.

Sehingga kini, kira-kira 3500 enzim sekatan telah diasingkan daripada plasmid bakteria. Setiap enzim mengenali urutan spesifik kod genetik virus dan akan cuba memisahkan helai DNA baru yang bermutasi dekat atau jauh dari laman pengenalan. Mekanisme pemisahan semula jadi ini juga disebut sebagai pencernaan enzim pembatasan.

Bukan hanya lokasi dan kaedahnya tetapi juga jenis potongannya dapat berbeza. Sebilangan RE meninggalkan hujung melekit yang tidak rata (hujung tidak tumpul) di antara kawasan yang sedikit berbeza dari helai berkembar yang menggantung yang lain meninggalkan hujung tumpul di mana pasangan asas dipisahkan pada titik yang sama. Sebagai contoh, BamHI ialah enzim sekatan jenis II yang diperoleh daripada Escherichia coli yang mengenali jujukan nukleotida GGATCC dan membelah bahagian DNA ini meninggalkan hujung melekit. Pembelahan, seperti memotong log dengan kapak, adalah istilah yang diterima secara saintifik untuk memotong helai DNA.

Dalam imej di bawah, enzim sekatan yang dipanggil HindIII membelah DNA pada titik berbeza pada dua helai untuk membentuk hujung melekit.


Sejarah enzim sekatan

Pada awal 1950-an, sebilangan pasukan penyelidik memerhatikan perbezaan kecekapan jangkitan bakteriofag pada strain inang bakteria yang berbeza dari spesies yang sama [2,3]. Ini dijelaskan oleh Grasso dan Paigen: Ketika fage λ merebak dalam satu jenis bakteria (mis., E coli C) digunakan untuk menjangkiti jenis bakteria spesies yang sama (mis., E coli K), penurunan ketara dalam kadar jangkitan telah dicatatkan berbanding dengan jangkitan semula strain perumah (E coli C). Tuan rumah baru (E coli K) nampaknya memilih menentang atau "menyekat" fage yang masuk. Para penyelidik juga menyatakan bahawa ini bukan fenomena keturunan, kerana fag yang tumbuh pada strain baru dapat menjangkiti ketegangan pada kadar yang lebih biasa setelah satu kali jangkitan. Fenomena yang diperhatikan ditakrifkan sebagai "variasi kawalan tuan rumah" dan menjadi kawasan penyelidikan yang sengit untuk menemui mekanisme asas [4].

Sehingga tahun 1960-an mekanisme yang mendasari variasi kawalan perumah ditentukan untuk melibatkan pembelahan enzimatik DNA fag, yang membawa kepada penemuan dan pengasingan enzim sekatan. Pada awal 1960-an, Werner Arber memerhatikan bahawa penentu jarak inang berada pada DNA fage, dan eksperimen berikutnya menunjukkan bahawa methionine terlibat dalam perlindungan host [5]. Penemuan ini akhirnya membawa kepada cadangan sistem pengubahsuaian sekatan (RM), di mana enzim sekatan dan metilase daripada perumah bekerjasama untuk membelah DNA virus asing (tidak metilasi) sambil mengekalkan DNA perumah dilindungi melalui metilasi [6 ].

Menariknya, sebahagian besar pekerjaan awal sistem R-M adalah pada kumpulan enzim sekatan Jenis I dan III, yang diklasifikasikan berdasarkan aspek struktur dan fungsinya (lihat Pengelasan enzim sekatan). Walau bagaimanapun, kegunaan lengkap enzim sekatan tidak menjadi jelas sehingga Kent Wilcox dan Hamilton Smith menemui HindII, enzim sekatan pertama dari kelas Jenis II [7]. HindII mengenali urutan DNA simetri tertentu dan membelah dengan cara yang ditentukan dalam urutan pengecaman itu. Ciri ini, yang ditemui dalam kebanyakan enzim sekatan Jenis II awal, menyebabkan Kathleen Danna dan Daniel Nathans menggunakan HindII dalam pemetaan fizikal virus simian 40 DNA [8], satu proses yang dikenali sebagai pemetaan enzim sekatan.

Untuk karya perintis mereka dengan enzim sekatan, Daniel Nathans, Hamilton Smith, dan Werner Arber dianugerahkan Hadiah Nobel 1978 dalam Fisiologi atau Perubatan. Dengan penemuan DNA ligase, dalam kombinasi dengan keluarga enzim sekatan pemotongan spesifik di lokasi yang semakin meningkat, lahirlah teknologi DNA rekombinan.


Metilasi

Metilasi DNA adalah salah satu jenis pengubahsuaian DNA yang paling biasa terdapat di eukariota dan prokariota. Dalam bakteria, ia adalah sebahagian daripada sistem pertahanan pengubahsuaian sekatan (R-M) terhadap jangkitan phage (lihat asas enzim Sekatan), di mana bakteria perumah melindungi DNA mereka sendiri daripada pembelahan oleh enzim sekatan endogen mereka. Metilasi biasanya berlaku pada bes sitosin (C) dan adenina (A), dan kebanyakannya membentuk derivatif 5-metilcytosine ( m 5C), N 4 -metilcytosine ( m 4C), dan N 6 -methyladenine ( m 6A).

DNA metiltransferase mendorong reaksi metilasi dengan memindahkan kumpulan metil dari penderma ke pangkalan penerima (mis., A dan C). Jenis metiltransferase DNA yang paling biasa ditemui dalam strain makmal bakteria termasuk:

  • Empangan: bermaksud deoksiadenosin metiltransferase dan menukarkan jujukan 5′-GATC-3′ kepada 5′-G(m 6A)TC-3′
  • Dcm: bermaksud deoksicytosin metiltransferase dan menukarkan jujukan 5′-CCWGG-3′ kepada 5′-C(m 5C)WGG-3′ (di mana W ialah sama ada A atau T)
  • EcoKI: bermaksud sistem R-M Jenis I di E coli ketegangan K12 dan mengubah suai adenosin dalam urutan 5'-AAC(N)6GTGC-3 ′
  • EcoBI: bermaksud sistem R-M Jenis I di E coli B regangkan dan ubah adenosin mengikut urutan 5′-TGA (N)8TGCT-3′

Dalam sistem mamalia dan tumbuhan, metilasi CpG atau CpNpG adalah pengubahsuaian DNA yang biasa dengan implikasi dalam proses biologi, menjadikannya fokus utama kajian epigenetik.

Sensitiviti enzim sekatan terhadap laman pengecaman DNA metilasi bergantung pada enzim sekatan. Sebagai contoh, seperti yang digambarkan dalam Gambar 4, Metilasi empangan di GATC menyekat MboI sepenuhnya tetapi mengaktifkan DpnI. Sebaliknya, metilasi CpG pada 5'-CCGG-3' menyekat aktiviti HpaII tetapi tidak mempunyai kesan pada MspI. Dalam sesetengah kes, aktiviti enzim sekatan hanya dihalang sebahagiannya oleh metilasi (cth., XhoI).

Rajah 4. Bervariasi kepekaan enzim sekatan terhadap metilasi DNA substrat.

Apabila membiak plasmid dalam bakteria, kesan metilasi pada enzim sekatan yang diminati mesti dipertimbangkan. Untuk mengelakkan metilasi pada 5′-GATC-3 ′ dan 5′-CCWGG-3 ′, sel kompeten yang kekurangan metilase Dam dan Dcm (empangan – /dcm -) harus dipilih untuk transformasi plasmid. Paling E coli sel tidak mempunyai sistem metilasi CpG, jadi metilasi CpG tidak membimbangkan DNA yang diasingkan dari bakteria. Jika DNA genom diekstrak daripada tumbuhan dan mamalia, metilasi mungkin berlaku di tapak CpG dan memberi kesan kepada penghadaman sekatan langsung oleh beberapa enzim sensitif metilasi.


Jenis sistem sekatan dan modifikasi (R-M):

Enzim Jenis I:- Enzim sekatan Jenis I menunjukkan aktiviti sekatan dan pengubahsuaian DNA. Mereka memerlukan kofaktor seperti ion Mg2 +, S-adenosylmethionine (SAM) dan ATP untuk aktiviti mereka. Urutan pengecaman cukup panjang tanpa ciri yang dapat dikenali seperti simetri. Nuklease endo sekatan jenis I membelah DNA di tapak tidak spesifik dan itu boleh menjadi 1000 pasangan asas atau lebih daripada jujukan pengecaman. Walau bagaimanapun, kerana tindak balas metilasi dilakukan oleh enzim yang sama yang mengantara belahan, DNA sasaran boleh diubah suai sebelum ia dipotong. Kerana ciri-ciri ini, sistem tipe I tidak bernilai untuk manipulasi gen.

Enzim jenis II :- Enzim Jenis II dan modiltransferase modifikasi yang sesuai bertindak sebagai protein yang berasingan. Mereka mempunyai sejumlah kelebihan berbanding sistem jenis I dan III. Pertama, pembatasan dan pengubahsuaian dimediasi oleh enzim yang terpisah sehingga mungkin untuk membelah DNA jika tidak ada pengubahsuaian. Kedua, aktiviti larangan tidak memerlukan kofaktor seperti ATP atau S-adenosylmethionine, menjadikannya lebih mudah digunakan. Mereka hanya memerlukan ion Mg2+ sebagai kofaktor. Enzim-enzim ini adalah khusus lokasi kerana mereka menghidrolisis ikatan fosfodiester khusus pada kedua helai DNA. Endonuklease sekatan Kelas II umumnya digunakan sebagai bahan utama dalam biologi molekul dan teknik DNA rekombinan, termasuk pemetaan genom, analisis RFLP, penjujukan DNA, dan pengklonan.

Enzim Jenis III: - Seperti enzim Kelas I, enzim Jenis III mempunyai aktiviti sekatan dan pengubahsuaian. Mereka mengenali urutan tertentu dan membelah 25 - 27 pasangan asas di luar urutan pengecaman, dalam arah 3 & akut. Mereka memerlukan ion Mg2+ untuk aktiviti mereka.

Enzim jenis IIs, mempunyai struktur kofaktor dan makromolekul yang serupa dengan sistem jenis II, hakikat bahawa sekatan berlaku pada jarak dari laman pengiktirafan membatasi kegunaannya.


Endonuklease sekatan jenis II--perspektif sejarah dan banyak lagi

Artikel ini meneruskan siri Kajian dan Ringkasan mengenai endonuklease sekatan (REases) yang dimulakan tahun ini dalam Penyelidikan Asid Nukleik. Di sini kita membincangkan REASE 'Jenis II', jenis yang digunakan untuk analisis DNA dan pengklonan. Kami memberi tumpuan kepada biokimia mereka: apa itu, apa yang mereka lakukan, dan bagaimana mereka melakukannya. Jenis II Reases dihasilkan oleh prokariota untuk memerangi bakteriofag. Dengan ketepatan yang melampau, setiap satu mengenali urutan tertentu dalam DNA untai dua dan membelah pada kedudukan tetap di dalam atau berdekatan. Penemuan enzim-enzim ini pada tahun 1970-an, dan penggunaan yang dapat digunakan, sejak itu mempengaruhi setiap sudut ilmu kehidupan. Mereka menjadi alat yang memungkinkan biologi molekul, genetik dan bioteknologi, dan membuat analisis pada tahap yang paling mendasar sebagai rutin. Ratusan REAS yang berbeza telah ditemui dan tersedia secara komersial. Gen mereka telah diklon, diuraikan dan diekspresikan secara berlebihan. Kebanyakannya telah dicirikan pada tahap tertentu, tetapi hanya sedikit yang telah dikaji secara mendalam. Di sini, kami menghuraikan penemuan asal dalam bidang ini, dan sifat REases Jenis II yang pertama disiasat. Kami membincangkan mekanisme pengecaman urutan dan pemangkinan, dan mod oligomerik yang bervariasi di mana Jenis II REases bertindak. Kami menerangkan heterogeniti mengejutkan yang didedahkan dengan perbandingan urutan dan strukturnya.

© Pengarang 2014. Diterbitkan oleh Oxford University Press bagi pihak Nucleic Acids Research.

Angka

Bilangan penerbitan untuk EcoRI…

Bilangan penerbitan untuk EcoRI dan EcoRV setiap tahun dari 1972 hingga 2012.…

Hamilton Smith dan Daniel Nathans…

Hamilton Smith dan Daniel Nathans pada sidang akhbar Hadiah Nobel, 12 Oktober…

Ilustrasi skematik langkah-langkah…

Ilustrasi skematik langkah-langkah yang terlibat dalam pengecaman dan pembelahan DNA oleh REases…

Struktur kristal sekatan tertentu…

Struktur kristal bersama kompleks enzim sekatan – DNA yang ditentukan antara tahun 1990 dan 1999.

Perwakilan skematik interaksi…

Perwakilan skematik interaksi EcoRI dengan urutan pengecamannya. Untuk kejelasan,…

Perwakilan skematik interaksi…

Perwakilan skematik interaksi EcoRV dengan urutan pengecamannya. Interaksi dengan…

Mekanisme umum untuk DNA ...

Mekanisme umum untuk pembelahan DNA oleh EcoRI dan EcoRV. Air diaktifkan…

Laman web aktif (PD… D / ExK)…

Laman web aktif (PD… D / ExK) EcoRI dan EcoRV.

Contoh laman web pemangkin REase (MvaI, pdb: 2OAA). Air nukleofilik ...

Mekanisme alternatif pemindahan fosforil…

Mekanisme alternatif tindak balas pemindahan fosforil: bersekutu (atas) dan disosiatif (bawah). Mekanisme…

Perbandingan tapak aktif…

Perbandingan laman aktif dua enzim sekatan struktur yang sangat serupa BglII…

Komposisi dan pembelahan subunit…

Komposisi subunit dan mekanisme pembelahan subtipe terpilih Jenis II MENGGANGGU….

Cara pengikatan DNA oleh protein jari zink: setiap jari mengenali kira-kira tiga…