Maklumat

12.5: Latihan 1 - Transformasi yis - Biologi

12.5: Latihan 1 - Transformasi yis - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Protokol berikut ialah pengubahsuaian sedikit protokol transformasi "Cepat dan Kotor" yang diterangkan oleh Amberg et al. (2005). Pengubahsuaian kepada kaedah ini boleh meningkatkan kecekapannya dengan beberapa urutan magnitud (Gietz dan Schiestl, 2007), yang akan diperlukan jika kepingan DNA linear digunakan untuk mengubah yis.

Sediakan campuran induk transformasi

1. Sediakan campuran induk transformasi. Bahan-bahan berikut menyediakan reagen yang mencukupi untuk lima tindak balas transformasi. Satukan dan campurkan dalam tiub microcentrifuge:

100 μL steril 2 M litium asetat (baru disiapkan)
400 μL steril 50% PEG-3350
4 μL 2-mercaptoethanol (BAU! tambah ini dalam tudung wasap!)

Siapkan reaksi transformasi individu - untuk setiap transformasi:

2. Tambahkan 15 μL DNA sperma salmon yang telah didenaturasi (2 mg/mL) ke dalam tiub mikrosentrifuge baharudilabelkandengan nama (atau kod) plasmid.

Nota: Adalah penting untuk DNA sperma salmon menjadi untai tunggal agar prosedur ini berfungsi dengan baik. Rebus DNA selama 5 minit untuk denaturasi DNA. Dinginkan DNA dengan cepat dengan meletakkannya segera di atas ais. Simpan DNA pada ais sehingga anda bersedia untuk menggunakannya.

3. Tambah 5 μL DNA plasmid miniprep ke dalam tiub microcentrifuge yang berlabel sesuai.

4. Tambahkan 100 μL campuran transformasi dari langkah 1 ke setiap tiub mikrokrifrif. Vortex selama 10-15 saat untuk mencampurkan kandungan.

5. Menggunakan pencungkil gigi steril atau hujung mikropipet, kikis koloni yis yang besar (atau yang setara dengan "kepala mancis" yis) dari plat YPD. Pindahkan ragi ke tiub mikrokrifrif yang mengandungi larutan transformasi / DNA (langkah 4) dengan memutar tusuk gigi beberapa kali. Pastikan sel-sel digantung secara seragam sebelum meneruskan.

Ulang langkah 2-5 untuk setiap tindak balas transformasi anda. Pastikan anda memasukkan kawalan yang tidak mengandungi DNA plasmid.

6. Eramkan campuran transformasi pada suhu 37 ̊C dengan goncangan selama 30-45 minit.

Sadurkan sel yang diubah pada media terpilih yang tidak mempunyai urasil.

7. Keluarkan 10 μL sel yang dihidupkan semula dan tambahkannya ke 90 μL air steril dalam tiub mikrokrifrif. Sampel ini akan dicairkan secara bersiri untuk plat tempat (langkah 9) yang akan anda gunakan untuk mengira kecekapan transformasi.

8. Sapukan baki campuran pada plat media terpilih yang tidak mempunyai urasil. Pindahkan tindak balas transformasi ke piring, dan kemudian goncangkan ~ 4 biji manik kaca steril yang akan menyebarkan sel. Tutup pinggan dan luangkan masa 0.5-1 minit mengacau pinggan supaya manik menyebarkan campuran transformasi secara merata ke atas permukaan pinggan. Buang manik kaca ke dalam bekas sisa yang sesuai, supaya ia boleh disterilkan dan digunakan semula. Inkubasi plat pada suhu 30 ̊C sehingga koloni dapat dikesan. Paling awal koloni akan kelihatan biasanya 2 hari. Jika koloni kecil, biarkan mereka membesar satu hari tambahan pada suhu 30 ̊C. Hitung jumlah jajahan di pinggan.

Tentukan bilangan sel yang berdaya maju dalam campuran transformasi.

9. Sediakan satu siri 4 pencairan tambahan sel yang diketepikan dalam langkah 7. Gunakan pencairan ini
untuk plat tempat pada media YPD. Setiap baris pada plat harus mengandungi sel daripada tindak balas transformasi yang berbeza. Inkubasi sel pada suhu 30 ̊C atau suhu bilik sehingga koloni individu dapat dikesan. Jangan biarkan piring tumbuh terlalu banyak, kerana anda perlu membezakan koloni individu.

Kira kecekapan transformasi. Kecekapan transformasi dipengaruhi oleh kualiti DNA yang digunakan dan butiran tepat prosedur transformasi.

10. Hitung pecahan sel yang diubah seperti gambar di bawah. Jumlah isipadu campuran transformasi ialah ~120 μL, termasuk sel yis. Sepuluh μL digunakan untuk penyaduran tempat dan baki 100 μL digunakan untuk transformasi.

11. Kecekapan transformasi biasanya dinyatakan dengan jumlah sel yang diubah per μg DNA. Dalam makmal terakhir (Bab 11), anda menganalisis persediaan plasmid anda pada gel agarose dan memperoleh anggaran kasar kepekatan DNA bagi persediaan plasmid anda. Ambil perhatian bahawa anda menganalisis 7 μL persediaan plasmid pada gel tersebut. Di makmal transformasi ini, anda menggunakan 5 μL persediaan plasmid anda.

Kira kecekapan transformasi:

A. Darabkan bilangan sel yang diubah pada plat YC dengan 1.1
(Hanya 100 daripada 110 μL dalam reaksi transformasi yang dilapisi.)

B. Tukarkan ng plasmid dalam tindak balas penjelmaan anda kepada μg.

C. Bahagikan nilai yang dikira dalam A dengan nilai dalam B.


Pembangunan alat biologi sintetik untuk membuat kejuruteraan Pichia pastoris sebagai casis untuk penghasilan produk semula jadi

Ragi metilotrofik Pichia pastoris (a.k.a. Komagataella phaffii) ialah salah satu perumah yang paling biasa digunakan untuk pengeluaran industri protein rekombinan. Sebagai yis bukan konvensional, P. pastoris mempunyai ciri biologi yang unik dan sistem ekspresinya telah dibangunkan dengan baik. Dengan kemajuan dalam biologi sintetik, lebih banyak usaha telah ditumpukan untuk membangunkan P. pastoris ke dalam casis untuk penghasilan pelbagai sebatian bernilai tinggi, seperti produk semula jadi. Kajian semula ini bermula dengan pengenalan alat biologi sintetik untuk kejuruteraan P. pastoris, termasuk vektor, penganjur dan penamat untuk ekspresi gen heterolog serta Sistem Ulangan Palindromik Pendek Berkelompok Berinterspace/CRISPR (CRISPR/Cas) untuk penyuntingan genom. Kajian semula ini kemudiannya diikuti dengan contoh pengeluaran produk semula jadi bernilai tambah dalam kejuruteraan metabolik P. pastoris ketegangan. Akhir sekali, cabaran dan pandangan dalam pembangunan P. pastoris sebagai sasis biologi sintetik dijangka.


Pengklonan penggabungan semula berkaitan transformasi (TAR) untuk kajian genomik dan biologi sintetik

Pengklonan semula berkaitan transformasi (TAR) mewakili alat unik untuk pengasingan dan manipulasi molekul DNA yang besar. Teknik ini memanfaatkan pengumpulan semula homologi yang tinggi dalam ragi Sacharomyces cerevisiae. Setakat ini, pengklonan TAR adalah satu-satunya kaedah yang tersedia untuk memulihkan segmen kromosom secara selektif sehingga 300 kb panjang daripada genom kompleks dan ringkas. Di samping itu, pengklonan TAR membolehkan pemasangan dan pengklonan keseluruhan genom mikrob sehingga beberapa Mb serta kejuruteraan laluan metabolik yang besar. Dalam tinjauan ini, kami merangkum aplikasi pengklonan TAR untuk genomik fungsional / struktur dan biologi sintetik.

Kata kunci: HAC Kromosom tiruan manusia Biologi sintetik Pengklonan TAR Penggabungan semula berkaitan transformasi.

Penyataan konflik kepentingan

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai konflik kepentingan. Artikel ini tidak mengandungi kajian dengan peserta manusia atau haiwan yang dilakukan oleh mana-mana pengarang.


Transformasi Yis

Protokol ini telah dikemukakan oleh Matt Kaeberlein.

Protokol ini berfungsi dengan baik untuk mengubah plasmid dan kaset gangguan PCR.

  • TE + 100mM LiAc (Stok cair 1M LiAc dan 10X TE dalam air 1:1:8).
  • PLAT (1X TE, 100 mM LiAc 40% PEG)
  1. Tumbuhkan ragi untuk diubah semalaman di YPD.
  2. Cairkan kembali kultur semalaman 1:100 dalam YPD segar dan kultur pada suhu 30C selama 4-6 jam.
  3. Putar ke bawah 15mL sel.
  4. Basuh sel 2X dalam 0.5mL TE + 100 mM LiAc
  5. Tangguhkan semula sel dalam 200uL TE + LiAc
  6. Tambah mengubah DNA.
  7. Masukkan 20uL ssDNA yang baru direbus.
  8. Tambah 1mL larutan PLATE. Campurkan dengan penyongsangan beberapa kali.
  9. Inkubkan pada suhu 30C selama 30 minit.
  10. Inkubasi pada suhu 37C selama 15 minit. Campurkan dengan penyongsangan setiap 5 minit.
  11. Putar sel dan piring pada media terpilih.

Untuk mengubah DNA saya menggunakan 1 uL DNA persediaan mini untuk plasmid dan 30-50uL produk PCR untuk gangguan PCR.

Dalam amalan, saya biasanya menaikkan dan memutar turun 45 mL sel dalam tiub 50 mL. Saya mencuci 2X kemudian membelah sel menjadi 3 tiub eppendorf individu untuk transformasi.


Transformasi tumbuhan pengantara Agrobacterium: biologi dan aplikasi

Transformasi genetik tumbuhan sangat bergantung pada patogen bakteria Agrobacterium tumefaciens sebagai alat yang berkuasa untuk menyampaikan gen yang diminati ke dalam tumbuhan perumah. Di dalam nukleus tumbuhan, DNA yang dipindahkan mampu menyatu ke dalam genom tumbuhan untuk diwarisi kepada generasi seterusnya (iaitu transformasi stabil). Sebagai alternatif, DNA asing boleh kekal sementara dalam nukleus tanpa berintegrasi ke dalam genom tetapi masih ditranskripsi untuk menghasilkan produk gen yang diingini (iaitu transformasi sementara). Daripada penemuan A. tumefaciens kepada aplikasinya yang meluas dalam bioteknologi tumbuhan, banyak aspek interaksi antara A. tumefaciens dan tumbuhan telah dijelaskan. Artikel ini bertujuan untuk memberikan tinjauan komprehensif mengenai biologi dan aplikasi transformasi tanaman yang dimediasi oleh Agrobacterium, yang mungkin berguna bagi ahli mikrobiologi dan ahli biologi tumbuhan yang menginginkan pemahaman yang lebih baik mengenai transformasi tumbuhan, ekspresi protein dalam tumbuhan, dan interaksi tumbuhan-mikroba .

Angka

Langkah-langkah utama Agrobacterium…

Langkah-langkah utama proses transformasi tanaman yang dimediasi oleh Agrobacterium tumefaciens. (1) Lampiran A.…


Transformasi yis - kecekapan rendah (15 Dis / 2008)

Hai semua,
Saya mengubah yis menggunakan kaedah LiOAc/PEG. Kecekapan adalah rendah, kira-kira 10^3-10^4 koloni /ug plasmid.

Protokolnya adalah:
240 ul 50% w/v PEG3350
35 ul 1M LiOAc
25 ul pembawa ssDNA
1 ul plasmid
Gaul rata dan masukkan ke dalam sel yang telah dibasuh.
30 darjah C, 30 minit
42 darjah C, 20 minit
putar ke bawah, tampung semula dalam air
penyaduran

apakah jenis yis yang anda gunakan?

Jika ini S.pombe, saya akan katakan anda perlu meningkatkan tempoh pengeraman 30 C kepada 1 jam, kurangkan kejutan haba (42 C) kepada sekitar 10-5min (saya secara peribadi menggunakan 5min) dan tambah 42ul DMSO untuk meningkatkan kejutan haba .

Juga seberapa keras anda memutar sel anda? Putar untuk masa yang sesingkat mungkin pada tetapan kelajuan terendah yang boleh digunakan oleh mesin anda. Sel ragi rapuh selepas protokol transformasi.

Jika anda menambah DMSO, basuh sebelum menyadur sel.

Setelah sel anda disalut, pastikan inkubator anda sentiasa lembap. S.pombe tidak suka permukaan pinggan kering. Ini membantu meningkatkan kadar pertumbuhan dan pada tahap yang lebih rendah kadar pemulihan. Jadi jika anda menggunakan kelembapan dan mengira koloni pastikan anda melakukan ini untuk semua eksperimen anda.

Bolehkah anda memberitahu saya lebih banyak mengenai apa yang anda lakukan setelah kultur sel anda siap. Adakah anda mencuci dalam sel anda dalam TE+LiAc sebelum membuat campuran sel DNA+ akhir?

Akhir sekali, protokol transformasi LiAc agak kasar dan mungkin boleh ditolak kepada sekitar 10^5 koloni/ug DNA tetapi tidak lebih. Terdapat protokol yang lebih baik, tetapi lebih kompleks dan memakan masa.

Terima kasih, perneseblue,
Saya bekerja dengan yis pembuat roti. Sel-sel tersebut diletupkan oleh cfg pada 3000 rpm, 5 minit. Dicuci sekali dengan 1x isipadu air. Campuran transformasi (plamsid, ssDNA, PEG3350, LiOAc) kemudiannya ditambah kepada pelet sel. Dicampurkan dengan pusaran selama 10 saat. Selepas 30 minit 30 darjah C, dan 20 minit pengeraman 42 darjah C, sel-sel telah dipel, digantung semula dalam air, dan disalut pada plat pemilihan.
Saya akan cuba menambah DMSO lain kali.


Transformasi ragi

Protokol ini berdasarkan Gietz, R.D. dan R.A. hutan. (2002) TRANSFORMASI YEAST MENGIKUT KAEDAH DNA / PEG KARIER Liac / SS. Kaedah dalam Enzimologi 350: 87-96. Beberapa langkah protokol ini adalah berdasarkan maklumat yang diperoleh daripada:

Protokol ini digeneralisasikan dan tidak dianggap optimum untuk semua ketegangan, keadaan, dan aplikasi. Beberapa aspek protokol ini mungkin perlu diubah suai dengan ketara untuk memenuhi keperluan khusus anda. Ia berfungsi untuk transformasi mudah, penyasaran dalam yis, pembaikan GAP, dan transformasi berbilang plasmid untuk dua hibrid.

1) Lumurkan atau tancapkan yis pada YAPD selama 24-48 jam. Boleh juga menggunakan yis dari plat lama (3 bulan? pada 4 darjah) jika kecekapan tidak menjadi masalah dan ketegangan bekerjasama.

2) Inokulasi 2 x 3-5ml kultur dalam media 2xYAPD atau SC (tiub penutup snap 15ml) daripada coretan segar dan inkubasi O/N 30 darjah, 200rpm. Media SC mungkin perlu ditanam lebih banyak (atau lebih banyak tabung mungkin diperlukan).

YAPD boleh digantikan dengan 2xYAPD tetapi kecekapan akan menurun sedikit dan yis akan mengambil masa yang lebih lama untuk berkembang.

1) Pra-panaskan 50ml 2xYAPD hingga 30deg dalam kelalang 500ml (sekurang-kurangnya 10min). Hidupkan mandian air 42deg (mengambil masa 30 minit atau lebih).

2) Cairkan kultur O/N 1:10 dalam air dan ambil OD pada 600nm. Gunakan 2xYAPD (atau YAPD atau SC apabila sesuai) dicairkan 1:10 dalam air sebagai kosong. Budaya yang dicairkan biasanya akan mempunyai OD antara 0.1 dan 1.0.

3) Cairkan kultur kepada kira-kira 0.1 OD dalam 50 ml pra-panas 2xYAPD dan eramkan 3-6jam sehingga OD mencapai 1.0 (atau tutup). Kadar yis tumbuh berbeza-beza jadi bersedia untuk menunggu. Biasanya memerlukan 5-6 jam tetapi boleh memakan masa lebih lama.

CONTOH: Kultur cair dalam langkah 2 mempunyai OD atau 0.2 jadi kultur OD ialah 2.0. Untuk mendapatkan OD kira-kira 0.1 untuk langkah 3 anda akan menambah 2.5ml kultur pada 50ml 2xYAPD anda yang telah dipanaskan sebelumnya (20x pencairan). Jelas tidak tepat kerana sekarang anda akan mempunyai 52.5ml dan bukannya 50ml tetapi cukup dekat. Jika anda mahukannya tepat, anda hanya boleh mengeluarkan 2.5ml 2xYAPD daripada kelalang sebelum anda menambah kultur 2.5ml anda tetapi ia tidak perlu.

4) Pelet 3000rpm, 10min di RT dalam RT6000 atau emparan serupa.

5) Semasa memutar ragi, rebus DNA sperma salmon 5 minit dengan tutup mendidih dan dinginkan di atas ais. Gunakan 3-4 kali (simpan pada -20) dan dapatkan tiub baru. Jangan mendidih berulang kali.

6) Masukkan semula dalam 1ml ddH2O dan pindahkan ke tiub 1.5ml.

7) Pusaran 1min atau sehingga yis berada dalam ampaian (tiada gumpalan).

8) Pelet pada kelajuan maksimum, 30sec, RT dan resuspensi dalam 1ml ddH2O dengan mempusing seperti sebelumnya. 100ul akan digunakan untuk setiap transformasi sehingga terdapat cukup ragi untuk 10 transformasi.

9) Pindahkan 100 ul yis ke dalam tiub 1.5ml yang berasingan untuk setiap transformasi dan pelet pada kelajuan maksimum, 30sec, RT dan keluarkan supernatan.

10) Untuk setiap transformasi, buat yang berikut (campuran induk atau berasingan):

50ul 2mg / ml DNA sperma salmon

34ul atau plasmid anda + air (1ul DNA persediaan mini bakteria adalah banyak)

11) Tambah campuran transformasi kepada pelet yis dari langkah #9 dan vorteks 1min atau sehingga yis berada dalam ampaian (tiada gumpalan).

12) Letakkan ragi pada suhu 42 darjah selama 40 minit. Untuk kecekapan terbaik, masa kejutan optimum perlu ditentukan secara empirikal dan boleh berbeza dari 10 minit hingga 60 minit. Untuk transformasi plasmid pemilihan tunggal mudah 20-30min biasanya berfungsi dengan baik.

13) Pelet pada kelajuan maksimum, 30 saat, RT dan keluarkan campuran transformasi.

14) Tambah 1ml ddH2O dan gunakan hujung pipet 1ml untuk mengacau sel menjadi larutan. Jika perlu, pipet yis ke atas dan ke bawah dengan perlahan-lahan.

15) Plat 200ul pada plat terpilih 100mm atau 150mm yang sesuai dan tumbuh 3-4 hari pada suhu 30deg. *Daripada 1ml dalam langkah 14 anda juga boleh menggantung semula yis dalam 400ul dan meletakkan keseluruhan jumlah pada satu plat 150mm jika anda mahu.

Kecekapan sangat berbeza-beza berdasarkan ketegangan dan mengubah DNA. Ia boleh berbeza dari 1 & # 21510 ^ 3 hingga 1 & # 21510 ^ 5 (atau lebih) koloni setiap ug DNA input (untuk DNA plasmid).

10g ekstrak BactoYeast

100mg adenine hemisulfat

Autoklaf 20 minit pada kitar cecair.

Medium terpilih akan berbeza-beza berdasarkan ketegangan dan penggunaan.

2mg/ml dalam TE. Sigma D1626. Buat 100ml dalam kelalang menggunakan pengacau magnet. Mengambil masa 2-4 jam untuk larut. Aliquot dalam tiub 1.5ml (1ml / tiub).

Letakkan 50gm polietilena glikol, MW 3350 (Sigma) dalam bikar kaca 150 ml dan tambah 35 ml ddH20. Kacau selama 1-2 jam dengan bar kacau magnet sehingga larut. q.s. hingga 100 ml dan terus kacau selama sekurang-kurangnya 10 minit untuk bercampur. Tapis menggunakan penapis 0.45 um dan aliquot dalam kon 15ml (10ml setiap satu) dan simpan di RT.

1.0M Lithium Asetat. Tidak perlu pH.

Tim Schedl, Ph.D
Jabatan Genetik
Kotak Kampus #8232
Sekolah Perubatan Universiti Washington
4566 Scott Ave.
St. Louis, MO 63110


Tonton videonya: TRANSLASI: LATIHAN 1 (Februari 2023).