Maklumat

Deoxyribonucleotides terkonjugasi

Deoxyribonucleotides terkonjugasi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya sedang belajar menggunakan teknik PCR untuk membuat probe DNA berlabel fluoresen, dan buku teks menyebutkan "deoksiribonukleotida terkonjugasi"

Bolehkah seseorang menjelaskan apakah ini? Tidak ada yang terlalu mendalam dan terperinci. Cukup penerangan / penjelasan yang baik sehingga saya dapat sedikit sebanyak memahami.


"Konjugasi" bermaksud bergabung atau menggandingkan sesuatu bersama. Deoxyribonucleotides adalah "huruf" DNA - A, T, C, dan G. Dalam biologi / biokimia, apabila anda mengaitkan sesuatu, anda mengubahnya secara kimia dengan menambahkan sesuatu padanya. Memandangkan konteks soalan anda, deoxyribonucleotides konjugasi dilabel fluoresen - pewarna pendarfluor telah dilampirkan secara kovalen padanya.


Dasar Asid Nukleik dalam Anionik 2′-Deoxyribonucleotides: Kajian DFT / B3LYP mengenai Struktur, Kestabilan Relatif, dan Pertalian Proton

Paparan Artikel ialah jumlah muat turun artikel teks penuh yang mematuhi kontra sejak November 2008 (kedua-dua PDF dan HTML) merentas semua institusi dan individu. Metrik ini dikemas kini secara berkala untuk menunjukkan penggunaan sehingga beberapa hari terakhir.

Petikan adalah jumlah artikel lain yang memetik artikel ini, dikira oleh Crossref dan dikemas kini setiap hari. Dapatkan maklumat lanjut tentang kiraan petikan Crossref.

Skor Perhatian Altmetrik adalah ukuran kuantitatif perhatian yang diterima oleh artikel penyelidikan dalam talian. Mengklik ikon donat akan memuat halaman di altmetric.com dengan perincian tambahan mengenai skor dan kehadiran media sosial untuk artikel yang diberikan. Dapatkan maklumat lanjut tentang Skor Perhatian Altmetric dan cara skor dikira.


Abstrak

Dalam lebih dua dekad sejak penemuan mikroRNA pertama (miRNA), bidang biologi miRNA telah berkembang dengan pesat. Pandangan mengenai peranan miRNA dalam perkembangan dan penyakit, terutama dalam barah, telah menjadikan miRNA alat dan sasaran yang menarik untuk pendekatan terapi baru. Kajian fungsional telah mengesahkan bahawa disregulasi miRNA adalah penyebab dalam banyak kes barah, dengan miRNA bertindak sebagai penekan tumor atau onkogen (oncomiRs), dan miRNA meniru dan molekul yang disasarkan pada miRNA (antimiRs) telah menunjukkan janji dalam perkembangan praklinikal. Beberapa terapi yang disasarkan miRNA telah mencapai perkembangan klinikal, termasuk tiruan miRNA penekan tumor miR-34, yang mencapai ujian klinikal fasa I untuk merawat barah, dan antimiR yang disasarkan pada miR-122, yang mencapai percubaan fasa II untuk merawat hepatitis. Dalam artikel ini, kami menerangkan kemajuan terkini dalam pemahaman kami mengenai miRNA dalam barah dan penyakit lain dan memberikan gambaran umum mengenai terapi miRNA terkini di klinik. Kami juga membincangkan cabaran untuk mengenal pasti calon terapeutik yang paling berkesan dan memberikan perspektif untuk mencapai penyampaian terapi miRNA yang selamat dan disasarkan.


Abstrak

Tujuan kajian ini adalah untuk menguji antigenisitas α-deoxyribonucleotides untuk mengembangkan alat baru untuk mengesan urutan asid nukleik untuk digunakan dalam aplikasi diagnostik. Kami menerangkan empat antibodi monoklonal (Mabs) yang mengenali α-deoxyribonucleotides. Dua dibangkitkan terhadap urutan poli (α-dT) dan secara khusus mengenali nukleotida α-dT. Dua dikemukakan terhadap urutan yang mengandungi keempat-empat nukleotida biasa sebagai α-nukleotida dan, secara mengejutkan, hanya mengenali nukleotida α-dG. Untuk keempat-empat Mab, tidak ada kereaktifan silang dengan / 3-oligonukleotida. Mab ini reaktif dengan urutan aoligonukleotida sama ada urutan ini adalah helai tunggal atau hibridisasi ke DNA atau RNA. Keempat-empat Mab diuji dalam ujian hibridisasi sandwic yang terdiri daripada α-oligonukleotida (untuk pengenalan urutan sasaran), salah satu daripada empat Mab (untuk pengiktirafan a-oligonukleotida hibrida), dan antibodi anti-tikus kambing yang disambungkan ke lobak kuda peroksidase (HRP) (untuk pengesanan). Salah satu antibodi monoklonal, Mab 2E11D7, secara langsung disambungkan ke HRP dan digunakan dalam hibridisasi sandwic untuk mengesan serpihan PCR DNA HPV 18. Sensitiviti tindak balas ini adalah 1 pg DNA plasmid yang mengandungi fragmen HPV 18. Kekhususan pengesanan ditunjukkan dengan menggunakan urutan DNA HPV 6/11 dan 16.


Teks penuh

Asid linoleat konjugasi adalah asid lemak yang terdapat di alam semula jadi, dan tidak mempunyai kesan sampingan negatif yang diketahui. CLA dikenali sejak tahun 1930 tetapi ia diasingkan pada tahun 1987 sebagai agen antimutagenik oleh Dr Pariza dan membuka pintu untuk penyelidikan baru di arena asid lemak. Asid linoleat terkonjugasi (CLA, 18: 2) adalah campuran isomer kedudukan dan geometri asid linoleik dengan dua ikatan berganda terkonjugasi pada pelbagai kedudukan karbon dalam rantai asid lemak (FA) (gambar 1) seperti (7,9), (8,10) (9,11]), (10,12), dan (11,13). Setiap ikatan berganda boleh menjadi sama ada cis atau trans, tetapi mereka yang mempunyai satu trans ikatan berganda adalah isomer bioaktif (1). Terdapat 28 isomer berbeza dengan sedikit berbeza antara satu sama lain dengan ikatan kimianya tetapi cis-9, trans-11 dan trans-10, cis-12 adalah isomer yang paling banyak dikaji (2). Ikatan berganda diletakkan di antara atom karbon ke-9 dan ke-11 sebagai cis 9, trans-11 disebut asid rumenik berdasarkan asal ruminannya (2).

Sumber CLA semula jadi yang paling banyak adalah daging dan produk tenusu ruminan yang diberi makan rumput seperti lembu, domba dan kambing. Rata-rata kandungan CLA dalam produk daging ruminan dan bukan ruminan dilaporkan 0,46% dan 0,16% lemak oleh Dhiman et al (3) sedangkan Shantha et al,, Mir et al (4-5) melaporkan julat CLA yang lebih tinggi (1,7 hingga 8,5 mg CLA / g lipid) dalam produk daging ruminan. Kandungan CLA dalam daging bergantung pada faktor berubah-ubah seperti spesies, berkembang biak, rejim makan (5-6) (dan strategi pengurusan yang digunakan untuk membesarkan lembu (3, 7). Keturunan lembu yang menyimpan sejumlah besar lemak dalam otot terbukti akan memberikan jumlah CLA yang lebih tinggi dalam produk mereka (7). Kandungan CLA makanan tertentu mungkin berbeza-beza cis-9, trans-11 CLA dalam lipid ruminan melalui manipulasi diet haiwan (8). Haiwan yang diberi makan rumput kaya dengan CLA berbanding dengan haiwan yang diberi makan. Kepekatan CLA yang sangat tinggi didapati pada musim bunga dan musim panas (ketika lembu diternak) daripada musim gugur dan musim sejuk (ketika lembu diberi makan) (9). Penyelidikan lebih lanjut menunjukkan bahawa lembu yang merumput pada ketinggian yang relatif lebih tinggi dapat menghasilkan susu yang paling sihat dari semua berbanding dengan susu penggembala dataran rendah dari penggembala ketinggian tinggi (3700-6200 kaki) mempunyai lebih banyak asid lemak omega-3 dan CLA dan lemak tepu yang jauh lebih sedikit . Kerana Tumbuhan yang tumbuh di ketinggian lebih tinggi mempunyai lebih banyak asid lemak omega-3 yang padat pada suhu yang lebih rendah daripada lemak lain dan oleh itu bertindak sebagai bentuk anti-pembekuan. Lembu merumput padang rumput yang diperkaya ini dan memberikan nutrien ke susu mereka (10).

Merumput daging lembu mengarah ke padang rumput atau meningkatkan jumlah makanan ternakan (rumput atau rumput kering) dalam diet telah terbukti meningkatkan kandungan CLA dalam lemak lembu. Tambahan makanan bijirin tinggi dari sapi lembu dengan minyak (mis. Minyak kacang kedelai, minyak biji rami, dan minyak bunga matahari) juga dapat meningkatkan kandungan CLA daging lembu, makanan tinggi lemak seperti kacang soya meningkatkan CLA secara signifikan dalam susu lembu (11). Lemak daging lembu dari diet pengendali yang diberi makan atau diet yang sama ditambah dengan 2% atau 4% minyak kedelai, masing-masing, mengandungi 0.1, 1.2, atau 1%, trans-10, cis-12 CLA, masing-masing (11). CLA dalam daging stabil dalam keadaan memasak dan penyimpanan biasa (3). Spesies haiwan yang berbeza mempunyai jumlah CLA yang berbeza seperti kuda mempunyai kandungan CLA terendah dan domba tertinggi. Susu manusia berada di tengah dan CLA yang terdapat dalam susu sama seperti susu mare & # 8217s susu & lsow & # 8217s susu & lt susu manusia & lt kambing & # 8217s susu & lt lembu & # 8217s susu & lt ewe & # 8217s susu (12).

CLA berlaku pada telur dan lemak ikan dan haiwan laut juga (Jadual 1). Selain produk haiwan butang putih Jamur (13) dan minyak biji delima (14) juga dilaporkan sebagai sumber makanan semula jadi CLA. Kepekatan rendah CLA juga telah dilaporkan dalam minyak sayuran (Jadual 1) dan formula bayi (15-16)

CLA disintesis secara endogen dengan dua laluan. Pada jalur pertama, biohidrogenasi asid lemak tak jenuh makanan yang berasal dari makanan ternakan seperti asid oleik dan asid lenoleat (LA) ditukar menjadi asid Stearat (17) oleh bakteria rumen (18). Pengantara yang dihasilkan semasa biohidrogenasi adalah cis -9, trans 11 (C18: 2) (isomer CLA utama dalam susu) dan trans 11 (C18: 1) asid vaksen trans. Perantaraan ini terkumpul dan diserap dalam usus dan dimasukkan ke dalam pelbagai tisu. Laluan kedua berlaku pada tisu adiposa dan kelenjar susu lembu menyusui oleh D9-desaturase (19). The trans-Δ11-asid vaksenik (t-VA), dihasilkan sebagai rantaian biohidrogenasi rumen dari kedua asid linoleat dan asid α-linolenat dan PUFA lain (20) menyediakan laluan alternatif utama untuk biosintesis CLA dalam sel mamalia, termasuk manusia, melalui desaturasi Δ9 oleh stearoyl-CoA desaturase (SCD). Kelenjar susu dan tisu adiposa ruminan mempunyai aktiviti D9-desaturase yang besar untuk melakukan keseluruhan proses (21-24). Dalam ruminansia aktiviti Δ9-desaturase tinggi dalam tisu adiposa haiwan yang sedang tumbuh, tisu susu dan tisu adiposa haiwan menyusui mRNA dan protein untuk enzim ini tidak dapat dielakkan di hati. Isomer CLA kedua yang paling lazim terdapat dalam lemak susu adalah trans-7, cis-9 dan ia berasal hampir secara eksklusif dari sintesis endogen yang melibatkan Δ9-desaturase dan trans-7 (C18: 1) dihasilkan di rumen.

Walaupun beberapa spesies bakteria dalam usus besar haiwan perut sederhana dapat mensintesis CLA (25) tetapi CLA yang terbentuk di usus besar tidak kemudian diserap. Selepas pembentukan di rumen cis-9, trans-11 CLA dapat diserap secara langsung dan dimetabolismekan lebih lanjut (biohidrogenasi) oleh mikroorganisma rumen menjadi asid trans-11-oktadecenoic. Asid trans-11-octadecenoic kemudian boleh ditukar menjadi cis-9, trans-11 CLA dalam sel mamalia (26-27) oleh stearoyl – CoA desaturase (SCD). Ini adalah jalan utama dalam pembentukan cis-9, trans-11 CLA dalam susu lembu (20, 28). Susu lembu juga mengandungi trans-10, cis-12 CLA, dan asid trans-10-octadecenoic juga (20).

Makanan tambahan CLA telah berkesan dalam mengurangkan peratusan lemak badan dan meningkatkan peratusan protein badan (29). Beberapa dalam-vivo kajian dengan tikus, babi dan lembu telah menunjukkan bahawa jumlah lemak badan berkurang ketika haiwan diberi makan dengan campuran dua isomer CLA dari sumber sintetik (5, 30-33), mungkin disebabkan oleh penghambatan percambahan adiposit oleh bio. -Bentuk CLA. CLA juga membantu mengurangkan leptin hormon yang berkaitan dengan kenaikan berat badan dan penyimpanan lemak (34). CLA menghalang barah dengan menyekat pertumbuhan dan penyebaran tumor metastatik. CLA segera menghalang tumor ganas dan jinak (35). Isomer 10-CLA nampaknya berfungsi lebih baik melalui modulasi apoptosis dan kawalan kitaran sel, sedangkan isomer 9-CLA mempengaruhi metabolisme asid arakidonat (36). Isomer CLA juga terbukti mempunyai kesan berubah-ubah terhadap pembentukan tulang (osteosintesis) dan penyerapan semula pada haiwan. Diet CLA menghalang penyerapan tulang eddosteal, meningkatkan pembentukan tulang endokortikal, dan memodulasi tindakan dan ekspresi enzim COX, sehingga menurunkan resorpsi tulang yang bergantung pada prostaglandin (37-38).

Oleh kerana CLA boleh mempengaruhi sitokin keradangan, maka dihipotesiskan bahawa CLA boleh menjadi alat yang baik untuk pencegahan atau pengurangan gejala rheumatoid arthritis pada manusia (39). CLA adalah asid lemak diet anti-aterogenik yang kuat pada model haiwan aterosklerosis dengan mengaktifkan PPAR (40-41). CLA sangat membantu dalam pengurusan diabetes dan kawalan glisemik, terutama diabetes jenis II. Banyak kajian menunjukkan bahawa isomer 10-CLA mungkin merupakan isomer bioaktif CLA untuk mempengaruhi perubahan berat badan yang diperhatikan pada subjek dengan diabetes tipe II, campuran CLA (9- dan 10-CLA) daripada tunggal boleh lebih bermanfaat. untuk pengurusan ketahanan insulin (42). Walau bagaimanapun kajian manusia tidak menunjukkan kesan ini.

CLA dapat mengubah pertumbuhan sel neoplastik dengan mempengaruhi replikasi sel, mengganggu komponen kitaran sel, atau meningkatkan kematian sel dengan mempromosikan nekrosis atau / dan apoptosis. Nekrosis umumnya disebabkan oleh reaksi penghinaan atau ketoksikan dan mencetuskan keradangan, sedangkan apoptosis adalah tenaga yang berbeza yang memerlukan proses kematian sel yang diprogramkan, yang dicirikan oleh pemecahan DNA, pemeluwapan kromosom, pemecahan nuklear, pembentukan badan apoptotik, dan pembalikan fosfatidilserin dalam membran plasma. CLA dapat mengurangkan percambahan sel dengan menyekat sintesis DNA (43) dan protein kitaran sel (31, 44) yang mengatur proses ini dan dapat menyokong peningkatan apoptosis terutamanya dengan menekan ekspresi gen bcl-2 antiapoptosis (45). Dengan garis sel yang berbeza, CLA dapat meningkatkan IL-2 dan IFN-γ melalui modulasi aktiviti protein kinase dan pengeluaran spesies oksidan, yang secara signifikan menghalang percambahan (46). Oleh itu, CLA mempunyai manfaat kesihatan yang berpotensi dan dapat digunakan sebagai pencegahan dan rawatan banyak keadaan patogen, kami di sini akan menekankan hanya pada kesan imunomodulator CLA.

Sistem imun memainkan peranan penting untuk kesihatan dan kesejahteraan yang baik. Ia melindungi tubuh daripada bahan yang berpotensi berbahaya dengan mengenali dan bertindak balas terhadap antigen. Antigen boleh hidup dan bukan hidup. Antigen hidup adalah molekul (biasanya protein) di permukaan sel, virus, kulat, atau bakteria. Bahan yang tidak hidup adalah racun, bahan kimia, ubat-ubatan, dan zarah asing (seperti serpihan). Sistem kekebalan tubuh mengenali dan memusnahkan bahan yang mengandungi antigen ini. Protein sel badan juga bertindak sebagai antigen dan disebut antigen HLA. Antigen HLA ditemui dalam jumlah besar di permukaan sel darah putih. Mereka membantu sistem kekebalan tubuh untuk mengenali perbezaan antara tisu badan dan bahan asing. Terdapat dua jenis kekebalan yang berkait rapat yang terdapat dalam sistem pertahanan manusia, kekebalan semula jadi atau tidak spesifik dan imuniti adaptif. Kekebalan yang semula jadi, atau tidak spesifik, adalah sistem pertahanan dengan mana seseorang dilahirkan. Ia melindungi dari semua antigen melalui penghalang yang mencegah bahan berbahaya masuk ke dalam badan. Halangan ini membentuk barisan pertahanan pertama dalam tindak balas imun (47-48). Ini termasuk refleks batuk, enzim dalam air mata dan minyak kulit, lendir, yang memerangkap bakteria dan zarah kecil, kulit, asid perut dan pengecaman corak luas yang membawa kepada fagositosis dan pembunuhan ekstraselular agen penyerang. Sel-sel tindak balas imun semula jadi seperti monosit atau makrofag dan sel pembunuh semula jadi mengeluarkan sitokin (TNF-_, IL-1, dan IL-6), prostaglandin, dan leukotrien pada awal tindak balas imun yang tidak spesifik dan dikaitkan dengan reaksi keradangan. Prostaglandin mempunyai kesan tempatan dan terutama berlaku pada tisu di mana ia disintesis.

Jenis imuniti lain diperoleh atau imuniti adaptif berkembang dengan terdedah kepada pelbagai antigen. Sistem kekebalan tubuh membina pertahanan yang khusus untuk antigen itu. Sistem kekebalan adaptif terdiri daripada limfosit B dan T, yang menimbulkan kesan atau fungsi mereka dengan cara khusus antigen. Perkembangan sel efektor didorong oleh tindakan sel pembantu T, yang dapat dibahagikan berdasarkan sitokin yang dihasilkannya menjadi Th1 (interferon-_ (IFN-), interleukin 2 (IL- 2)] dan Th2 (IL- Sel 4, IL-5, IL-10) Setelah rangsangan antigenik, subset limfosit menjadi sel memori, yang dapat menimbulkan tindak balas imun yang lebih cepat dan kuat pada pendedahan berikutnya dengan antigen yang sama (47). Limfosit dan sel pembunuh semula jadi berasal dari sel stem hemopoietik yang tidak dibezakan dan diperbaharui sendiri melalui proses pembezaan dan pematangan yang sangat terkawal.Proses ini dimediasi oleh faktor persekitaran mikro, termasuk interaksi sel ke sel, sitokin, dan faktor pertumbuhan (48-49).

Pengaruh CLA terhadap Pembezaan Thimosit

CLA boleh mempengaruhi laluan kritikal pembezaan thymocyte. Thermocytes adalah sel progenitor hematopoetik yang terdapat dalam timus. Berkenaan dengan kesan CLA pada pengembangan sel imun, analisis fenotipik subset sel T pada timus dan darah periferal mendedahkan bahawa CLA bertindak pertama pada thymocytes yang belum matang (iaitu, hari ke-35 suplemen makanan) dan kemudian dimodulasi sel T darah periferal matang ( iaitu hari 49 hingga 72 makanan tambahan) dalam model babi (50).

Tindak Balas Bawaan CLA

CLA dalam diet haiwan mempengaruhi mekanisme yang berkaitan dengan imun yang terlibat dalam reaksi alahan dan jangkitan (51). O'Shea et al (51) melaporkan bahawa penurunan pengeluaran leukotriena dan prostaglandin pada organ dari haiwan yang diberi makan CLA. Leukotrienes memediasi banyak fenomena keradangan yang merupakan ciri reaksi hipersensitiviti segera seperti kesan langsung pada sel otot licin dan saluran darah yang menyumbang kepada pengambilan sel-sel keradangan. Kesan CLA pada aspek tindak balas bawaan terhadap jangkitan virus seperti peningkatan berat organ ketika melihat jangkitan kerana peningkatan pengeluaran dan pengambilan sel-sel inflamasi ditambah dengan pengurangan zarah virus pada haiwan yang diberi makan CLA menunjukkan penurunan kesan yang disebabkan oleh jangkitan influenza.

Kesan CLA terhadap Kekebalan Adaptif

CLA dapat memodulasi imuniti bawaan dan adaptif (52). Didokumentasikan dengan baik bahawa CLA meningkatkan tindak balas imun tertentu sambil mengurangkan kesan buruk katabolisme yang dimediasi oleh imun (53-54). Diet CLA telah terbukti dapat meningkatkan pengeluaran imunoglobulin pada limfosit limpa tikus (55) dan untuk mengurangkan histamin yang disebabkan antigen dan pelepasan PGE2 dari trakea babi guinea yang peka (55). Peranan tepat isomer CLA individu dalam kesan ini belum diketahui, tetapi telah dilaporkan bahawa trans-10, cis-12 CLA meningkatkan percambahan limfosit in vitro (56).

CLA meningkatkan fungsi imun secara in-vitro dan dalam-vivo syarat. O'Shea, et al (57) menyiasat potensi CLA untuk memodulasi tindak balas imun humoral dan sel yang dimediasi sel dalam sistem imun manusia menggunakan dua isomer utama dalam nisbah yang berbeza (50:50 dan 80:20 dari cis-9, trans-11 dan trans-10, cis-12 CLA, masing-masing). Vaksinasi hepatitis B (Hbs) digunakan sebagai model infeksi untuk menyelidiki tindak balas imun humoral dan sel yang dimediasi sel. Titik antibodi hepatitis B dinilai untuk setiap subjek pada hari 0 dan 2 minggu selepas vaksinasi awal dan penggalak terakhir. Purata kepekatan antibodi serum Hbs pada hari ke 85 adalah dua kali lebih tinggi untuk subjek yang menggunakan CLA 50:50 berbanding dengan kumpulan kawalan atau kumpulan 80:20. Kadar seroproteksi (SPR, iaitu jumlah subjek dengan kepekatan anti-Hbs & gt10 IU / L berbanding dengan jumlah subjek dengan tajuk & lt10 IU / L) jauh lebih tinggi (P & gt0.05) untuk kumpulan 50:50 berbanding dengan kawalan atau kumpulan 80:20.

Tindak balas imun yang dimediasi sel diukur menggunakan ujian multi CMI untuk Hipersensitiviti Jenis Tertunda (DTH). Penilaian tindak balas DTH pada 7 antigen ingat, pada titik masa yang berbeza menunjukkan tidak ada perbezaan yang signifikan secara statistik dalam semua kumpulan. Sugano et al (58) diperhatikan peningkatan kepekatan IgA, IgG, dan IgM dan penurunan kepekatan IgE dalam serum tikus berusia 7 minggu yang diberi campuran 1% CLA (50:50 isomer), mungkin disebabkan oleh pergeseran ke arah Th -1 profil sitokin di. Kesan yang serupa pada manusia selepas suplementasi dengan campuran isomer CLA 50:50 selama 12 minggu diperhatikan oleh Song et al (59). Tambahan CLA juga menurunkan tahap sitokin proinflamasi, TNF-alpha dan IL-1beta (P & lt 0.05), tetapi meningkatkan tahap sitokin anti-radang, IL-10 (P & lt 0.05). Aspek lain fungsi imun, tindak balas hipersensitiviti jenis tertunda (DTH), menurun semasa dan selepas suplemen CLA (P & lt0,05). Walau bagaimanapun, hasil glukosa plasma, lipid, fenotipik limfosit tidak banyak dipengaruhi oleh CLA (59). Hayek et al (60) memerhatikan bahawa CLA diet meningkat in-vitro Fungsi sel T tetapi tidak memberi kesan dalam-vivo Fungsi yang dimediasi sel T seperti yang diukur oleh reaksi kulit DTH atau aktiviti sel B dan NK. Kesan imunostimulasi lebih ketara pada tikus muda daripada pada tikus tua dan tidak dimediasi melalui perubahan dalam pengeluaran PGE2 atau IL-1.

Walau bagaimanapun, Yamasaki et al (55) tidak menemui kesan yang signifikan terhadap kepekatan serum IgA, IgG, atau IgM setelah memberi makan tikus berusia 50 -50 minggu campuran isomer 50:50 selama 3 minggu pada dos antara 0,05% hingga 0,5%. Kajian yang dilakukan pada spesies lain semasa kehamilan dan penyusuan telah melaporkan peningkatan kepekatan IgG serum (61), fakta yang menyokong kesan peningkatan humor CLA pada usia dini. Mekanisme khusus dengan mana CLA meningkatkan tahap IgA di tempat mukosa tetap tidak diketahui. Tetapi sejak CLA terbukti dapat menekan pengeluaran IL-4 in-vitro (61), mengurangkan tindak balas Th2 pada binatang yang dicabar dan mengatur fungsi bilangan dan efektor beberapa limfosit (50), CLA memodulasi kesan TGFb terhadap pengeluaran IgA, mungkin disebabkan oleh peraturan pasca transkrip dan / atau terjemahan, yang penting dalam sitokin ini, kerana telah dinyatakan bahawa tahap mRNA TGFb tidak sepenuhnya berkaitan dengan kuantiti protein yang dihasilkan (62). Sebaliknya, peningkatan IgA akibat suplemen CLA mungkin tidak bergantung pada mekanisme pensuisan isotip yang dihasilkan oleh TGFb, yang telah dijelaskan, tetapi tidak sepenuhnya ditentukan (63).

Mekanisme Imun CLA

Kesan imunologi CLA tidak diketahui. Beberapa kajian menunjukkan bahawa ia mungkin disebabkan oleh sifat antioksidan CLA, yang ditunjukkan dalam sistem bebas sel (64), mikrosom hati (65) dan pada kelenjar susu (66). Dikatakan bahawa CLA mungkin merupakan antioksidan yang lebih kuat daripada α-tokoferol dan hampir sama berkesannya dengan butilasi hidroksitoluena (BHT) (64, 67).

Dua hipotesis utama untuk menjelaskan kesan peningkatan imuno CLA diet telah dikemukakan. Yang pertama ialah CLA berinteraksi dengan reseptor aktif proliferator peroksisom (PARS). PPAR (α, β, γ dan δ) adalah reseptor nuklear yang menerjemahkan rangsangan pemakanan dan / atau farmakologi menjadi perubahan dalam ekspresi gen (68) dan ia mempunyai peranan penting dalam rangsangan tindak balas IgA di laman mukosa (69). mekanisme di mana CLA meningkatkan tahap IgA di tempat mukosa tidak diketahui, tetapi kerana CLA telah ditunjukkan menekan pengeluaran IL-4 secara in-vitro (70), mengurangkan tindak balas Th2 pada haiwan yang dicabar (71) dan mengatur bilangan dan faktor fungsi beberapa limfosit (50). PPAR mengikat reseptor PPAR dan menekan atau mendorong transkripsi gen sasaran. Perubahan ekspresi gen menunjukkan kesan dalam pelbagai jalur metabolik sel seperti lipid, karbohidrat dan metabolisme tenaga dalam sel imun dan bukan imun (72). Isomer CLA adalah modulator PPAR aktif (73-74). Reseptor ini meningkatkan tindak balas imun dan mengatur ekspresi gen. Agonis PPAR-γ sintetik menghalang sitokin proinflamasi yang mempengaruhi pembezaan monosit dan makrofag (75).

PPAR-γ terdiri daripada dua isoform, PPAR-γ 1 dan PPAR-γ 2. Kedua-duanya dinyatakan dalam adiposit, tetapi PPAR-γ 1 dinyatakan dalam sel T dan B, monosit, sel dendritik, dan sel epitelium (76). Terdapat beberapa kemungkinan pilihan yang boleh digunakan oleh CLA. Ponferrada et al (77) melaporkan bahawa agonis PPAR-γ dapat mengembalikan penurunan pengeluaran IgA yang disebabkan oleh tekanan pada mukosa usus besar, bahkan melebihi kepekatan basal yang dikawal IgA. PPAR-γ yang dijangkiti bertindak melalui modulasi faktor transkripsi seperti NF-kB, AP1, dan STAT1 (78), yang terlibat dalam proses pengawalseliaan sel-B. Hubungan rapat antara interaksi mikroba usus dan peraturan ekspresi PPAR-γ dengan sel epitelium tisu usus besar (79). CLA mungkin memodulasi kemasukan antigen luminal, kapasitas untuk penyajian antigen langsung, atau bahkan penularan antigen ke sel dendritik dari mukosa usus. Hipotesis ini disokong oleh fakta bahawa imunogenisiti sel dendritik diatur oleh suplemen makanan PPAR-γ CLA dengan CLA meningkatkan pertahanan imun usus tikus Wistar semasa peringkat pertama kehidupan (menyusu dan diperluas hingga awal bayi) (61). Peningkatan bergantung kepada CLA tindak balas imun mukosa humoral ditunjukkan oleh peningkatan ekspresi IgA usus pada tikus berusia 28 hari yang diberi makan CLA selama 4 minggu semasa awal hidup. Kesan CLA lebih ketara dengan pengambilan makanan CLA yang lebih awal dan lebih lama.

Kedua CLA dapat mengubah mediator imuniti seperti eicosanoid, prostaglandin, sitokin, dan imunoglobulin (51, 80-81). CLA boleh bertindak sebahagiannya dengan bersaing dengan asid linoleat dalam biosintesis asid arakidonik (82). Masak et al (52) menunjukkan bahawa memberi makan anak ayam diet yang mengandung 0,5% CLA secara signifikan menurunkan kadar asam arakidonat. Belury dan Kempa-Steczko (83) juga menunjukkan bahawa memberi makan tikus 0.5, 1.0 dan 1.5% CLA mengakibatkan penurunan kadar asid arakidonat Asid arakidonat adalah pendahulu bagi PGE2 dengan demikian, peningkatan pengambilan CLA dapat menurunkan pengeluaran PGE2 dan kesan penekanan terhadap pengeluaran IL-2 dan percambahan sel T (68, 84). In-vitro dan in- vivo kajian dalam pelbagai model haiwan menunjukkan bahawa CLA mempengaruhi pengeluaran sitokin dan prostaglandin, yang dapat mempengaruhi tindak balas keradangan (80).

Pada haiwan eksperimen, CLA terbukti memodulasi sistem imun dan mencegah pembaziran akibat imun (51) serta pembaziran akibat barah (85). Beberapa kajian pada manusia menunjukkan kesan CLA yang berpotensi bermanfaat pada fungsi imun (81). Percubaan terkawal secara rawak pada 28 orang dewasa yang sihat menunjukkan bahawa 3g / hari CLA (isomer campuran) diberi makan selama 12 minggu, meningkatkan imuniti yang dimediasi sel yang membolehkan tubuh melawan virus, bakteria, kulat, dan tumor (59). Peningkatan fungsi imun yang lain dengan suplemen CLA menunjukkan bahawa CLA mampu mengurangkan tindak balas keradangan dan juga reaksi alahan (59). Mekanisme utama untuk modulasi imun adalah keupayaan antioksidan berganda yang dapat mengurangkan kesan buruk spesies oksigen reaktif dan radikal bebas, menyebabkan kematian sel-sel imun pramatang (86). CLA dapat meningkatkan kepekatan enzim intraselular dan akibatnya untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh.

CLA juga mempunyai kemampuan untuk meningkatkan jumlah GSH (GSH + GSSG) dan ekspresi protein gamma-glutamylcysteine ​​ligase (gammaGCL) dan dikaitkan dengan penghambatan tanda-tanda patologi khas pada tikus. Glutathione (GSH) sering disebut sebagai badan & antioksidan utama, disintesis secara endogen ke seluruh badan dan boleh didapati di hampir setiap sel tubuh manusia. Glutathione juga penting dalam detoksifikasi xenobiotik elektrofilik, modulasi transduksi isyarat redoks, penyimpanan dan pengangkutan sistein, regulasi percambahan sel, sintesis sintesis deoksiribonukleotida, pengaturan tindak balas imun, dan regulasi metabolisme leukotriena dan prostaglandin (87). Bergamo, et al (88) mengkaji kesan CLA terhadap status antioksidan pada tikus hamil. Tahap kapasiti antioksidan setara GSH dan Trolox (TEAC) yang lebih tinggi secara signifikan diukur dalam serum empangan yang dirawat CLA (dan anak anjingnya), berbanding dengan kawalan. Homeostasis GSH memainkan peranan penting dalam rawatan penyakit di mana sitokin adalah peserta utama dalam patofisiologi mereka (89).


BAHAN DAN KAEDAH

Deoxyuridine triphosphates berlabel dengan pelbagai analog fluorophore Cy3 dan Cy5

Struktur kimia dan sifat optik lapan deoksiuridin trifosfat dilabelkan dengan analog fluorofor Cy3 dan Cy5 diringkaskan dalam Jadual & # x200B Jadual1. 1. Kaedah yang digunakan dalam sintesis dijelaskan sebahagiannya sebelumnya (17). Prosedur sintetik terperinci dan ciri spektroskopi, termasuk data mengenai perantaraan, disediakan dalam Data Tambahan (Bahagian A: Skema Reaksi Nukleosida Trifosfat yang Diubah dan Bahagian B: Prosedur dan Data Spektroskopi). Amersham Cy3-dUTP dan Amersham Cy5-dUTP dibeli dari GE Healthcare (Little Chalfont, UK).

Jadual 1.

Oligodeoxyribonucleotides, PCR, peluasan primer dan tambahan nukleotida tambahan pada ujung 3 & # x02032 serpihan DNA

Urutan oligonukleotida yang disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1 dipilih untuk mengurangkan pembentukan struktur jepit rambut. Struktur jepit rambut yang mungkin dikira menggunakan pelayan web hibridisasi asid nukleik DI dan ramalan lebur (http://unafold.rna.albany.edu). Prosedur sintetik dan analisis terperinci disediakan dalam data Tambahan (Bahagian C: Oligodeoxyribonucleotides, Jadual Tambahan S1 dan 2).

Penerangan terperinci mengenai PCR, tindak balas peluasan primer dan penambahan nukleotida tambahan ke ujung 3 & # x02032 serpihan DNA terdapat dalam Data Tambahan (Bahagian D: PCR, pelanjutan primer dan tambahan nukleotida tambahan pada ujung 3 & # x02032 serpihan DNA).

Pemerolehan elektroforesis dan gel

Sebelum dimuatkan pada gel denaturasi 20% poliakrilamida untuk elektroforesis, sampel dilucutkan dan disucikan dari kelebihan dNTPs dan dilabelkan dUTP pada lajur penapisan gel Sephadex G25 Superfine (Pharmacia, Sweden volume 1 ml, panjang 50 mm). Tiang dicuci dengan air Milli-Q menggunakan pam peristaltik pada kelajuan 1 mm 3 sesaat. Contoh elusi dipantau dengan sensor pancaran sinar 2 UV Pharmacia Dual Path Monitor (Pharmacia, Sweden). Sampel yang dielusi dikira semula dalam 10 jilid 2% LiClO4 dalam aseton, dicairkan dalam 5 & # x003bcl 7 & # x0041c urea dan kemudian dimuat ke dalam telaga gel.

Elektroforesis dilakukan dalam denaturasi gel poliakrilamida 20% (19: 1 (b / b) akrilamida / bis-akrilamida, 7 M urea 600 V termostabilisasi 15 & # x000d7 sandwic kaca 15 cm dengan penampan TBE ketebalan gel 1 mm (89 mM Tris-borat dan asid etilenediaminetetraasetik 2 mM, pH 8.3)).

Selepas elektroforesis, gambar gel diperoleh menggunakan gel Imager pendarfluor penyelidikan dengan medan gambar 15 & # x000d7 15 cm yang dilengkapi dengan kamera RTE / CCD-1536-K / 1 CCD (Roper Scientific, Sarasota, FL, USA) dan lampu merkuri. Fluoresensi dicatatkan dalam julat pewarna Cy3 menggunakan pasangan penapis 535DF35 dan 580DF27, dalam julat pewarna Cy5 menggunakan pasangan penapis 630DF30 dan 690DF40, dan dalam julat pewarna isotiosianat fluorescein (FITC) menggunakan 470DF40 dan 535DF35 pasangan penapis. Dalam spektrum luas pewarna Cy3 dan Cy5, pendarfluor direkodkan menggunakan pasangan penapis 535DF35 dan 690DF40. Selain itu, visualisasi pita oligonukleotida dalam gel poliakrilamida dilakukan menggunakan kepingan aluminium yang dilapisi dengan TLC Silica gel 60 F254 (Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) sebagai sokongan gel, transilluminator TCP-20 LC dengan panjang gelombang pengujaan 254 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vall & # x000e9e, Perancis) sebagai sumber UV dan penapis 470DF40 untuk pemerhatian . Semua penapis dibeli dari Omega Optical, Brattleboro, VT, USA. Mikroskop dilengkapi dengan komputer yang menjalankan perisian ImaGel Research (18,19).

Analisis kuantitatif jalur elektroforetik yang mengandungi serpihan DNA panjang penuh yang diperkuat PCR

Kuantiti relatif kepingan DNA panjang penuh yang diperkuat PCR yang mengandungi dUMP yang berlabel analog pewarna Cy5 dianggap sebanding dengan intensiti pendarfluor relatif primer berlabel Cy3. Kuantiti ini dikira secara berasingan untuk setiap lorong 3 & # x020138 pada Gambar & # x200B Gambar1A & # x000a0 (Hasil 1A & # x000a0 (Bahagian Hasil dan Perbincangan). Untuk tujuan ini, intensiti pendarfluor Cy3 penjumlahan dari jalur atas di setiap lorong 3𠄸 in Figure ​ Figure1A 1A (relative to the level of the doublet band in lane 2) that arose due to the incorporation of dUMPs labelled with the rather heavy Cy5 dye analogues were quantified using virtual rectangular frames that surrounded the upper bands . The fluorescence intensities of all the pixels surrounded by the frame were summed to obtain the fluorescence intensity within the frame. The fluorescence intensities of the blank gel regions within the same frames were then subtracted from the obtained values. The obtained quantities were normalized to the fluorescence intensity of the full-length DNA in lane 2 in Figure ​ Figure1A, 1A , which contained only natural nucleotides.

Effect of the charge of dUTP-conjugated Cy3 and Cy5 analogues on PCR performed by Taq polymerase using a 68-nt M0 template that contained varying numbers of consecutive adenine nucleotides: a single A, an AA doublet and an AAA triplet (Supplementary Table S1). (A dan B) Electrophoretic separation of PCR products obtained in the presence of dNTPs and 5% fluorescently labelled dUTPs. (Table ​ (Table1, 1 , Supplementary Schemes S1𠄳 and Table S2). The experiment shown in A and B was performed two times. Lane 1: P1-(Cy3a−) and P2-(Cy3a−) primers lane 2: PCR products prepared using natural nucleoside triphosphates and P1-(Cy3a−) and P2-(Cy3a−) primers lanes 3𠄸: PCR products obtained after the addition of 5% dU(Cy5a+)TP, dU(Cy5a1±)TP, dU(Cy5a2±)TP, dU(Cy5a3±)TP, dU(Cy5a−)TP or Amersham Cy5-dUTP, respectively. Lane 9: PCR products prepared using natural nucleoside triphosphates and P1-(Cy5a−) and P2-(Cy5a−) primers lanes 10�: PCR products obtained after the addition of 5% dU(Cy3a+)TP, dU(Cy3a1±)TP, dU(Cy3a−)TP or Amersham Cy3-dUTP, respectively. Lane 14: P1-(Cy5a−) and P2-(Cy5a−) primers. (C) Histogram of the relative quantities (grey columns) of PCR-amplified full-length DNA fragments containing fluorescently labelled dUMPs and normalized fluorescence signals characterizing the brightness of these incorporated dUMPs (see also Supplementary Table S3). The brightness of incorporated dUMPs in the Cy3 and Cy5 ranges are shown in blue and orange, respectively. The values averaged over the two experiments are shown. The bars indicate the absolute deviations.

The same quantitative analysis was performed for lanes 9� in the Cy5 fluorescence range (Figure ​ (Figure1B) 1B ) to separately estimate the relative quantities of synthesized full-length DNA fragments containing dUMPs labelled with Cy3 dye analogues. The corresponding values characterizing the efficiency of the enzymatic incorporation of dUMPs labelled with Cy3 or Cy5 dye analogues are shown in Supplementary Table S3 and are also plotted in the histogram in Figure ​ Figure1C 1C (grey columns).

Additionally, the normalized fluorescence intensities characterizing the brightness of incorporated dUMPs labelled with Cy3 and Cy5 dye analogues were calculated in the Cy3 (lanes 10�, Figure ​ Figure1A) 1A ) and Cy5 (lanes 3𠄸, Figure ​ Figure1B) 1B ) fluorescence ranges, respectively. For this purpose, the Cy3 fluorescence intensities of the bands containing full-length DNA products in each of lanes 10� (Figure ​ (Figure1A) 1A ) were summarized using the virtual rectangular frames surrounding the bands (the fluorescence intensities of the blank gel regions within the same frames were subtracted from the obtained values). In a similar manner, the summed Cy5 fluorescence intensities of the bands containing full-length DNA products in each of lanes 3𠄸 (Figure ​ (Figure1B) 1B ) were calculated. The obtained two sets of fluorescence intensities were normalized to their maximum values (separately for the Cy3 and Cy5 fluorescence ranges) and plotted in the histogram shown in Figure ​ Figure1C 1C (blue and orange columns, respectively).

Quantitative analysis of electrophoretic bands containing full-length DNA fragments obtained during primer extension

To estimate the relative quantities of the full-length products of primer extensions in Figures ​ Figures2 2 and  3 and Supplementary Figure S1, we calculated the fluorescence intensity of each analysed band in the fluorescence range of the labelled primer using a virtual rectangular frame surrounding the band (Results and Discussion section). Fluorescence intensities of all the pixels surrounded by the frame were summed to obtain the fluorescence intensity within the frame. The fluorescence intensity of a blank gel region within the same frame was then subtracted from the obtained value. The obtained fluorescence signals of the analysed bands within each gel image were normalized to the fluorescence intensity of the band containing the full-length natural product of primer extension. Within each gel image in Supplementary Figure S14, the results were normalized to the full-length natural product of primer extension obtained in the presence of dATP, dGTP and dCTP.

Incorporation of deoxyuridines labelled with Cy3 fluorophore analogues carrying positive, neutral or negative charges by Taq polymerase in a P1-(Cy5a−) primer extension reaction using the M1 template. (A) Primer extension reaction scheme. (B dan C) Electrophoretic separation of primer extension products obtained in the presence of dTTP, dU(Cy3a+)TP, dU(Cy3a1±)TP and dU(Cy3a−)TP. The experiment shown in B and C was performed two times. Lane 1: P1-(Cy5a−) primer lane 2: reaction products prepared using natural nucleoside triphosphates. Lanes 3𠄶, 7� and 11�: reaction products prepared using dATP, dCTP, dGTP, increasing amounts of modified dUTPs (10, 50, 90 and 100%) and the corresponding decreasing amounts of dTTP (90, 50, 10 and 0%). Lanes 3𠄶: dU(Cy3a+)TP, lanes 7�: dU(Cy3a1±)TP and lanes 11�: dU(Cy3a−)TP.

Incorporation of deoxyuridines labelled with Cy5 fluorophore analogues carrying positive, neutral or negative charges by Taq polymerase in a P1-(Cy3a−) primer extension reaction using the M1 template. (A) Primer extension reaction scheme. (B dan C) Electrophoretic separation of primer extension products obtained in the presence of dTTP, dU(Cy5a+)MP, dU(Cy5a1±)MP and dU(Cy5a−)MP. The experiment shown in B and C was performed two times. Lane 1: P1-(Cy3a−) primer lane 2: reaction products prepared using natural nucleoside triphosphates. Lanes 3𠄶, 7� and 11�: reaction products prepared using dATP, dCTP, dGTP, increasing amounts of modified dUTPs (10, 50, 90 and 100%) and the corresponding decreasing amounts of dTTP (90, 50, 10 and 0%). Lanes 3𠄶: dU(Cy5a+)TP, lanes 7�: dU(Cy5a1±)TP and lanes 11�: dU(Cy5a−)TP. (D dan E) Electrophoretic separation of primer extension products obtained in the presence of dTTP, dU(Cy5a1±)TP and Amersham Cy5-dUMP. The experiment shown in D and E was performed two times. Lane 1: P1-(Cy3a−) primer lane 2: reaction products prepared using natural nucleoside triphosphates. Lanes 3𠄶 and 7�: reaction products prepared using dATP, dCTP, dGTP, increasing amounts of modified dUTPs (10, 50, 90 and 100%) and the corresponding decreasing amounts of dTTP (90, 50, 10 and 0%). Lanes 3𠄶: dU(Cy5a1±)TP and lanes 7�: Amersham Cy5-dUTP.

Within each gel image in each of the remaining quantitatively analysed figures (Figure ​ (Figure6 6 and Supplementary Figures S2, 6, 8, 9 and 11), the fluorescence signals were obtained in the same way and normalized to the maximum value.

Determining the Michaelis–Menten constants (Km) and the maximum substrate incorporation rates (Vmaks) for dTMP and dU(Cy5a1±)MP incorporation by Taq polymerase. (AC) Primer extension reaction schemes. (Dsaya) Electrophoretic separation of the reaction products. Lane 1: P1-(Cy3a−) primer. Lane 2: products of a 40-min reaction in the presence of dATP, dCTP and dGTP (5 × 10 𢄤 M each) 5 × 10 𢄦 M M2 (D and G), M11 (E and H) or M12 (F and I) template 5 × 10 𢄦 M P1-(Cy3a−) primer and 1.5 units of Taq polymerase. D and G: lanes 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15—the same mixture as for lane 2 with an increasing concentration of dTTP: 5 × 10 𢄨 , 5 × 10 𢄧 , 10 𢄦 , 5 × 10 𢄦 , 2.5 × 10 𢄥 , 5 × 10 𢄥 and 5 × 10 𢄤 M, respectively. E, F, H and I: lanes 3, 5, 7, 9, 11 and 13—the same mixture as for lane 2 with an increasing concentration of dTTP: 5 × 10 𢄨 , 5 × 10 𢄧 , 10 𢄦 , 5 × 10 𢄦 , 5 × 10 𢄥 and 5 × 10 𢄤 M, respectively. D and G: lanes 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16—the same mixture as for lane 2 with an increasing concentration of dU(Cy5a1±)TP: 5 × 10 𢄨 , 5 × 10 𢄧 , 10 𢄦 , 5 × 10 𢄦 , 2.5 × 10 𢄥 , 5 × 10 𢄥 and 5 × 10 𢄤 M, respectively. E, F, H and I: lanes 4, 6, 8, 10, 12 and 14—the same mixture as for lane 2 with an increasing concentration of dU(Cy5a1±)TP: 5 × 10 𢄨 , 5 × 10 𢄧 , 10 𢄦 , 5 × 10 𢄦 , 5 × 10 𢄥 and 5 × 10 𢄤 M, respectively. Lane 17 in D and lane 15 in E and F contained the reaction products obtained in 2-h primer extension reactions in the presence of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (5 × 10 𢄤 M each) 5 × 10 𢄦 M M2 (D), M11 (E) or M12 (F) template 5 × 10 𢄦 M P1-(Cy3a−) primer and 15 units of Taq polymerase. The experiments shown in the figure were performed two times. A quantitative analysis of the gel images shown in the figure is presented in Figure ​ Figure7 7 .

The fluorescence intensities characterizing the brightness of incorporated dUMPs labelled with Cy3 and Cy5 dye analogues were also similarly calculated in the Cy3 and Cy5 fluorescence ranges, respectively. Values were normalized to the maximum value.

Spektrometri jisim

The details of mass spectroscopic analysis are provided in the Supplementary data (Part E: Mass spectrometry).

Michaelis–Menten kinetics measurements

When measuring the kinetic parameters, including the Michaelis–Menten constant (Km), maximum substrate incorporation rate (Vmaks), and substrate incorporation rate at [S] = 5 × 10 𢄤 M (V([S] = 5 × 10 𢄤 M)), 1.5 units of Taq polymerase were added to the primer extension reaction mixtures. The dTTP, dU(Cy5a1±)TP, dU(Cy5a2±)TP, dU(Cy5a3±)TP, dU(Cy5a+)TP and dU(Cy5a−)TP concentrations were varied from 5 × 10 𢄨 M to 5 × 10 𢄤 M, and the reactions proceeded for 40 min (Figures ​ (Figures6 6 and  7 Supplementary Figures S9�). The other conditions were the same as described in the Primer extension and extra nucleotide addition to the 3′ ends of DNA fragments subsection of the Supplementary data (Part D: PCR, primer extension and extra nucleotide addition to the 3′ ends of DNA fragments).

Determination of Km dan Vmaks values characterizing the incorporation of dTMP and dU(Cy5a1±)MP by Taq polymerase. (AC) P1-(Cy3a−) primer extension reaction schemes. (DF) Plots of the incorporation rates, d[P]/dt, for one (D), two (E) and three (F) consecutively incorporated dTMP(s) (black circles and curves) as a function of dTTP concentration. (Gsaya) Plots of d[P]/dt for one (G), two (H) and three (I) consecutively incorporated dU(Cy5a1±)MP(s) (orange circles and curves) as a function of dU(Cy5a1±)TP concentration. The values averaged over the two experiments are shown. The bars indicate absolute deviations.

Each electrophoretic gel included a single lane containing the product of a control reaction. The control reaction mixture contained 15 units of Taq polymerase and 5 × 10 𢄤 M dTTP. In this case, the primer extension reaction proceeded for 2 h, until the entire primer was extended. The fluorescence signals from other full-length reaction products on the gel image were normalized to the fluorescence signal from abovementioned control reaction product.

Plots of the product synthesis rate, d[P]/dt, against substrate concentration, [S], were approximated by curves according to the Michaelis–Menten equation (20):

di mana Vmaks is the maximum substrate incorporation rate and Km is the Michaelis–Menten constant. The approximation was performed using OriginPro 8.6 software (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA), which provided estimations of the parameters Vmaks dan Km and the coefficient of determination, R 2 .

For dU(Cy5a1±)TP, dU(Cy5a2±)TP, dU(Cy5a3±)TP, dU(Cy5a+)TP and dU(Cy5a−)TP, the d[P]/dt values at a substrate concentration of 5 × 10 𢄤 M were five to ten times smaller than those obtained at substrate concentrations of 5 × 10 𢄦 − 5 × 10 𢄥 M. Therefore, 5 × 10 𢄤 M fluorescently labelled dUTPs greatly inhibited the reactions and the corresponding points were not considered in the approximations.


Kandungan

UTP also has the role of a source of energy or an activator of substrates in metabolic reactions, like that of ATP, but more specific. When UTP activates a substrate (like Glucose-1-phosphate), UDP-glucose is formed and inorganic phosphate is released. [5] UDP-glucose enters the synthesis of glycogen. UTP is used in the metabolism of galactose, where the activated form UDP-galactose is converted to UDP-glucose. UDP-glucuronate is used to conjugate bilirubin to a more water-soluble bilirubin diglucuronide. UTP is also used to activate amino sugars like Glucosamine-1-phosphate to UDP-glucosamine, and N-acetyl-glucosamine-1-phosphate to UDP-N-acetylglucosamine. [6]

UTP also has roles in mediating responses by extracellular binding to the P2Y receptors of cells. UTP and its derivatives are still being investigated for their applications in human medicine.

  1. ^ Meisenberg, Gerhard Meisenberg (2017). Principles of Medical Biochemistry. Philadelphia, PA, USA: Elsevier. hlm. 505. ISBN978-0-323-29616-8 .
  2. ^
  3. Victor, Rodwell (2015). Haper's illustrated Biochemistry. USA: McGraw-Hill. hlm. 118. ISBN978-0-07-182537-5 .
  4. ^
  5. Meisenberg, Gerhard Meisenberg (2017). Principles of MEDICAL BIOCHEMISTRY, 4th edition. Philadelphia, PA, USA: Elsevier. hlm. 59. ISBN978-0-323-29616-8 .
  6. ^ ab
  7. Voet, Donald (2011). Biochemistry, 4th edition. USA: JOHN WILEY & SONS, INC. p. 645. ISBN978-0470-57095-1 .
  8. ^
  9. Rodwell, Victor (2015). Harper's illustrated Biochemistry. USA: McGraw-Hill. hlm. 176. ISBN978-0-07-182537-5 .
  10. ^
  11. Rodwell, Victor (2015). Harper's illustrated biochemistry, 13th edition. USA: McGraw-Hill. hlm. 204. ISBN978-0-07-182537-5 .

This biochemistry article is a stub. Anda boleh membantu Wikipedia dengan mengembangkannya.


Monday, 19 April 2021

STPM Biology Biological Molecules Part 20 Osmotic, Turgor, Wall Pressure and Water Potential

  • When a solution is separated from pure water by semi-permeable membrane , there will be net water moving across into the solution.
  • The minimum pressure that has to be exerted by the solution to prevent water from moving in is called the osmotic pressure of the solution.

Osmotic pressure examples

  • Turgor pressure = the pressure of cytoplasm exerted against the walls of a turgid cell.
  • This pressure is counteracted by the wall pressure.
  • Wall pressure = the pressure of the cell wall exerted against the cytoplasm of the plant cell.
  • The wall pressure is also known as pressure potential (Ψ p) for plant cells.
  • Pressure potential usually has a positive value.

The relationship between turgor pressure and wall pressure

  • Water potential = the potential of water to move out of a solution by osmosis.
  • The water potential of a cell is the potential of water to move out of a cell through osmosis.
  • Symbol = (Ψ) Unit = kPa (kiloPascal 1kPa = 1000Pa) or MPa (MegaPascal), 1MPa = 100,000Pa)
  • Pure water has the highest water potential . The water potential of pure water is 0 kPa at atmosphere pressure (101325 kPa).
  • The water potential of a plant cell (Ψ) = solute potential (Ψ s) + pressure potential (Ψ p)

The water movement from a dilute to a concentrated solution

  • Solute potential = the potential of a solution to take in water by osmosis due to the presence of solute materials.
  • Solute potential is also known as osmotic potential .

Water Potential for Solution (Ψ sol)

  • (Ψ sol) = the potential of water to move out of a solution by osmosis .
  • The water potential of a solution is negative in value.
  • This is because water potential for pure water is 0 kPa and pure water has the highest water potential.
  • Solution with larger negative water potential value have low water potential.
  • For example, cell A with water potential of -0.5 kPa has higher water potential than cell B with water potential value of -0.9 kPa. Thus, water will flow from A to B.

The movement of water through different types of solution

STPM Biology Biological Molecules Part 19 Mineral Ions and Vitamins

  • Mineral ions and vitamins are generally needed in minute amounts.
  • Lack of them in diet can lead to a variety of disorders.
  • The importance of mineral ions and vitamins are shown in the tables below.

SPM Biology 4 Chemical Composition of the Cell Part 4 Organic Compounds in the Cell - Lipids

1. Contain carbon, hydrogen, oxygen .

2. Proportion of oxygen is lower than in carbohydrates. For example: stearic acid C18H36O2 .

3. Insoluble in water (non-polar molecule), but dissolve in other lipids and non-polar solvents (ether, ethanol, etc.).

4. Four main types of lipids:

  • Store large amount of energy
  • Sources of energy
  • A major part of the structure of cell membranes

Fats and Oils (triglycerides)

1. Fats are solid at room temperature (20ºC).

3. Triglyceride is formed from a condensation reaction between 1 molecule of glycerol and 3 molecules of fatty acids. The bonds formed are called ester bonds .

Formation of triglyceride

4. Fats often contain only saturated fatty acid (single bond).

5. Oils usually contain unsaturated fatty acid (double bond).

6. Importance of fats and oil:

  • Function as energy reserve & storage materials. They provide 38kJ per gram, while carbohydrates provide only 17kJ per gram.
  • Fats act as an insulator against the loss of heat.

Similarities and differences of saturated fat and unsaturated fat

1. Similar to triglycerides.

2. Produced by both plants & animals.

3. Usually hard solids at room temperature.

  • Used to waterproof the external surfaces of plants & animals. E.g: cuticle of leaf, protective covering on an insect’s body.
  • Also a constituent of the honeycomb of bees.
  • Major component of plasma membranes
  • Made up of 1 glycerol, 2 fatty acid and 1 phosphate

1. Complex ring structure . Do not contain fatty acids .

2. Occur in plants and animals.


BAHAN DAN KAEDAH

Polθ 3′ terminal extension activity

An amount of 200 nM Polθ (or other concentrations as indicated) was incubated with 50 nM of the indicated 5′ 32 P-labeled RNA or ssDNA at 37° (or other temperatures as noted) in the presence of 20 mM Tris–HCl pH 8.2, 0.01% NP-40, 0.1 mg/ml bovine serum albumin (BSA) and 10% glycerol. Figure ​ Figure1A 1A and  B contained either 2 mM MnCl2 or 2 mM MgCl2 as indicated. All other reactions contained 2 mM MnCl2. Twenty units of Ambion ™ RNase Inhibitor (Thermo-Scientific) was added to reactions containing RNA. An amount of 500 μM of either ribonucleoside triphosphates (NTPs) or deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) (or individual dNTP or NTPs as noted) was present in reactions as indicated. Nucleotide analogs were added at 100 µM. Reactions were terminated after 60 min (unless otherwise noted) by the addition of 25 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 45% formamide and were resolved by electrophoresis in 15% urea polyacrylamide gels, then visualized by phosphorimager or autoradiography. Percentage extension was determined by dividing the sum of the intensities of the extended product bands by the sum of the intensities of the extended and unextended bands. ImageJ was used to determine the intensities of individual bands.

Comparison of Polθ and TdT RNA 3′ terminal extension activities. (A dan B) Denaturing gels showing Polθ extension activity on DNA (A) and RNA (B) in the presence of the indicated dNTPs, NTPs and divalent cations. (C) Denaturing gels showing Polθ RNA 3′ terminal extension activity on the indicated substrates in the presence of Mn 2+ and dNTPs or NTPs. (D) Denaturing gel showing lack of TdT RNA terminal nucleotidyl transferase activity in the presence of Co 2+ and the indicated substrates (left). Denaturing gel showing TdT DNA terminal nucleotidyl transferase activity in the presence of Co 2+ and the indicated substrate (right). (E) Denaturing gels showing a time course of Polθ extension activity on the indicated DNA substrate in the presence of dNTPs (lanes 2𠄵) and NTPs (lanes 6𠄹). (F) Denaturing gels showing a time course of Polθ extension activity on the indicated DNA and RNA substrates in the presence of dNTPs. (G dan H) Denaturing gels showing a time course of Polθ extension activity on the indicated RNA substrate in the presence of dNTPs with and without excess unlabeled RNA trap added 30 s after reactions were initiated.

Polθ 3′ terminal extension processivity assays

Figure ​ Figure1G: 1G : Reactions were performed with 200 nM Polθ at 37° in the presence of 50 nM of the indicated 5′ 32 P-labeled RNA, 2 mM MnCl2, 500 µM dNTPs, 20 mM Tris–HCl pH 8.2, 0.01% NP-40, 0.1 mg/ml BSA, 10% glycerol and 20 units of AmbionTM RNase Inhibitor (Thermo-Scientific). Cold trap (7.5 µM 454R) was added 30 s later. Reactions were terminated at the indicated time points by the addition of 25 mM EDTA and 45% formamide and were resolved by electrophoresis in 15% urea polyacrylamide gels, then visualized by phosphorimager or autoradiography.

Figure ​ Figure1H: 1H : An amount of 2 nM Polθ was incubated with 100 nM of the indicated 5′ 32 P-labeled RNA at 37° in the presence of 2 mM MnCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 8.2, 0.01% NP-40, 0.1 mg/ml BSA, 10% glycerol and 20 units of AmbionTM RNase Inhibitor (Thermo-Scientific). Reactions were initiated with 500 µM dNTPs. Thirty seconds later, 10 µM cold trap (454R) was added to the reaction. Reactions were terminated at the indicated time points by the addition of 25 mM EDTA and 45% formamide and were resolved by electrophoresis in 15% urea polyacrylamide gels, then visualized by phosphorimager or autoradiography.

TdT terminal transferase activity

An amount of 200 nM of TdT was incubated with 50 nM of the indicated 5′ 32 P-labeled RNA or ssDNA in conditions recommended by New England Biolabs (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris acetate, 10 mM magnesium acetate, pH 7.9, with 0.25 mM cobalt) at 37ଌ. Twenty units of Ambion™ RNase Inhibitor (Thermo-Scientific) was added to reactions containing RNA. NTPs or dNTPs were present at 500 μM and reactions were incubated for 1 h. Reactions were terminated and processed as above.

Proteins

Polθ was purified as described using a newly generated SUMOstar (Life Sensors) expression vector and SUMOstar protease I (Life Sensors) (9). TdT was obtained from New England Biolabs (NEB).

Asid nukleik (5′-3′) (Integrated DNA Technologies)

RNA and DNA were 32 P 5′-labeled using 32 P-γ-adenosine triphosphate (ATP) (Perkin Elmer) and bacteriophage T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs).


Caspase-dependent Proteolysis of Human Ribonucleotide Reductase Small Subunits R2 and p53R2 during Apoptosis

Ribonucleotide reductase (RnR) is a key enzyme synthesizing deoxyribonucleotides for DNA replication and repair. In mammals, the R1 catalytic subunit forms an active complex with either one of the two small subunits R2 and p53R2. Expression of R2 is S phase-specific and required for DNA replication. The p53R2 protein is expressed throughout the cell cycle and in quiescent cells where it provides dNTPs for mitochondrial DNA synthesis. Participation of R2 and p53R2 in DNA repair has also been suggested. In this study, we investigated the fate of the RnR subunits during apoptosis. The p53R2 protein was cleaved in a caspase-dependent manner in K-562 cells treated with inhibitors of the Bcr-Abl oncogenic kinase and in HeLa 229 cells incubated with TNF-α and cycloheximide. The cleavage site was mapped between Asp(342) and Asn(343). Caspase attack released a C-terminal p53R2 peptide of nine residues containing the conserved heptapeptide essential for R1 binding. As a consequence, the cleaved p53R2 protein was inactive. In vitro, purified caspase-3 and -8 could release the C-terminal tail of p53R2. Knocking down these caspases, but not caspase-2, -7, and -10, also inhibited p53R2 cleavage in cells committed to die via the extrinsic death receptor pathway. The R2 subunit was subjected to caspase- and proteasome-dependent proteolysis, which was prevented by siRNA targeting caspase-8. Knocking down caspase-3 was ineffective. Protein R1 was not subjected to degradation. Adding deoxyribonucleosides to restore dNTP pools transiently protected cells from apoptosis. These data identify RnR activity as a prosurvival function inactivated by proteolysis during apoptosis.

Kata kunci: apoptosis caspase nucleoside/nucleotide biosynthesis protein degradation ribonucleotide reductase.

© 2015 oleh The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.


Tonton video: Deoxyribonucleotide Synthesis. (Februari 2023).