Maklumat

Adakah terdapat pangkalan data, alat atau kaedah yang boleh saya gunakan untuk mengetahui kod gen saya untuk reseptor sitokin?

Adakah terdapat pangkalan data, alat atau kaedah yang boleh saya gunakan untuk mengetahui kod gen saya untuk reseptor sitokin?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya mempunyai senarai lebih 600 gen yang dinyatakan secara berbeza daripada analisis data seq RNA sel tunggal saya. Saya ingin meneruskan untuk mengetahui kod gen saya untuk reseptor sitokin supaya saya boleh menunjukkan pada peta haba cara ekspresi mereka berbeza-beza merentas kelompok. Bolehkah ada yang memberi saya petunjuk mengenai alat atau kaedah yang boleh saya gunakan untuk mengetahui gen mana yang kod untuk reseptor sitokin?

Terima kasih terlebih dahulu.


Saya pasti ada banyak cara untuk menyelesaikannya (termasuk penyelidikan literatur melalui PubMed), tetapi untuk permulaan, saya mencari pangkalan data istilah GO yang, untuk istilah carian "aktiviti reseptor sitokin" mengembalikan ini, yang merangkumi sejumlah gen yang boleh saya muat turun sebagai fail excel dan memadankannya dengan kumpulan gen saya menggunakan R.


LIQA: kuantifikasi dan analisis isoform yang telah lama dibaca

Teknologi penjujukan RNA yang sudah lama dibaca (RNA-seq) dapat menguraikan transkrip panjang penuh, memudahkan penerokaan ekspresi gen khusus isoform berbanding RNA-seq yang dibaca pendek. Kami mempersembahkan LIQA untuk mengukur ekspresi isoform dan mengesan peristiwa penyambungan alternatif (DAS) pembezaan menggunakan penjujukan mRNA langsung atau data penjujukan cDNA. LIQA menggabungkan skor kualiti pasangan asas dan maklumat panjang khusus isoform dalam model kelangsungan hidup untuk menetapkan bobot yang berlainan dalam bacaan, dan menggunakan algoritma pemaksimalan jangkaan untuk pengukuran parameter. Kami menggunakan LIQA pada data RNA-seq yang telah lama dibaca daripada Rujukan Manusia Sejagat, leukemia myeloid akut dan sel epitelium skuamosa esofagus dan menunjukkan ketepatannya yang tinggi dalam memprofilkan peristiwa penyambungan alternatif.


Adakah terdapat pangkalan data, alat atau kaedah yang boleh saya gunakan untuk mengetahui kod gen saya untuk reseptor sitokin? - Biologi

Pangkalan data yang menyediakan maklumat tentang struktur genom yang dipasang, nama pemasangan dan meta-data lain, laporan statistik dan pautan kepada data jujukan genomik.

Satu set metadata yang disusun untuk koleksi budaya, muzium, herbaria dan koleksi sejarah semula jadi yang lain. Rekod tersebut memaparkan kod pengumpulan, maklumat mengenai institusi rumah koleksi, dan pautan ke data yang relevan di NCBI.

Kumpulan genomik, genomik fungsional, dan kajian genetik dan pautan ke set data yang dihasilkannya. Sumber ini menerangkan skop, bahan, dan objektif projek dan menyediakan mekanisme untuk mengambil set data yang sering sukar dijumpai kerana anotasi yang tidak konsisten, pelbagai penyerahan bebas, dan sifat pelbagai jenis data yang sering disimpan dalam pangkalan data yang berbeza.

Pangkalan data BioSample mengandungi perihalan bahan sumber biologi yang digunakan dalam ujian eksperimen.

Usaha kolaboratif untuk mengenal pasti set teras kawasan pengekodan protein manusia dan tetikus yang beranotasi secara konsisten dan berkualiti tinggi.

Termasuk variasi nukleotida tunggal, mikrosatelit dan sisipan dan pemadaman berskala kecil. dbSNP mengandungi data frekuensi dan genotip khusus populasi, keadaan eksperimen, konteks molekul, dan pemetaan maklumat untuk kedua-dua variasi neutral dan mutasi klinikal.

Pangkalan data urutan genetik NIH, koleksi anotasi semua urutan DNA yang tersedia untuk umum. GenBank adalah sebahagian daripada Kolaborasi Pangkalan Data Urutan Nukleotida Antarabangsa, yang merangkumi DNA DataBank Jepun (DDBJ), Makmal Biologi Molekul Eropah (EMBL), dan GenBank di NCBI. Ketiga-tiga organisasi ini bertukar data setiap hari. GenBank terdiri daripada beberapa bahagian, yang sebahagian besar dapat diakses melalui pangkalan data Nucleotide. Pengecualian adalah bahagian EST dan GSS, yang masing-masing diakses melalui pangkalan data NST Nucleotide dan NSS Nucleotide.

Penyusunan data dari NIAID Influenza Genome Sequencing Project dan GenBank. Ia menyediakan alat untuk analisis jujukan selesema, anotasi dan penyerahan kepada GenBank. Sumber ini juga mempunyai pautan kepada sumber urutan selesema yang lain, dan penerbitan serta maklumat umum tentang virus selesema.

Projek yang melibatkan pengumpulan dan analisis jujukan genomik patogen bakteria yang berasal dari makanan, persekitaran dan pengasingan pesakit. Pada masa ini, kluster saluran paip automatik dan mengenal pasti urutan yang disediakan terutamanya oleh makmal kesihatan awam untuk membantu penyiasatan wabak penyakit bawaan makanan dan mencari sumber pencemaran makanan yang berpotensi.

Kumpulan urutan nukleotida dari beberapa sumber, termasuk GenBank, RefSeq, pangkalan data Anotasi Pihak Ketiga (TPA), dan PDB. Mencari Pangkalan Data Nukleotida akan menghasilkan hasil yang tersedia dari setiap pangkalan data komponennya.

Pangkalan data urutan DNA yang berkaitan yang berasal dari kajian perbandingan: filogenetik, populasi, persekitaran dan, pada tahap yang lebih rendah, mutasi. Setiap rekod dalam pangkalan data adalah sekumpulan urutan DNA. Sebagai contoh, set populasi menyediakan maklumat tentang variasi genetik dalam organisma, manakala set filogenetik mungkin mengandungi jujukan, dan penjajaran mereka, bagi gen tunggal yang diperoleh daripada beberapa organisma berkaitan.

Pendaftaran awam reagen asid nukleik yang direka untuk digunakan dalam pelbagai aplikasi penyelidikan bioperubatan, bersama-sama dengan maklumat tentang pengedar reagen, keberkesanan siasatan dan persamaan jujukan yang dikira.

RefSeqGene Kumpulan urutan genomik rujukan khusus manusia. Gen RefSeq adalah subset pangkalan data RefSeq NCBI, dan ditentukan berdasarkan tinjauan dari kurator pangkalan data khusus lokus dan komuniti pengujian genetik. Mereka membentuk landasan yang stabil untuk melaporkan mutasi, untuk mewujudkan konvensi penomboran intron dan ekson yang konsisten, dan untuk menentukan koordinat variasi signifikan biologi yang lain. RefSeqGene adalah sebahagian daripada Kerjasama Locus Reference Genomic (LRG). Urutan Rujukan (RefSeq)

Koleksi urutan DNA, transkrip (RNA) dan genomik yang tidak disusun, dan protein yang dihasilkan oleh NCBI. RefSeqs memberikan rujukan yang stabil untuk penjelasan genom, pengenalan dan pencirian gen, analisis mutasi dan polimorfisme, kajian ekspresi, dan analisis perbandingan. Koleksi RefSeq diakses melalui pangkalan data Nukleotida dan Protein.

Arkib Bacaan Jujukan (SRA) menyimpan data penjujukan daripada platform penjujukan generasi seterusnya termasuk Roche 454 GS System®, Illumina Genome Analyzer®, Life Technologies AB SOLiD System®, Helicos Biosciences Heliscope®, Complete Genomics® dan Pacific Biosciences SMRT® .

Pangkalan data yang mengandungi urutan yang dibina dari data urutan utama yang ada di GenBank. Urutan dan anotasi yang sesuai disokong secara eksperimen dan telah diterbitkan dalam jurnal ilmiah yang dikaji oleh rakan sebaya. Rekod TPA diambil melalui Pangkalan Data Nukleotida.

Repositori kromatogram urutan DNA (jejak), panggilan asas, dan anggaran kualiti untuk bacaan single-pass dari pelbagai projek penjujukan berskala besar.

Muat turun

Boleh laku BLAST untuk kegunaan tempatan disediakan untuk sistem Solaris, LINUX, Windows dan MacOSX. Lihat fail README dalam direktori ftp untuk maklumat lanjut. Pangkalan data pra-format untuk carian nukleotida, protein, dan terjemahan BLAST juga tersedia untuk dimuat turun di bawah subdirektori db.

Urutkan pangkalan data untuk digunakan dengan program BLAST yang berdiri sendiri. Fail dalam direktori ini adalah pangkalan data pra-format yang siap digunakan dengan BLAST.

Urutkan pangkalan data dalam format FASTA untuk digunakan dengan program BLAST yang berdiri sendiri. Pangkalan data ini mesti diformat menggunakan formatdb sebelum dapat digunakan dengan BLAST.

Laman web ini mengandungi fail untuk semua rekod urutan dalam GenBank dalam format fail rata lalai. Fail diatur oleh bahagian GenBank, dan kandungan lengkapnya dijelaskan dalam fail README.genbank.

Tapak ini mengandungi semua rekod jujukan nukleotida dan protein dalam koleksi Jujukan Rujukan (RefSeq). Direktori ""release"" mengandungi keluaran terkini bagi koleksi lengkap, manakala data untuk organisma terpilih (seperti manusia, tetikus dan tikus) tersedia dalam direktori berasingan. Data tersedia dalam FASTA dan format fail rata. Lihat fail README untuk perincian.

Laman web ini mengandungi data penjujukan generasi seterusnya yang disusun oleh projek penjujukan yang dihantar.

Laman web ini mengandungi data kromatogram jejak yang disusun mengikut spesies. Data merangkumi kromatogram, skor kualiti, urutan FASTA dari panggilan asas automatik, dan maklumat tambahan lain dalam teks yang dibatasi tab serta format XML. Lihat fail README untuk perincian.

Tapak ini mengandungi pangkalan data UniVec dan UniVec_Core dalam format FASTA. Lihat fail README.uv untuk butiran.

Laman web ini mengandungi keseluruhan data urutan senapang genom yang disusun oleh kod projek 4 digit. Data merangkumi fail rata GenBank dan GenPept, skor kualiti dan statistik ringkasan. Lihat fail README.genbank.wgs untuk maklumat lebih lanjut.

Penyerahan

Borang dalam talian yang menyediakan antara muka untuk penyelidik, konsortia dan organisasi untuk mendaftarkan BioProjek mereka. Ini berfungsi sebagai titik permulaan penyerahan data genom dan genetik untuk kajian ini. Data tidak perlu diserahkan pada saat pendaftaran BioProject.

Alat penyerahan urutan berasaskan web untuk satu atau beberapa penyerahan ke pangkalan data GenBank, direka untuk menjadikan proses penyerahan cepat dan mudah.

Alat untuk penyerahan kepada pangkalan data GenBank bagi jujukan nukleotida pendek Kod Bar daripada lokus genetik standard untuk digunakan dalam pengenalpastian spesies.

Alat perisian yang berdiri sendiri yang dibangunkan oleh NCBI untuk menyerahkan dan mengemas kini entri kepada pangkalan data jujukan awam (GenBank, EMBL, atau DDBJ). Ia mampu menangani penyerahan sederhana yang mengandungi urutan mRNA pendek tunggal, pengiriman kompleks yang mengandungi urutan panjang, beberapa anotasi, set DNA yang tersegmentasi, serta urutan dari kajian filogenetik dan populasi dengan penjajaran. Untuk penghantaran mudah, gunakan alat penyerahan dalam talian BankIt.

Program baris perintah yang mengotomatisasi pembuatan rekod urutan untuk diserahkan ke GenBank menggunakan banyak fungsi yang sama seperti Sequin. Ia digunakan terutamanya untuk penyerahan genom lengkap dan sekumpulan besar urutan.

Pautan ini menerangkan bagaimana pengirim data SRA dapat memperoleh laman FTP NCBI yang selamat untuk data mereka, dan juga menerangkan format data dan struktur direktori yang dibenarkan.

Satu titik masuk untuk pengirim untuk memaut dan mencari maklumat tentang semua proses penyerahan data di NCBI. Pada masa ini, ini berfungsi sebagai antara muka untuk pendaftaran BioProjek dan BioSampel dan penyerahan data untuk WGS dan GTR. Penambahan masa depan ke laman web ini dirancang.

Pautan ini menerangkan bagaimana pengirim data jejak dapat memperoleh laman NCTP FTP yang selamat untuk data mereka, dan juga menerangkan format data dan struktur direktori yang dibenarkan.

Alatan

Mencari kawasan persamaan tempatan antara urutan biologi. Program ini membandingkan urutan nukleotida atau protein dengan pangkalan data urutan dan mengira kepentingan statistik pertandingan. BLAST dapat digunakan untuk menyimpulkan hubungan fungsional dan evolusi antara urutan dan juga untuk membantu mengenal pasti anggota keluarga gen.

Membolehkan anda mengambil rekod dari banyak pangkalan data Entrez dengan memuat naik fail GI atau nombor aksesi dari pangkalan data Nucleotide atau Protein, atau fail pengecam unik dari pangkalan data Entrez yang lain. Hasil carian dapat disimpan dalam pelbagai format terus ke fail tempatan di komputer anda.

Alat yang menyediakan akses ke data dalam sistem Entrez NCBI di luar antara muka pertanyaan web biasa. Mereka menyediakan kaedah mengautomasikan tugas Entrez dalam aplikasi perisian. Setiap utiliti melaksanakan tugas mendapatkan semula khusus, dan boleh digunakan hanya dengan menulis URL yang diformat khas.

Alat ini membandingkan jujukan nukleotida atau protein kepada pangkalan data jujukan genom dan mengira kepentingan statistik padanan menggunakan algoritma Alat Carian Penjajaran Tempatan Asas (BLAST).

Alat Remap NCBI membolehkan pengguna memproyeksikan data anotasi dan menukar lokasi ciri dari satu kumpulan genom ke yang lain atau ke urutan RefSeqGene melalui analisis asas demi asas. Pilihan disediakan untuk menyesuaikan ketetapan pemetaan ulang, dan hasil ringkasan ditampilkan di halaman web. Hasil penuh boleh dimuat turun untuk dilihat dalam pemaparan grafik Genome Workbench NCBI, dan data anotasi untuk ciri yang dipetakan semula, serta data ringkasan, juga tersedia untuk dimuat turun.

Aplikasi bersepadu untuk melihat dan menganalisis data urutan. Dengan Genome Workbench, anda dapat melihat data dalam pangkalan data urutan yang tersedia untuk umum di NCBI, dan mencampurkan data ini dengan data anda sendiri.

Alat analisis grafik yang mencari semua bingkai bacaan terbuka dalam urutan pengguna atau dalam urutan yang sudah ada dalam pangkalan data. Enam belas kod genetik yang berbeza boleh digunakan. Urutan asid amino yang disimpulkan dapat disimpan dalam pelbagai format dan dicari berdasarkan pangkalan data protein menggunakan BLAST.

Alat Primer-BLAST menggunakan Primer3 untuk merancang primer PCR ke templat urutan. Produk yang berpotensi kemudian dianalisis secara automatik dengan pencarian BLAST terhadap pangkalan data yang ditentukan pengguna, untuk memeriksa kekhususan terhadap sasaran yang dimaksudkan.

Kegunaan untuk mengira penjajaran protein dengan urutan nukleotida genom. Ia didasarkan pada variasi algoritma penjajaran global Needleman Wunsch dan secara khusus memperhitungkan intron dan isyarat sambatan. Oleh kerana algoritma ini, ProSplign tepat dalam menentukan laman penyambungan dan bertoleransi terhadap kesalahan urutan.

Menyediakan paparan grafik yang dapat dikonfigurasi bagi urutan nukleotida atau protein dan ciri yang telah dijelaskan pada urutan tersebut. Selain digunakan pada halaman pangkalan data jujukan NCBI, pemapar ini tersedia sebagai komponen halaman web yang boleh dibenamkan. Dokumentasi terperinci termasuk panduan Rujukan API tersedia untuk pembangun yang ingin membenamkan penonton dalam halaman mereka sendiri.

Utiliti untuk mengira penjajaran jujukan cDNA-ke-Genomik. Ia didasarkan pada variasi algoritma penjajaran global Needleman-Wunsch dan secara khusus memperhitungkan intron dan isyarat sambatan. Oleh kerana algoritma ini, Splign tepat dalam menentukan laman penyambungan dan bertoleransi terhadap kesalahan urutan.

Sistem untuk mengenal pasti segmen urutan asid nukleik dengan cepat yang berasal dari vektor. VecScreen mencari urutan pertanyaan untuk segmen yang sepadan dengan sebarang urutan dalam pangkalan data vektor tidak berlebihan (UniVec).


PROSES KAJIAN

Jawatankuasa ini mengadakan mesyuarat organisasi awal pada Januari 2001. CDC dan NIH membentangkan pertuduhan jawatankuasa itu pada mesyuarat itu, dan jawatankuasa itu kemudiannya menjalankan kajian umum tentang kebimbangan keselamatan imunisasi. Pada mesyuarat ini, jawatankuasa itu juga menentukan metodologi asas yang akan digunakan untuk menilai sebab akibat dalam hipotesis untuk dipertimbangkan dalam perbincangan seterusnya. Sebuah laman web (www.iom.edu/imsafety) dan listervers dibuat untuk memberi akses kepada orang ramai ke maklumat mengenai kerja panitia dan untuk memudahkan komunikasi dengan panitia. Kesimpulan dan cadangan laporan jawatankuasa setakat ini (lihat Kotak 1) diringkaskan dalam Lampiran A.

KOTAK 1

Laporan Jawatankuasa Pemeriksa Keselamatan Pelalian Sebelumnya. Kajian Keselamatan Imunisasi: Vaksin Campak-Mumps-Rubella dan Autisme (IOM, 2001a) Kajian Keselamatan Imunisasi: Vaksin Thimerosal dan Gangguan Neurodevelopmental (IOM, 2001b)

Untuk penilaiannya terhadap soalan-soalan mengenai vaksin dan autisme, jawatankuasa itu mengadakan mesyuarat saintifik terbuka pada Februari 2004 untuk mendengar pembentangan mengenai isu-isu yang berkaitan dengan topik tersebut (lihat Lampiran B). Kebanyakan pembentangan ini boleh didapati dalam bentuk elektronik (fail audio dan slaid) di laman web projek. Di samping itu, jawatankuasa ini mengkaji koleksi bahan yang banyak, terutamanya dari literatur ilmiah dan perubatan yang diterbitkan, yang dikaji oleh rakan sebaya. Jawatankuasa ini juga menugaskan makalah mengenai autisme dan sistem kekebalan tubuh. Senarai bahan yang dikaji oleh jawatankuasa, termasuk banyak perkara yang tidak disebut dalam laporan ini, boleh didapati di laman web projek.


Ucapan terima kasih

Terima kasih khas kepada Leander Dony, yang melakukan debug, mengemas kini, dan menguji kajian kes untuk menggunakan kaedah terkini. Selain itu, kami ingin mengucapkan terima kasih kepada banyak orang yang membaca buku catatan kajian dan manuskrip dan memperbaikinya dengan komen dan kepakaran mereka. Untuk ini, kami menghargai input Maren Buttner, David Fischer, Alex Wolf, Lukas Simon, Luis Ospina-Forero, Sophie Tritschler, Niklas Koehler, Goekcen Eraslan, Benjamin Schubert, Meromit Singer, Dana Pe'er, dan Rahul Satija. Terima kasih khas untuk ini juga kepada penyemak tanpa nama manuskrip dan editor, Thomas Lemberger, atas ulasan mereka yang teliti, membina dan meluas. Buku nota kajian kes diuji dan diperbaiki oleh pengguna awal Marius Lange, Hananeh Aliee, Subarna Palit dan Lisa Thiergart. Volker Bergen dan Alex Wolf juga menyumbang kepada aliran kerja dengan membuat penyesuaian scanpy. Pilihan set data untuk menunjukkan secara optimum semua aspek aliran kerja analisis difasilitasi oleh input baik dari Adam Haber dan Aviv Regev. Karya ini disokong oleh pemberian BMBF # 01IS18036A dan geran # 01IS18053A, oleh Yayasan Penyelidikan Jerman (DFG) dalam Pusat Penyelidikan Kolaborasi 1243, Subproyek A17, oleh Persatuan Helmholtz (Inkubator hibah sparse2big, hibah # ZT-I-0007) dan oleh DAF Inisiatif Chan Zuckerberg (dana dinasihatkan dari Yayasan Komuniti Silicon Valley, 182835).


Semua kod analisis yang disajikan dalam naskah ini boleh didapati di http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/. Laman web analisis dibuat menggunakan tukang kerja (1.6.2) Pakej R [38]. Repositori GitHub yang dikaitkan dengan tapak web analisis adalah di: https://github.com/Oshlack/methyl-geneset-testing.

Model statistik untuk GOmeth

Ujian statistik untuk GOmeth dan GOregion didasarkan pada taburan hipergeometrik bukan pusat Wallenius, yang merupakan versi umum pengedaran hipergeometrik di mana item diambil sampel dengan berat sebelah. Untuk GOmeth, kami mengambil prosedur bertahap berikut:

Untuk setiap CpG i dijelaskan kepada gen j, hitung berat

Jika setiap CpG dianotasi kepada satu gen, maka wij = 1.

biarlah i = 1,…, sayaj menandakan CpG yang dijelaskan kepada gen j. Hitung bilangan setara CpG yang diukur merentas gen j seperti:

Sekiranya tidak ada CpG yang berkaitan dengan pelbagai gen, maka Nj hanyalah bilangan prob yang diukur di seluruh gen j.

biarlah A tentukan set Cpgs metilasi yang berbeza secara signifikan. Untuk setiap gen j, tentukan vektor penunjuk 1j(x) panjangnya sayaj seperti itu xi = 1 jika CpGijA, dan xi = 0 jika CpGijA, di mana i = 1,…, sayaj.

biarlah wj tentukan vektor pemberat wij untuk setiap gen j. Kira skor metilasi pembezaan bagi setiap gen j

Perhatikan nilai maksimum Sj ialah 1, dan Sj < 1 hanya dalam kes di mana CpG yang ketara adalah semua berbilang gen yang dikaitkan, dan jumlah berat kurang daripada satu. Sj = 0 apabila tiada CpG metilasi berbeza yang ketara merentas gen j.

biarlah j = 1, …, Jg menunjukkan gen yang terdapat dalam set gen g. Hitung statistik pengayaan untuk ujian hipergeometrik bukan pusat Wallenius untuk setiap set gen g

Untuk ujian hipergeometrik bukan pusat Wallenius, statistik pengayaan adalah persimpangan antara gen metilasi dan gen yang berbeza secara berbeza dalam kumpulan gen g, yang mengabaikan CpG yang berkaitan dengan pelbagai gen. Statistik pengayaan kami yang diubah suai ESg menyumbang CpG yang berkaitan dengan pelbagai gen untuk set gen g.

Hitung fungsi pemberat kebarangkalian (PWF) dengan menerapkan rata-rata bergerak yang lebih lancar pada vektor binari yang diperintahkan (berdasarkan bilangan CpG yang berkaitan) di mana 1 menunjukkan gen berbeza metilasi dan 0 menunjukkan gen tidak berbeza metilasi. Kami menggunakan fungsi "tricubeMovingAverage" di limma pakej yang serupa dengan lengkung loess kuasa dua terkecil darjah sifar. Vektor binari disusun mengikut bilangan CpG yang setara yang mengukur metilasi merentas setiap gen, Nj, daripada yang terkecil kepada yang terbesar. Outputnya adalah vektor dengan panjang yang sama dengan input sehingga setiap gen diberikan kebarangkalian metilasi pembezaan berdasarkan nilai yang dilicinkan. Kami kemudian mengira kemungkinan pengayaan yang diharapkan untuk setiap set gen g dengan mengira purata PWF gen dalam set dan membandingkannya dengan purata PWF bagi gen lain yang diwakili pada tatasusunan.

Untuk menguji pengayaan setiap set gen g, kami memperoleh nilai p satu sisi daripada taburan hipergeometri bukan pusat Wallenius dengan parameter berikut: x = lantai (ESg), m1 = ukuran set gen Jg, m2 = bilangan gen pada tatasusunan yang lain, n = jumlah bilangan gen penting, dan kemungkinan = ODDSg. Kami menggunakan BiasUrn Pakej R untuk mendapatkan nilai p.

Simulasi nol: persampelan rawak CpG

Kami memilih set secara rawak 50, 100, 500, 1000, 5000 dan 10,000 CpG daripada anotasi tatasusunan Illumina untuk tatasusunan 450k dan EPIC. Pensampelan diulang 100 kali untuk setiap ukuran set CpG. Kami menguji pengayaan kategori GO yang signifikan dengan menggunakan ujian hipergeometrik standard (HGT), ujian hipergeometrik Wallenius untuk perangkaan bilangan probe (HGT-mod) dan GOmeth, yang berdasarkan ujian hipergeometrik Wallenius dan menyumbang nombor prob dan multi -bias gen.

Set data metilasi

Sampel biasa daripada dataset KIRC TCGA [39] digunakan untuk menganggar kadar penemuan palsu kaedah ujian set gen yang berbeza. Data dimuat turun menggunakan curatedTCGAData Pakej biokonduktor [40] dan 160 sampel biasa diekstrak. Data telah disediakan seperti yang telah diproses β Walau bagaimanapun, kami melakukan penapisan tambahan dan mengeluarkan probe berkualiti rendah, probe yang mengandungi SNP serta probe kromosom seks. Plot penskalaan multidimenasional yang dihasilkan tidak menunjukkan bukti yang jelas mengenai seks atau kesan teknikal lain (Gamb. 3C).

Di samping itu, 85 sampel normal dari kumpulan data BRCA TCGA [41] digunakan untuk menganggarkan kadar penemuan palsu dari tujuh kaedah pengujian set gen. Data telah dimuat turun menggunakan curatedTCGAData Pakej biokonduktor dan 97 sampel biasa yang diekstrak. Berikutan kawalan kualiti, 12 sampel dikeluarkan (8 dengan pengedaran nilai beta yang luar biasa dan 4 sampel Afrika / Afrika Amerika). Probe berkualiti rendah dan probe yang mengandungi SNP disaring. Probe yang terletak pada kromosom seks telah dikekalkan kerana semua sampel adalah perempuan (Fail tambahan 1: Rajah S3C).

Untuk membandingkan prestasi antara kaedah ujian set gen yang berbeza apabila terdapat metilasi pembezaan yang ketara, kami menggunakan data Illumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) yang dihasilkan daripada neutrofil disusun aliran (Neu, n = 6), monosit (Mono, n = 6), B -limfosit (sel B, n = 6), sel T CD4+ (CD4T, n=7, enam sampel dan satu replika teknikal), sel T CD8+ (CD8T, n = 6), sel pembunuh semulajadi (NK, n = 6) dan 12 campuran tiruan DNA (dilabel sebagai MIX) [29]. Hanya sel yang disusun yang digunakan dalam analisis kami. Data telah dimuat turun menggunakan ExperimentHub Pakej biokonduktor.

Kami juga menganalisis set data sel B yang berkembang yang sesuai dengan metilasi DNA dan pengukuran ekspresi gen [42]. Empat populasi tahap perkembangan sel B awal diperoleh dari sumsum tulang janin manusia, dari 8 individu. Metilasi diukur menggunakan Illumina HumanMethylation450 Beadchip, dan ekspresi gen diukur menggunakan GeneChip Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix). Empat populasi telah dikenal pasti menggunakan antibodi sitometri aliran dan terdiri daripada Peringkat 1 (kebanyakan progenitor multipoten dan progenitor limfoid biasa), Peringkat 2 (sel pra-BI), Peringkat 3 (sel pra-B-II) dan Peringkat 4 (sel B tidak matang. ). Data dimuat turun dari Gene Expression Omnibus (GSE45461).

Analisis dan pemprosesan

Majoriti analisis dilakukan menggunakan R (4.0.3) dan beberapa menggunakan R (3.6.1) [43]. Versi R dan pakej khusus yang digunakan untuk aspek analisis yang berbeza boleh dilihat di bawah bahagian "Maklumat sesi" tapak web analisis yang dikaitkan dengan kajian ini: http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/.

Kawalan kualiti dan normalisasi

Semua data metilasi diproses menggunakan minfi [3, 44] R Biokonduktor [45, 46] pakej. Antara tatasusunan dan penormalan jenis probe dilakukan menggunakan kaedah normalisasi kuantil berstrata (SQN) [47]. Prob dengan nilai P pengesanan > 0.01 dalam satu atau lebih sampel telah dibuang. Probe yang berpotensi dipengaruhi oleh SNP biasa (frekuensi alel kecil & gt 0) yang berdekatan dengan CpG minat (sehingga 2 bp ke hulu dan 1 hilir) dan prob tidak spesifik [37, 48] juga dikeluarkan dari analisis selanjutnya.

Analisis statistik

Bahagian metilasi pada setiap CpG diwakili oleh βnilai, ditakrifkan sebagai perkadaran isyarat metilasi kepada jumlah isyarat dan dikira daripada nilai keamatan ternormal. Analisis statistik telah dilakukan pada nilai M ( left[M=frac kanan] ) seperti yang disyorkan oleh Du et al. [49].

Perbandingan kaedah pengujian set gen menggunakan data sel darah yang disusun

Model linear probe-bijak CpG telah dipasang untuk menentukan perbezaan dalam metilasi antara jenis sel (sel B vs NK, sel CD4 vs CD8 T, monosit vs neutrofil) menggunakan limma pakej [2]. Probe metilasi berbeza (DMPs) telah dikenal pasti menggunakan ujian t sederhana Bayes empirikal [50], melakukan pengecutan Bayes empirikal yang teguh bagi varians gen-bijak untuk melindungi daripada probe hipervariable [51]. Nilai-nilai p t Moderasi Bayes kemudian dikira relatif dengan ambang perubahan log-lipat (lfc) minimum pada skala nilai-M (lfc = 0,5, sepadan dengan |Δβ|

0.1) [30]. Nilai P telah diselaraskan untuk ujian berbilang menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg [52].

Untuk setiap perbandingan, kami menguji pengayaan yang ketara bagi kategori GO dan laluan KEGG. Kami hanya menguji set dengan sekurang-kurangnya 5 gen dan paling banyak 5000 gen untuk metilGSA kaedah. Kedudukan teratas 5000 CpG telah diuji menggunakan HGT dan GOmeth, daripada missMethyl pakej, untuk pengayaan istilah GO dan laluan KEGG. Nilai p mentah diteruskan sebagai input ke metilGSA kaedah. Kaedah ebGSEA dijalankan menggunakan ebGSEA Pakej R (https://github.com/aet21/ebGSEA).

Perbandingan kaedah pengujian set gen menggunakan data karsinoma sel ginjal (KIRC)

Data KIRC [39] dari curatedTCGAData pakej disediakan sebagai β nilai dengan titik data bertopeng titik data bertopeng sebagai "NA" jika nilai p pengesanan mereka lebih besar daripada 0.05 atau kuar diberi anotasi sebagai mempunyai SNP dalam 10 pasangan asas atau ulangi dalam 15 pasangan asas CpG yang disoal siasat [53]. Kami hanya mengekstrak 160 sampel normal dan mengeluarkan probe dengan nilai NA apa pun, serta probe yang terpengaruh SNP dan probe multi-pemetaan dan kromosom seks, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Ini meninggalkan 364,602 siasatan untuk analisis hiliran.

Kami menjalankan 100 simulasi nol dengan mensubsampel sampel normal secara rawak dan membahagikannya kepada dua "kumpulan" buatan dengan 5, 10, 20, 40, dan 80 sampel setiap kumpulan. Bagi setiap 100 simulasi, pada setiap saiz sampel, DMP antara kumpulan telah dikenal pasti menggunakan ujian t sederhana Bayes empirikal [50], melakukan pengecutan Bayes empirikal yang teguh bagi varians gen untuk melindungi daripada probe hipervariable [51].

Kami kemudian melakukan ujian set gen hasil analisis metilasi pembezaan menggunakan beberapa kaedah dengan set gen MSigDB Broad yang tersedia dalam Johan Pakej biokonduktor. GOmeth telah dijalankan menggunakan kedua-dua 1000 teratas dan 5000 CpG penting teratas sebagai input. The metilGSA kaedah mGLM, mRRA (ORA) dan mRRA (GSEA) dijalankan dengan saiz set gen terhad kepada minimum 5 dan maksimum 5000 gen. Kaedah ebGSEA dijalankan menggunakan parameter lalai dan output KPMT dan WTnya dibandingkan.

Perbandingan kaedah pengujian set gen menggunakan data karsinoma invasif payudara (BRCA)

Seperti data KIRC, data BRCA [41] telah dimuat turun menggunakan curatedTCGAData pakej. Kami kemudian mengekstrak 97 sampel normal dan mengeluarkan probe dengan sebarang nilai NA, serta probe yang terjejas oleh SNP dan probe berbilang pemetaan, seperti yang diterangkan sebelum ini. Probe kromosom seks dikekalkan kerana semua penderma sampel adalah wanita. Ini meninggalkan 371,389 siasatan untuk analisis lebih lanjut. Dua belas sampel terpencil telah dialih keluar (8 dengan taburan nilai beta yang luar biasa dan 4 sampel Afrika/Afrika Amerika), meninggalkan 85 sampel untuk analisis hiliran.

Kami menjalankan 100 simulasi nol dengan mensubsampel sampel normal secara rawak dan membahagikannya kepada dua kumpulan buatan dengan 5, 10, 20, dan 40 sampel setiap kumpulan. DMP antara kedua-dua kumpulan telah dikenal pasti seperti yang diterangkan untuk data KIRC, diikuti dengan pendekatan ujian set gen yang sama menggunakan tujuh kaedah berbeza yang digariskan sebelum ini.

Data dan analisis RNA-Seq

Data RNA-Seq untuk jenis sel darah yang disusun telah dimuat turun dari SRA (GSE107011 SRP125125) [31, 32]. Bacaan dipetakan kepada transkrip rujukan hg19 (//refgenomes.databio.org/v2/asset/hg19_cdna/fasta/archive?tag=default) dan dikira menggunakan Salmon (1.2.1) [54]. Anggaran tahap transkrip salmon telah diimport dan diringkaskan pada peringkat gen sebagai TPM berskala panjang menggunakan tximport Pakej biokonduktor [55]. Gen yang dinyatakan rendah disaring menggunakan tepiR [56] Fungsi "filterByExpr" seperti yang diterangkan oleh Chen di al [57].. Data kemudiannya TMM dinormalisasi [58] dan diubah menggunakan "voomWithQualityWeights" [59], untuk meningkatkan kuasa dengan menggabungkan "voom" [60] pemerhatian- pemberat aras dengan pemberat khusus sampel.

Model linier probe kemudian dipasang untuk setiap gen untuk menentukan perbezaan ekspresi gen antara jenis sel (sel B vs sel NK, sel CD4 vs CD8 T, monosit vs neutrofil) menggunakan limma [2]. Gen yang dinyatakan secara berbeza dikenal pasti menggunakan ujian t moderasi Bayes empirik [50], melakukan pengecutan Bayes empirikal yang kuat dari varians gen-gen untuk melindungi daripada probe yang boleh berubah [51]. Nilai P telah diselaraskan untuk ujian berbilang menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg [52].

Kami menggunakan fungsi goana daripada limma pakej untuk menguji pengayaan kategori GO, kegga untuk menguji pengayaan laluan KEGG dan versi umum goana dan kegga untuk menguji pengayaan set gen MSigDB Broad. Semua kaedah mengambil kira bias panjang gen [23]. Kumpulan kebenaran GO, KEGG dan MSigDB kemudian ditakrifkan untuk setiap perbandingan jenis sel dari analisis RNA-Seq sebagai 100 set diperkaya teratas.

Data dan analisis ekspresi gen tatasusunan Affymetrix

Data ekspresi gen Array Affymetrix Human Gen 1.0 ST untuk pembangunan sel pra-B telah dimuat turun daripada GEO (GSE45460) [42].

Fail CEL mentah telah dimuatkan dan diproses menggunakan fail oligo Pakej biokonduktor. Data telah diperbetulkan latar belakang, dinormalisasi, dan diringkaskan menggunakan pra-pemprosesan Purata Pelbagai Cip Teguh (RMA) [33, 34]. Hanya probe dengan intensiti median lebih daripada 4.5, dalam sekurang-kurangnya 7 sampel, dikekalkan. Pengecam kluster transkrip yang dipetakan kepada berbilang pengecam Entrez telah ditapis keluar, bersama-sama dengan sebarang probe yang tidak dipetakan kepada pengecam Entrez, meninggalkan 19,494 gen untuk analisis hiliran.

Model linier probe kemudian dipasang untuk setiap gen untuk menentukan perbezaan ekspresi gen antara Tahap 1 dan Tahap 2 perkembangan sel pra B (Tahap 1 vs Tahap 2) menggunakan limma [2]. Gen yang dinyatakan secara berbeza dikenal pasti menggunakan ujian t moderasi Bayes empirik [50], melakukan pengecutan Bayes empirikal yang kuat dari varians gen-gen untuk melindungi daripada probe yang boleh berubah [51]. Nilai P telah diselaraskan untuk ujian berbilang menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg [52]. Gen dengan log2 perubahan lipatan lebih besar daripada 0.5 menggunakan TREAT [30] dan FDR kurang daripada 0.05 dianggap sebagai dinyatakan secara berbeza.

Fungsi goana dari limma paket digunakan untuk menguji pengayaan kategori GO dan kegga untuk menguji pengayaan jalur KEGG. Set kebenaran GO dan KEGG kemudiannya ditakrifkan untuk perbandingan Peringkat 1 berbanding Peringkat 2 daripada analisis ekspresi gen sebagai 100 set diperkaya teratas.

Penilaian GOregion menggunakan data sel darah yang disusun aliran

Data lllumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) yang dijana daripada sel darah disusun aliran telah digunakan untuk mengenal pasti DMR. Data diproses seperti yang dijelaskan sebelumnya. DMR antara jenis sel (sel B vs sel NK, sel CD4 vs CD8 T, monosit vs neutrofil) dikenal pasti menggunakan DMRcate Pakej biokonduktor [16]. Analisis dilakukan pada nilai M menggunakan parameter lalai. Ujian set gen hilir dilakukan pada senarai DMR yang disaring dengan min |Δβ| ≥ 0.1 dan sekurang-kurangnya 3 CpG asas.

Istilah GO telah diuji untuk pengayaan gen yang berkaitan dengan DMR menggunakan goregion dan HGT standard, seperti yang dilaksanakan dalam fungsi goana dari limma Pakej biokonduktor. Gen, seperti yang ditentukan dalam TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene Pakej biokonduktor, dimasukkan dalam senarai gen yang akan diuji menggunakan goana jika ia bertindih DMR sekurang-kurangnya 1bp.

Penilaian GOregion menggunakan data pembangunan sel pra-B

Data lllumina Infinium HumanMethylation450 (GSE45459) yang dihasilkan daripada 4 peringkat pembangunan sel pra B telah digunakan untuk mengenal pasti DMR. Data diproses seperti yang dijelaskan sebelumnya. DMR antara Tahap 1 dan Tahap 2 dikenal pasti menggunakan DMRcate Pakej biokonduktor [16]. Analisis dilakukan pada nilai M menggunakan parameter lalai. DMR tidak disaring sebelum ujian set gen.

Istilah GO diuji untuk pengayaan gen yang berkaitan dengan DMR menggunakan goregion dan HGT standard, seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk data sel darah yang disusun.


Panduan Pemeriksaan Bioteknologi (11/91)

Nota: Dokumen ini adalah bahan rujukan untuk penyiasat dan kakitangan FDA yang lain. Dokumen itu tidak mengikat FDA, dan tidak memberikan apa-apa hak, keistimewaan, faedah atau kekebalan untuk atau kepada mana-mana orang.

PENGHARGAAN

Panduan ini dimulakan oleh Robert C. Fish, Director, Division of Field Investigations (DFI). Fish meminta Barbara-Helene mith, Ph.D., DIB, CHI-DO, untuk mempengerusikan kumpulan kerja untuk menyusun panduan pemeriksaan untuk Penyiasat di bidang bioteknologi. Kumpulan kerja, yang turut termasuk Thaddeus T. Sze, Ph.D., Jurutera Kimia, DFI, dan Kim A. Rice, Penyelia Penyeliaan, SEA-DO, menyediakan draf dokumen dengan maklumat yang diperoleh daripada kakitangan Pusat dan Lapangan FDA yang aktif terlibat dalam pemeriksaan bioteknologi.

Dokumen tersebut telah disemak dan dikembangkan semasa bengkel 2 l/2 hari (29-3l Mei, l99l) yang dihadiri oleh kakitangan Pusat dan Lapangan berikut: Wendy Aaronson (CBER), Henry Avallone (NWK- DO), Yuan-Yuan Chiu , Ph.D. (CDER), Vitolis Vengris, D.V.M., Ph.D. (CVM), John Ingalls (BOS-DO), Rita Jhangiani (PHI-DO), George Kroehling (CDRH), Seth Pauker, Ph.D. (OB), Pearl Tanjuaquio (LOS-DO), Frank Twardochleb (CDRH) dan Sylvia Yetts (DAL-DO).

Kami ingin merakamkan penghargaan kami kepada semua yang berkongsi laporan pemeriksaan dan FDA-483, menyumbang kepakaran teknikal, memberikan komen, dan membantu dalam penyediaan Panduan ini. Terima kasih khas kepada Cik Kimberly Search (DFI) atas bantuan perkeraniannya yang pakar.

KANDUNGAN

PANDUAN PEMERIKSAAN BIOTEKNOLOGI UNTUK PENYIASAT

PENGENALAN

Bioteknologi, yang ditakrifkan sebagai "aplikasi sistem dan organisma biologi kepada proses teknikal dan perindustrian", bukanlah sesuatu yang baru. Penggunaan yis untuk menapai bijirin menjadi alkohol telah berterusan selama berabad-abad. Begitu juga, petani dan penternak menggunakan bentuk "kejuruteraan genetik" untuk menghasilkan tanaman dan stok yang lebih baik dengan memilih ciri yang diinginkan pada tumbuhan dan haiwan. Baru-baru ini teknik bioteknologi "baru" membolehkan para saintis mengubah bahan genetik organisma pada peringkat sel atau molekul. Kaedah ini lebih tepat, tetapi hasilnya serupa dengan yang dihasilkan dengan teknik genetik klasik yang melibatkan keseluruhan organisma. Bioteknologi - produk terbitan (BDP) yang digunakan dalam Panduan ini merujuk kepada produk yang diperoleh daripada teknik bioteknologi baharu.

Pembangunan BDP dan pemeriksaan pembuatan dan kawalan produk ini menawarkan banyak cabaran. Oleh kerana proses pembuatan dan kawalan yang pelbagai terus dikembangkan, usaha yang besar diperlukan untuk mencapai tahap kecekapan teknikal untuk memeriksa operasi ini. Walaupun tahap teknologi semakin meningkat, harus diakui bahawa peraturan dan persyaratan dasar yang sama berlaku untuk pembuatan dan pengawalan bahan dan alat yang berasal dari bioteknologi seperti untuk produk buatan "konvensional".

Kriteria yang sama telah digunakan selama bertahun-tahun dalam pemeriksaan pengeluar antibiotik, enzim dan bahan berat molekul tinggi yang lain termasuk insulin, heparin, dan albumin. Panduan ini akan menangani beberapa masalah asas yang dikenal pasti semasa pemeriksaan pengilang BDP. Sistem pengeluaran mungkin termasuk haiwan, klon sel (cth. hibridoma), kultur sel mamalia dan serangga, yis, dan bakteria atau gabungan sistem ini.

Objektif utama pemeriksaan adalah untuk menentukan sama ada pengeluar beroperasi dalam keadaan terkawal dan mematuhi undang-undang dan peraturan. Komitmen syarikat terhadap kualiti sangat penting, tanpa mengira jenis syarikat atau produk yang dihasilkan.

Satu aspek penting dalam pemeriksaan adalah untuk mengenal pasti produk yang rosak, produk yang tidak mematuhi dan kegagalan sistem. Cara syarikat menyiasat dan membetulkan keadaan yang tidak menyenangkan serta kekurangan sistem pembuatan dan kawalan adalah bahagian penting dalam pemeriksaan dan biasanya menggambarkan tahap kualiti dalam firma.

Seperti pemeriksaan pra-persetujuan terhadap ubat-ubatan dan alat-alat manusia dan veterinar, disarankan agar pemeriksaan firma bioteknologi dilakukan oleh pasukan, dengan penyelidik utama bertanggung jawab atas keseluruhan pemeriksaan. Penganalisis (Ahli Kimia dan / atau Ahli Mikrobiologi), Pakar Komputer, dan Jurutera boleh mengambil bahagian dalam semua atau bahagian pemeriksaan. Sebelum pemeriksaan, "pasukan" harus membincangkan tugas anggota pasukan tertentu.

Pemeriksaan bioteknologi juga merupakan pemeriksaan khusus produk. Seperti pemeriksaan apa pun, liputan biasanya merupakan audit dan tidak termasuk semua. Oleh itu, data pengesahan untuk semua sistem, proses, kawalan dan prosedur ujian tidak dapat dikaji. Walau bagaimanapun, liputan terperinci khusus harus diberikan kepada beberapa sistem atau kawalan. Carta alir dari dokumen permohonan atau dari firma harus diperoleh sebelum atau awal pemeriksaan dan langkah-langkah pembuatan khusus harus dikaji dengan petugas yang bertanggungjawab pengeluar.

BUDAYA SEL DAN PENApaian

    Bank Sel Induk dan Bank Sel Kerja

Bahan permulaan untuk pembuatan BDP termasuk kultur sel bakteria, yis, serangga atau mamalia yang menyatakan produk protein atau antibodi monoklonal yang diminati. Sistem lot biji sel digunakan oleh pengeluar untuk memastikan identiti dan kesucian bahan mentah permulaan. Sebilangan benih sel terdiri daripada pelbagai budaya tunggal. Bank sel induk (MCB) berasal daripada koloni tunggal (bakteria, yis) atau sel eukariotik tunggal, disimpan secara kriogenik untuk memastikan kestabilan genetik dan terdiri daripada ampul kultur yang mencukupi untuk menyediakan bahan sumber untuk bank sel kerja (WCB) . WCB didefinisikan sebagai kuantiti sel yang berasal dari satu atau lebih ampul MCB, disimpan secara kriogenik dan digunakan untuk memulai kumpulan produksi.

Oleh kerana kestabilan genetik bank sel semasa penyimpanan dan pembiakan menjadi perhatian utama, penting untuk mengetahui asal usul dan sejarah (bilangan petikan) kedua-dua MCB dan WCB. Ampul MCB disimpan dalam keadaan beku atau dihidupkan dan hanya digunakan sekali sahaja. Kadang-kadang, MCB baru boleh dihasilkan dari WCB. MCB baru harus diuji dan dicirikan dengan betul. Untuk produk biologi, permohonan atau pindaan lesen produk mesti dikemukakan dan diluluskan sebelum MCB baharu boleh dijana daripada WCB.

Maklumat tentang pembinaan vektor ungkapan, serpihan yang mengandungi bahan genetik yang mengekod produk yang diingini, dan genotip serta fenotip yang berkaitan bagi sel perumah diserahkan sebagai sebahagian daripada aplikasi produk. Masalah utama sistem biologi adalah kestabilan genetik bank sel semasa pengeluaran dan penyimpanan, pencemaran mikroorganisma, dan kehadiran virus endogen pada beberapa sel sel mamalia. Sebagai sebahagian daripada dokumen permohonan, pengilang akan menyerahkan penerangan tentang semua ujian yang dilakukan untuk mencirikan dan melayakkan bank sel.

Perlu ditekankan bahawa ujian yang diperlukan untuk mencirikan bank sel akan bergantung pada tujuan penggunaan produk akhir, sistem inang / ekspresi dan kaedah pengeluaran termasuk teknik yang digunakan untuk pemurnian produk. Di samping itu, jenis ujian boleh berubah seiring kemajuan teknologi.

MCB diuji dengan ketat. Ujian berikut secara amnya dilakukan, tetapi tidak terhad kepada:

  1. Pencirian genotip dengan cap jari DNA
  2. Pencirian fenotip mengikut keperluan nutrien, analisis isoenzim, pertumbuhan dan ciri morfologi
  3. Pengeluaran semula produk yang diingini
  4. Pencirian molekul vektor / serpihan klon dengan pemetaan enzim pembatasan, analisis urutan
  5. Ujian untuk mengesan pencemaran virus
  6. Uji transkripase terbalik untuk mengesan retrovirus
  7. Ujian kemandulan dan ujian mycoplasma untuk mengesan bahan cemar mikrob lain

Tidak perlu menguji WCB secara meluas seperti MCB namun, pencirian WCB terhad diperlukan. Ujian berikut biasanya dilakukan pada WCB, tetapi senarai ini tidak termasuk:

  1. Pencirian fenotipik
  2. Pemetaan enzim sekatan
  3. Ujian kemandulan dan mikoplasma
  4. Menguji pengeluaran semula produk yang diinginkan

MCB dan WCB mesti disimpan dalam keadaan yang menjamin kestabilan genetik. Secara amnya, sel yang disimpan dalam nitrogen cecair atau fasa wapnya adalah stabil lebih lama daripada sel yang disimpan pada -70 C. Selain itu, adalah disyorkan agar MCB dan WCB disimpan di lebih daripada satu lokasi sekiranya peti sejuk beku tidak berfungsi.

  1. Sahkan bahawa prosedur bertulis menggambarkan dengan tepat apa yang diserahkan dalam dokumen permohonan. b. Tentukan bahawa rekod kumpulan mengikuti prosedur bertulis. c. Tentukan identiti dan kebolehkesanan MCB/WCB. d. Periksa keadaan penyimpanan di setiap lokasi. e. Periksa kebolehcapaian ke MCB dan WCB. Tentukan sama ada terdapat langkah keselamatan dan log akauntabiliti. f. Dokumentasikan mana-mana sampel MCB/WCB yang gagal memenuhi semua spesifikasi, terutamanya jika ia telah dikeluarkan untuk digunakan.

Bahan mentah yang digunakan untuk menyediakan media mesti dipilih dengan teliti untuk menyediakan kadar pertumbuhan yang betul dan nutrien penting untuk organisma yang menghasilkan produk yang diingini. Bahan mentah tidak boleh mengandungi komponen yang tidak diingini dan beracun yang dapat dibawa melalui kultur sel, fermentasi dan proses pemurnian ke produk siap. Air adalah komponen penting media dan kualiti air akan bergantung pada sistem rekombinan yang digunakan, fasa pembuatan dan penggunaan produk yang dimaksudkan. Bahan mentah yang dianggap serupa ketika dibekalkan oleh vendor yang berbeza harus memenuhi kriteria penerimaan sebelum digunakan. Selain itu, larian perintis berskala kecil diikuti dengan pengeluaran berskala penuh disyorkan apabila bahan mentah daripada vendor berbeza digunakan, untuk memastikan parameter pertumbuhan, hasil dan penulenan produk akhir kekal sama.

Kebanyakan kultur sel mamalia memerlukan serum untuk pertumbuhan. Sering kali, serum adalah sumber pencemaran oleh organisma yang tidak senang, terutama mikoplasma, dan syarikat mesti mengambil langkah berjaga-jaga untuk memastikan kemandulan serum. Sebilangan serum lembu Brazil (BBS) telah dicemari penyakit kuku dan mulut. Pastikan juga serum tersebut sememangnya serum lembu dan bukan berasal dari sumber manusia.

Terdapat kebimbangan tambahan bahawa serum lembu mungkin tercemar dengan agen bovine spongiform encephalopathy (BSE). BSE adalah penyakit lambat yang telah dikesan dalam kawanan dari United Kingdom. Oleh kerana tiada ujian in vitro yang sensitif untuk mengesan kehadiran agen ini, adalah penting bagi pengilang mengetahui sumber serum dan meminta pensijilan bahawa serum tidak datang dari kawasan di mana BSE adalah endemik. Sumber BSE berpotensi lain mungkin protease dan enzim lain yang diperoleh daripada sumber lembu. Pengilang produk biologi telah diminta untuk menentukan asal-usul bahan-bahan ini yang digunakan dalam pembuatan.

Media yang digunakan mesti disterilkan. Proses sterilized in place (SIP) atau sistem pensterilan berterusan (CSS) biasanya digunakan. Sebarang nutrien atau bahan kimia yang ditambahkan melebihi tahap ini mestilah steril. Saluran udara mesti termasuk penapis steril.

  1. Tentukan sumber serum.
  2. Sahkan bahawa kitaran pensterilan telah disahkan dengan betul untuk memastikan bahawa media akan menjadi steril.
  3. Sahkan bahawa semua bahan mentah telah diuji oleh kawalan kualiti. Tentukan asal semua bahan lembu.
  4. Dokumen kejadian di mana media gagal memenuhi semua spesifikasi.
  5. Sahkan bahawa bahan mentah yang telah tamat tempoh belum digunakan dalam pembuatan.
  6. Periksa bahawa media dan bahan tambahan lain telah disimpan dengan betul.

Operasi inokulasi, pemindahan, dan penuaian bioreaktor mesti dilakukan dengan menggunakan teknik aseptik yang disahkan. Penambahan atau pengeluaran dari bioreaktor industri secara amnya dilakukan melalui garis disterilkan wap dan pemasangan kunci wap. Stim boleh dibiarkan menyala dalam situasi yang mana pemanasan garisan atau dinding vesel bioreaktor tidak akan membahayakan kultur.

Adalah penting untuk sistem bioreaktor dipantau dengan teliti dan dikawal ketat untuk mencapai ekspresi yang betul dan cekap bagi produk yang dikehendaki. Parameter untuk proses penapaian mesti ditentukan dan dipantau. Ini termasuk: kadar pertumbuhan, pH, tahap sisa produk sampingan, kelikatan, penambahan bahan kimia, ketumpatan, pencampuran, pengudaraan, pembuahan, dll. Faktor lain yang boleh mempengaruhi produk siap termasuk daya ricih, haba yang dihasilkan proses, dan keberkesanan meterai dan gasket.

Banyak parameter pertumbuhan boleh mempengaruhi pengeluaran protein. Beberapa faktor ini boleh menjejaskan deamidasi, pembentukan isopeptida, atau pemprosesan proteolitik sel perumah. Walaupun media kekurangan nutrien digunakan sebagai mekanisme pemilihan dalam kes tertentu, kekurangan media dalam asid amino tertentu dapat menyebabkan penggantian. Contohnya, apabila E. coli kebuluran methionine dan/atau leucine semasa membesar, organisma akan mensintesis norleucine dan menggabungkannya dalam kedudukan yang biasanya diduduki oleh metionin, menghasilkan analog protein jenis liar. Kehadiran produk yang berkait rapat ini akan sukar untuk diasingkan secara kromatografi ini mungkin mempunyai implikasi baik untuk aplikasi spesifikasi keluaran dan untuk keberkesanan proses penulenan produk.

Program komputer yang digunakan untuk mengendalikan proses fermentasi, pembalakan data, dan pengurangan dan analisis data harus disahkan.

Sistem bioreaktor yang direka untuk mikroorganisma rekombinan memerlukan bukan sahaja budaya murni dipertahankan, tetapi juga kultur dapat terkandung dalam sistem. Pembendungan dapat dicapai dengan pilihan sistem host-vektor yang tepat yang kurang mampu bertahan di luar persekitaran makmal dan dengan cara fizikal, apabila hal ini dianggap perlu.

Penyemakan Lampiran K Garis Panduan NIH (1991) mencerminkan formalisasi amalan dan kemudahan pembendungan yang sesuai untuk menjalankan eksperimen berskala besar yang melibatkan mikroorganisma perindustrian yang berasal dari DNA. Lampiran K menggantikan bahagian Lampiran G apabila kuantiti melebihi 10 liter budaya terlibat dalam penyelidikan atau pengeluaran. Untuk penyelidikan atau pengeluaran berskala besar, empat tahap penahanan fizikal ditetapkan: GLSP, BL1-LS, BL2-LSand BL3-LS.

(Amalan Skala Besar yang Baik) tahap pembendungan fizikal disyorkan untuk penyelidikan pengeluaran berskala besar yang melibatkan strain rekombinan yang berdaya maju, bukan patogen dan bukan toksik yang berasal daripada organisma perumah yang mempunyai sejarah lanjutan atau penggunaan skala besar yang selamat. Tahap pembendungan fizikal GLSP disyorkan untuk organisma seperti organisma yang mempunyai batasan persekitaran yang memungkinkan pertumbuhan optimum dalam lingkungan skala besar tetapi kelangsungan hidup terhad tanpa kesan buruk di persekitaran.

(Tahap Biosafety 1 - Skala Besar) tahap pembendungan fizikal disyorkan untuk pencarian skala besar atau penghasilan organisma yang layak yang mengandungi molekul DNA rekombinan yang memerlukan penahanan BL1 pada skala makmal.

Tahap pembendungan fizikal diperlukan untuk penyelidikan berskala besar atau penghasilan organisma berdaya maju yang mengandungi molekul DNA rekombinan yang memerlukan pembendungan BL2 pada skala makmal.

Tahap pembendungan fizikal diperlukan untuk penyelidikan skala besar atau penghasilan organisma yang layak yang mengandungi molekul DNA rekombinan yang memerlukan penahanan BL3 pada skala makmal.

Tiada peruntukan dibuat pada masa ini untuk penyelidikan berskala besar atau penghasilan organisma berdaya maju yang mengandungi molekul DNA rekombinan yang memerlukan pembendungan BL4 pada skala makmal.

Seharusnya tiada organisma adventif dalam sistem semasa pertumbuhan sel. Organisma yang tercemar dalam bioreaktor boleh memberi kesan buruk terhadap hasil produk dan kemampuan proses hilir untuk memisahkan dan membersihkan protein yang diinginkan dengan betul. Kehadiran atau kesan organisma yang mencemari dalam bioreaktor boleh dikesan dalam beberapa cara -kadar pertumbuhan, ketulenan kultur, ujian bakteriofaj, dan profil asid lemak.

  1. Sahkan bahawa terdapat prosedur bertulis untuk memastikan ketiadaan ejen adventif dan kriteria yang ditetapkan untuk menolak larian tercemar.
  2. Kaji semula rekod pertumbuhan sel dan sahkan bahawa parameter jangka masa pengeluaran selaras dengan corak yang telah ditetapkan. c. Semak prosedur bertulis untuk menentukan penyiasatan dan tindakan pembetulan yang akan dilakukan sekiranya parameter pertumbuhan melebihi had yang ditetapkan.
  3. Kaji prosedur bertulis untuk menentukan penyelidikan dan tindakan pembetulan apa yang akan dilakukan sekiranya parameter pertumbuhan melebihi had yang ditetapkan.
  4. Pastikan teknik aseptik yang betul semasa sel in5. Pendekatan Pemeriksaan:
  5. Tentukan bahawa kawalan dalam proses yang sesuai digunakan sebelum pemprosesan selanjutnya.

PENGELUARAN ASET

Antibodi monoklonal boleh dihasilkan dalam kultur sel atau dalam perut tikus. Terdapat titik kritikal yang unik dalam pengeluaran ascites yang harus diperiksa.

    Jajahan Tetikus
      Pencirian dan Pengawalan Koloni Tetikus

    Pencirian dan kawalan koloni tikus yang digunakan untuk menghasilkan asites adalah kritikal. Jenis tetikus, sumber, vendor, dan pensijilan bahawa koloni bebas daripada penyakit virus perlu direkodkan. Haiwan yang digunakan dalam pengeluaran harus dikarantina dan diperiksa setiap hari selama jangka waktu seminggu untuk memastikan bahawa tikus tetap dalam keadaan sihat dan memenuhi semua kriteria penerimaan. Tikus mesti diperhatikan setiap hari semasa pengeluaran. Harus ada SOP yang ketat untuk membuang tetikus yang tidak tetap dalam keadaan sihat semasa karantina dan pengeluaran.

    Perhatian yang ketat terhadap tempat haiwan diperlukan untuk memastikan bahawa tikus tetap bebas dari penyakit, terutama virus yang biasanya menjangkiti koloni. Untuk mengelakkan pencemaran koloni yang ditempatkan di dalam bilik yang berbeza, adalah idea yang baik untuk orang ramai memakai sarung tangan pakai buang, kot makmal, penutup kepala dan but supaya barang-barang ini boleh ditukar sebelum memasuki bilik lain. Tempat dan kandang haiwan mesti dijaga dalam keadaan kebersihan.

    Tikus individu mesti dikenal pasti supaya rekod bilangan kali tetikus diketuk dan jumlah cecair yang diperoleh daripada setiap paip dapat dikekalkan dengan tepat.

    Suntikan tikus dan penyingkiran cairan ascites harus dilakukan di persekitaran yang bersih seperti di bawah tudung sehala atau di stesen yang akan melindungi tikus dari agen berjangkit. Harus ada prosedur tertulis yang menerangkan proses mengetuk. Jarum yang berbeza untuk setiap tetikus disyorkan untuk mengelakkan kemungkinan menularkan jangkitan daripada tikus lain. Terdapat juga prosedur tertulis untuk menangani jarum dengan kepatuhan ketat terhadap biohazardous untuk mengelakkan pencemaran silang.

    Di samping itu, perlu ada prosedur bertulis yang menerangkan suhu dan keadaan penyimpanan sebelum diproses. Ini termasuk menetapkan had masa pengumpulan dan pemprosesan. Pengumpulan askit dapat diterima, tetapi harus ada prosedur tertulis yang menerangkan bagaimana kolam dibuat (berapa banyak dan tikus mana yang membentuk kolam) dan catatan mesti menggambarkan dengan tepat apa yang membentuk kolam itu. Oleh itu, jika didapati bahawa seekor haiwan dijangkiti, catatan akan mencerminkan kolam mana yang berisi cairan asites haiwan yang dijangkiti.

    Pristane kadang-kadang digunakan untuk menjinakkan tikus dan meningkatkan pengeluaran asites. Untuk produk parenteral, syarikat mesti menunjukkan bahawa proses pemurnian akan menghilangkan pristane. Perkara ini seharusnya tidak membimbangkan produk yang digunakan dalam alat diagnostik in vitro.

    1. Semak SOP untuk memastikan kawalan yang mencukupi untuk mengkuarantin dan menerima tikus, menempatkan dan menjaga tikus, pengecaman tikus, mengekalkan persekitaran yang bersih untuk mencegah jangkitan virus koloni, membuang tikus yang tidak sihat, dan pemprosesan cecair asites.
    2. Mengkaji rekod untuk memastikan bahawa haiwan dalam keadaan sihat dan diperhatikan setiap hari selama tempoh dan pengeluaran karantina.
    3. Sahkan kehadiran kakitangan penjagaan haiwan yang berkelayakan.

    EKSTRAK, PENGISOLAN DAN PEMBELIAN

    Setelah proses penapaian selesai, produk yang dikehendaki diasingkan, dan jika perlu, dilipat semula untuk memulihkan integriti konfigurasi, dan disucikan. Untuk pemulihan protein intraselular, sel mesti terganggu setelah penapaian. Ini dilakukan dengan kaedah kimia, enzimatik atau fizikal. Selepas gangguan, serpihan selular dapat dikeluarkan dengan sentrifugasi atau penapisan. Untuk pemulihan protein ekstraselular, pemisahan utama produk daripada menghasilkan organisma dicapai dengan sentrifugasi atau penapisan membran. Kaedah pengasingan awal, seperti pemendakan ammonium sulfat dan pengasingan dua fasa berair, boleh digunakan berikutan pengemparan untuk menumpukan produk. Langkah-langkah pemurnian selanjutnya melibatkan kaedah kromatografi untuk menghilangkan kekotoran dan mendekatkan produk dengan spesifikasi akhir.

    1. Pengekstrakan dan Pengasingan
      1. Penapisan -Ultrafiltrasi biasanya digunakan untuk mengeluarkan produk yang diinginkan dari serpihan sel. Keliangan saringan membran dikalibrasi ke berat molekul tertentu, yang membolehkan molekul di bawah berat itu melaluinya sambil mengekalkan molekul di atas berat tersebut.
      2. Sentrifugasi -Sentrifugasi boleh dibuka atau ditutup. Kecukupan persekitaran mesti dinilai untuk sentrifugasi terbuka.
      1. Kromatografi Perkaitan
      2. Kromatografi Pertukaran Ion (IEC)
      3. Penapisan gel
      4. Kromatografi Interaksi Hidrofobik (HIC)
      5. HPLC Fasa Berbalik

      Semua langkah pemisahan dan pemurnian harus dijelaskan secara terperinci dan disajikan dengan carta alir. Penerangan dan spesifikasi yang mencukupi harus diberikan untuk semua peralatan, tiang, reagen, penyangga dan hasil yang diharapkan. Sekiranya berkenaan, prosedur bertulis harus dibandingkan dengan dokumen permohonan yang diserahkan kepada Agensi. Keadaan penyimpanan dalam proses dan ujian kawalan kualiti harus dikaji semula.

      FDA menetapkan pengesahan proses pada Mei 1987 "Garis Panduan Prinsip Umum Pengesahan Proses" seperti berikut:

      Pengesahan -menentukan bukti yang didokumentasikan yang memberikan jaminan yang tinggi bahawa proses tertentu akan menghasilkan produk secara konsisten yang memenuhi spesifikasi dan atribut kualiti yang telah ditentukan.

      Kami mengharapkan untuk melihat dokumentasi yang mewajarkan proses dan menunjukkan bahawa proses itu berfungsi secara konsisten. Untuk produk biologi, semua data pengesahan diserahkan dan disemak dan spesifikasi ditetapkan dan diluluskan sebagai sebahagian daripada permohonan pelesenan produk (PLA).

      Pengilang harus mempunyai laporan pengesahan untuk pelbagai langkah proses utama. Sebagai contoh, jika lajur pertukaran ion digunakan untuk membuang endotoksin, harus ada data yang mendokumentasikan bahawa proses ini berkesan secara konsisten. Dengan menentukan tahap endotoksin sebelum dan selepas pemprosesan, pengilang harus dapat menunjukkan kesahihan proses ini. Penting untuk memantau proses sebelum, semasa, dan setelahnya untuk menentukan kecekapan setiap langkah pemurnian kunci. "Membuang" penyediaan dengan jumlah bahan cemar yang diketahui untuk menunjukkan penyingkirannya mungkin merupakan kaedah yang berguna untuk mengesahkan prosedur.

      Biasanya, pengeluar mengembangkan proses pemurnian dalam skala kecil dan menentukan keberkesanan langkah pemprosesan tertentu. Semasa peningkatan skala dilakukan, peruntukan mesti dibuat untuk beberapa perbezaan jika dibandingkan dengan operasi skala makmal. Masa pemprosesan yang lebih lama boleh mempengaruhi kualiti produk dengan teruk, kerana produk terdedah kepada keadaan penyangga dan suhu untuk jangka masa yang lebih lama. Kestabilan produk, di bawah keadaan penulenan, mesti ditakrifkan dengan teliti. Pengilang harus menentukan batasan dan keberkesanan langkah tertentu. Pengesahan proses pada kelompok saiz pengeluaran kemudiannya akan membandingkan kesan peningkatan skala. Pengilang kadangkala boleh menggunakan data pembangunan pada skala kecil untuk pengesahan. Walau bagaimanapun, adalah penting bahawa pengesahan dilakukan pada kelompok saiz pengeluaran.

      Pengesahan proses dan/atau laporan untuk pengesahan beberapa proses penulenan hendaklah dikaji semula. Selain itu, kawalan dan ujian yang digunakan untuk memastikan konsistensi proses juga harus dikaji semula.

      Selalunya lajur dibuat semula untuk membolehkan penggunaan berulang. Prosedur pengesahan yang betul perlu dilakukan dan proses itu perlu dipantau secara berkala untuk pencemaran kimia dan mikrob.

      Pengilang kadang-kadang menolak produk tersebut selepas proses pemurnian. Seperti produk terkawal lain, diharapkan laporan penyiasatan lengkap dan berkaitan dengan kumpulan lain. Sebagai contoh, semasa satu pemeriksaan diperhatikan bahawa kira-kira enam kelompok BDP telah ditolak kerana potensi rendah dan tahap kekotoran yang tinggi. Masalahnya disebabkan oleh lajur dan semua kumpulan yang diproses di lajur ditolak. Perlu diingatkan bahawa mana-mana spesifikasi kumpulan yang gagal harus disiasat.

      Oleh itu, penting untuk mengenal pasti produk yang rosak supaya sistem pembuatan dan kawalan khusus dapat diberi liputan pemeriksaan yang lebih terperinci.

      Kualiti air harus bergantung pada tujuan penggunaan produk siap. Sebagai contoh, CBER memerlukan kualiti Air untuk Suntikan (WFI) untuk air proses. Sebaliknya, untuk diagnostik in-vitro air yang disucikan mungkin mencukupi. Untuk ubat, kualiti air yang diperlukan bergantung pada prosesnya. Juga, kerana pemprosesan biasanya berlaku sejuk atau pada suhu bilik, pembersihan diri sistem WFI panas pada suhu 75 hingga 80 C hilang.

      Atas sebab ekonomi, banyak syarikat bioteknologi mengeluarkan WFI melalui osmosis terbalik dan bukannya penyulingan. Kebanyakan sistem ini didapati tercemar. Biasanya, mereka menggunakan tangki plastik (PVC) dan tangki simpanan tidak tertutup, yang sukar dibersihkan. Sebarang benang atau titisan dalam sistem sejuk menyediakan kawasan di mana mikroorganisma boleh bersendi dan membiak. Beberapa sistem menggunakan penapis sterilisasi terminal. Walau bagaimanapun, perhatian utama adalah endotoksin, dan penapis terminal hanya berfungsi untuk menutupi kualiti sebenar WFI yang digunakan. Batasan bergantung pada sampel 0.1 ml WFI untuk endotoksin dari sistem juga harus diakui. Sistem ini harus dirancang untuk memberikan air dengan kemurnian tinggi, dengan sampel hanya berfungsi untuk memastikan bahawa ia beroperasi dengan baik. Seperti sistem WFI lain, jika air WFI sejuk diperlukan, penukar haba tempat guna boleh digunakan.

      Penampan boleh dihasilkan sebagai larutan steril, bukan pirogenik dan disimpan dalam bekas steril. Beberapa kemudahan yang lebih kecil telah membeli penyelesaian penimbal steril dan bukan pirogenik komersial.

      Pengeluaran dan/atau penyimpanan air tidak steril yang mungkin gred reagen atau digunakan sebagai penimbal hendaklah dinilai dari kedua-dua aspek kestabilan dan mikrobiologi.

      Sistem WFI untuk BDP adalah sama dengan sistem WFI untuk produk terkawal lain. Seperti produk sensitif panas yang lain, WFI sejuk digunakan untuk formulasi. Sistem sejuk terdedah kepada pencemaran. WFI sejuk mesti dipantau baik untuk endotoksin dan mikroorganisma. Data pengesahan dan laporan pemantauan harus dikaji semula.

      Mutu mikrobiologi persekitaran semasa pelbagai langkah pemprosesan menjadi perhatian. Ketika proses ini terus berjalan ke hilir, pertimbangan yang lebih tinggi harus diberikan kepada kawalan dan pemantauan lingkungan. Persekitaran dan kawasan yang digunakan untuk pengasingan BDP juga harus dikendalikan untuk meminimumkan mikrobiologi dan pencemaran asing lainnya. Pengasingan khas BDP harus sama dengan lingkungan yang digunakan untuk perumusan larutan sebelum pensterilan dan pengisian.

      PROSEDUR PEMBERSIHAN

      Pengesahan prosedur pembersihan untuk pemprosesan peralatan, termasuk lajur, harus dijalankan. Ini sangat penting untuk kemudahan berbilang produk. Pengilang semestinya telah menentukan tahap keberkesanan prosedur pembersihan bagi setiap BDP atau perantaraan yang digunakan dalam peralatan tersebut.

      Data pengesahan harus mengesahkan bahawa proses pembersihan akan mengurangkan sisa tertentu ke tahap yang boleh diterima. Walau bagaimanapun, ia mungkin tidak mungkin untuk mengalih keluar secara mutlak setiap kesan bahan, walaupun dengan bilangan kitaran pembersihan yang munasabah. Tahap residu yang dibenarkan, umumnya dinyatakan dalam bahagian per juta (ppm), harus dibenarkan oleh pengilang. Pembersihan harus menyingkirkan endotoksin, bakteria, unsur toksik, dan protein yang mencemari, sementara tidak mempengaruhi prestasi lajur. Liputan pemeriksaan khusus untuk pembersihan hendaklah termasuk:

        Prosedur Pembersihan Terperinci

      Perlu ada prosedur pembersihan peralatan bertulis yang memberikan butiran tentang perkara yang perlu dilakukan dan bahan yang akan digunakan. Sesetengah pengeluar menyenaraikan pelarut khusus untuk setiap BDP dan perantaraan.

      Untuk kapal pegun, selalunya peralatan bersih-di-tempat (CIP) mungkin ditemui. Untuk penilaian sistem ini, diagram diperlukan, bersama dengan pengenalpastian injap tertentu.

      Selepas pembersihan, harus ada beberapa ujian rutin untuk memastikan permukaannya telah dibersihkan ke tahap yang disahkan. Salah satu kaedah yang biasa adalah analisis air bilas akhir atau pelarut untuk kehadiran agen pembersih yang terakhir digunakan pada peralatan tersebut. Selalu ada penentuan langsung bahan sisa.

      Sebahagian dari jawapan untuk pertanyaan, "seberapa bersih itu bersih?", Adalah, "seberapa baik sistem analisis anda?" Kepekaan radas analitik moden telah menurunkan beberapa ambang pengesanan di bawah bahagian per juta (ppm), turun kepada bahagian per bilion (ppb).

      Had residu yang ditetapkan untuk setiap bahagian alat harus praktikal, dapat dicapai, dan dapat disahkan. Apabila menyemak had ini, pastikan rasional untuk penubuhan pada tahap itu. Pengilang harus dapat mendokumentasikan, melalui data, bahawa tahap sisa yang dibenarkan mempunyai asas yang saintifik.

      Faktor lain yang perlu dipertimbangkan adalah kemungkinan pengedaran residu yang tidak seragam pada sekeping peralatan. Purata kepekatan residu sebenar mungkin melebihi tahap yang dikesan.

      MEMPROSES DAN MENGISI

      Sebilangan besar BDP tidak dapat disterilkan secara terminal dan mesti dibuat dengan pemprosesan aseptik. Kehadiran bahan cemar berkaitan proses dalam produk atau peranti adalah terutamanya isu keselamatan. Sumber pencemaran terutamanya adalah substrat sel (DNA, protein sel inang, dan konstituen selular lain, virus), media (protein, sera, dan aditif) dan proses pemurnian (bahan kimia yang berkaitan dengan proses, dan kekotoran yang berkaitan dengan produk).

      Kerana pertimbangan kestabilan, kebanyakan BDP adalah sama ada disejukkan atau diliofilkan. Suhu rendah dan kandungan lembapan yang rendah juga merupakan penghalang kepada percambahan mikrobiologi. Untuk pengesahan pemprosesan aseptik biofarmaseutikal dosis tunggal yang tidak diawetkan (yang diisi secara aseptik) yang disimpan pada suhu bilik sebagai penyelesaian, batasan kadar pencemaran pengisian media 0.1% harus diakui.

      Data pengisian media dan pengesahan proses pembuatan aseptik harus dikaji semula semasa pemeriksaan. Sebilangan BDP mungkin tidak terlalu stabil dan mungkin memerlukan pencampuran dan pemprosesan yang lembut. Walaupun penapisan berganda agak biasa untuk parenteral yang diisi secara aseptik, penapisan tunggal pada tekanan rendah biasanya dilakukan untuk BDP. Atas sebab inilah arahan pembuatan adalah khusus, dengan tekanan penapisan maksimum diberikan.

      Pemeriksaan harus merangkumi tinjauan arahan pembuatan dalam rekod kumpulan untuk memastikan bahawa mereka lengkap dan spesifik.

      Persekitaran dan kebolehcapaian untuk kumpulan BDP tidak steril harus dikawal. Kerana banyak produk ini kekurangan bahan pengawet, bakteriostatik, atau aktiviti fungistatik, bioburden sebelum pensterilan mestilah rendah dan bioburden harus ditentukan sebelum pensterilan larutan pukal ini dan sebelum diisi. Jelas, pengelompokan atau penyebatian larutan pukal ini harus dikendalikan untuk mencegah peningkatan potensi tahap mikrobiologi yang mungkin terjadi sehingga larutan pukal disaring (disterilkan). Satu masalah dengan tahap mikrobiologi adalah kemungkinan peningkatan endotoksin yang mungkin berkembang. Amalan yang baik untuk pengkompaunan produk ini juga akan termasuk batching dalam persekitaran terkawal dan dalam tangki tertutup, terutamanya jika larutan itu akan disimpan sebelum pensterilan. Amalan yang baik juga merangkumi batasan jangka masa pembuatan antara formulasi dan pensterilan.

      Ujian dalam proses adalah bahagian penting dalam kawalan kualiti dan memastikan bahawa prestasi sebenar, masa nyata sesuatu operasi boleh diterima. Contoh kawalan dalam proses adalah: parameter aliran, profil kromatografi, spesies protein dan kepekatan protein, bioaktiviti, bioburden, dan tahap endotoksin. Kumpulan kawalan dalam proses ini dan pemilihan kriteria penerimaan memerlukan penyelarasan dengan hasil dari program pengesahan.

      Pengisian BDP ke dalam ampul atau botol mengandungi banyak masalah yang sama dengan pemprosesan produk konvensional. Di syarikat yang ditubuhkan, isu-isu ini agak biasa. Namun, untuk kemudahan BDP yang baru, usaha untuk mengembangkan dan membuktikan keberkesanan dan keselamatan klinikal bersama dengan pengesahan operasi, peralatan dan sistem steril, boleh menjadi proses yang panjang, terutama jika keperluan tidak difahami dengan jelas.

      Saiz kelompok BDP, sekurang-kurangnya pada mulanya dihasilkan, berkemungkinan kecil. Oleh kerana saiz kelompok yang kecil, garisan pengisian mungkin tidak automatik seperti produk lain yang biasanya diisi dalam kuantiti yang lebih besar. Oleh itu, terdapat lebih banyak penglibatan orang yang mengisi produk ini, terutamanya di beberapa syarikat yang lebih kecil dan lebih baru.

      Masalah yang telah dikenal pasti semasa pengisian termasuk program pemantauan persekitaran kekurangan pakaian yang tidak mencukupi untuk menghentikan penggunaan botol, terutamanya yang perlu diliofilisasi dan kegagalan untuk mengesahkan beberapa proses pensterilan asas. Oleh kerana penglibatan aktif orang dalam pengisian dan manipulasi aseptik, bilangan orang yang terlibat dalam operasi ini harus diminimumkan, dan program alam sekitar harus termasuk penilaian sampel mikrobiologi yang diambil daripada orang yang bekerja di kawasan pemprosesan aseptik. Program ini bersama dengan data harus dikaji semula semasa pemeriksaan.

      Keprihatinan lain mengenai kestabilan produk adalah penggunaan gas lengai untuk menggantikan oksigen semasa proses dan pengisian larutan. Seperti produk lain yang mungkin sensitif terhadap pengoksidaan, had untuk tahap oksigen terlarut untuk larutan harus ditetapkan. Begitu juga, pengesahan operasi pengisian harus merangkumi parameter seperti kelajuan saluran dan lokasi jarum suntikan berkenaan dengan penutupan, untuk memastikan pendedahan minimum kepada udara (oksigen) untuk produk sensitif oksigen. Sekiranya tiada anjakan gas lengai, pengilang harus dapat menunjukkan bahawa produk tidak terjejas oleh oksigen. Data ini boleh disemak semasa pemeriksaan (Data ini dinilai sebagai sebahagian daripada semakan Permohonan Pelesenan Produk (PLA)).

      Biasanya, botol yang akan diliofilisasi sebahagiannya dihentikan oleh mesin. Walau bagaimanapun, beberapa garisan pengisian telah diperhatikan yang menggunakan operator untuk meletakkan setiap penyumbat di atas vial dengan tangan. Kebimbangan adalah saluran segera pencemaran yang ditawarkan oleh pengendali. Pemerhatian pengendali dan tinjauan aktif operasi pengisian harus dilakukan.

      Keprihatinan utama lain dengan pengisian produk lyophilized adalah jaminan jumlah isi. Jelas sekali, isian yang rendah akan mewakili subpotensi dalam vial. Tidak seperti isian serbuk atau cecair, isian yang rendah tidak akan kelihatan dengan mudah selepas liofilisasi, terutamanya untuk produk yang bahan aktifnya mungkin hanya satu miligram. Oleh kerana kepentingan klinikal, subpotensi dalam botol berpotensi boleh menjadi situasi yang sangat serius, secara klinikal.

      Sekali lagi, pemeriksaan harus merangkumi pemerhatian dan tinjauan operasi pengisian, tidak hanya mengenai amalan aseptik, tetapi juga untuk keseragaman pengisian.

      Banyak produk yang diliofilkan untuk kebimbangan kestabilan. Malangnya, aspek GMP bagi reka bentuk lyophilizers telah ketinggalan daripada teknologi pensterilan dan kawalan yang digunakan untuk peralatan pemprosesan lain. Tidak hairanlah banyak masalah dengan proses lyophilization telah dikenalpasti.

      Masalah-masalah ini tidak terhad kepada BDP tetapi umumnya berkaitan dengan lyophilization semua produk termasuk BDP. Perbincangan terperinci mengenai lofofilisasi dan kawalan boleh didapati di Panduan Teknikal Pemeriksaan No. 43, yang dikeluarkan pada 18/4/86.

      KAWALAN MAKMAL

      Semasa pemeriksaan kemudahan makmal firma, bidang berikut hendaklah dikaji semula dan sebarang kekurangan hendaklah didokumenkan:

      Kakitangan makmal harus dilatih dengan secukupnya untuk pekerjaan yang mereka laksanakan.

      Firma harus mempunyai dokumentasi dan jadual untuk penyelenggaraan, penentukuran, dan pemantauan peralatan makmal yang terlibat dalam pengukuran, pengujian dan penyimpanan bahan mentah, produk, sampel dan reagen rujukan.

      Semua kaedah makmal hendaklah disahkan dengan peralatan dan reagen yang dinyatakan dalam kaedah ujian. Perubahan vendor dan / atau spesifikasi peralatan / reagen utama memerlukan pengesahan semula.

      Firma harus mempunyai data mentah untuk menyokong parameter pengesahan dalam permohonan yang diserahkan.

      Piawaian rujukan harus dicirikan dan didokumentasikan dengan baik, disimpan dengan betul, dilindungi, dan digunakan selama pengujian.

      Kultur dan reagen makmal, seperti enzim, antibodi, reagen ujian, dsb., boleh merosot jika tidak disimpan dalam keadaan penyimpanan yang betul.

      Prosedur hendaklah ditulis, terpakai dan diikuti. Sampel kawalan kualiti harus diasingkan dan disimpan dengan betul.

      Ujian berikut mungkin berlaku untuk pengujian komponen, dalam proses, pukal dan / atau produk akhir. Ujian yang diperlukan akan bergantung pada proses dan tujuan penggunaan produk.

      Pencemaran Pyrogen - Ujian pyrogenicity harus dilakukan dengan suntikan arnab dengan produk akhir atau dengan ujian limulus amebocyte lysate (LAL). Kriteria yang sama digunakan untuk penerimaan produk semula jadi harus digunakan untuk produk bioteknologi.

      Kehadiran endotoksin dalam beberapa produk diagnostik in vitro boleh mengganggu prestasi peranti. Juga, adalah penting bahawa produk in vivo diuji untuk pirogen. Farmaseutikal biologi tertentu bersifat pirogenik pada manusia walaupun telah lulus ujian LAL dan ujian pirogen arnab. Fenomena ini mungkin disebabkan oleh bahan yang kelihatan seperti pirogenik hanya pada manusia. Untuk mencuba untuk meramalkan sama ada subjek manusia akan mengalami tindak balas pirogenik, ujian pirogen endogen digunakan. Sel mononuklear darah manusia dibiakkan secara in vitro dengan produk akhir, dan cecair kultur sel disuntik ke dalam arnab. Demam pada arnab menunjukkan bahawa produk tersebut mengandungi bahan yang mungkin bersifat pyrogenic pada manusia.

      Ujian yang mungkin dihadapi:

      Pencemaran Virus - Ujian untuk pencemaran virus hendaklah sesuai dengan substrat sel dan keadaan kultur yang digunakan. Ketiadaan virus adventif yang boleh dikesan mencemari produk akhir harus ditunjukkan.

      Ujian yang mungkin dihadapi:

      Pencemaran Asid Nukleik - Kebimbangan mengenai kekotoran asid nukleik timbul daripada kemungkinan kejadian transformasi sel pada seorang penerima. Penyingkiran asid nukleik pada setiap langkah dalam proses pemurnian dapat ditunjukkan dalam percubaan percubaan dengan memeriksa sejauh mana penghapusan DNA sel inang tambahan. Analisis sedemikian akan memberikan sejauh mana tahap teori penyingkiran asid nukleik semasa pemurnian.

      Analisis langsung asid nukleik dalam beberapa lot pengeluaran produk akhir harus dilakukan dengan analisis hibridisasi asid nukleik mencemarkan immobilized menggunakan probe yang sesuai, seperti sel inang yang diterjemahkan dan DNA vektor. Kebimbangan teori mengenai mengubah DNA yang berasal dari substrat sel akan dikurangkan dengan pengurangan amnya asid nukleik yang mencemarkan.

      Ujian yang mungkin dihadapi untuk protein yang berkaitan dengan produk:

      Ujian yang mungkin dihadapi untuk protein asing:

      Pencemaran Mikrob - Ujian yang sesuai hendaklah dijalankan untuk pencemaran mikrob yang menunjukkan ketiadaan bakteria yang boleh dikesan (aerob dan anaerob), kulat, yis dan mikoplasma, apabila berkenaan.

      Ujian yang mungkin dihadapi:

      Bahan Pencemar Kimia - Sumber pencemaran lain mesti dipertimbangkan, cth., alergen, minyak petroleum, sisa pelarut, bahan pembersih, bahan boleh larut lesap, dsb.

      1. Kualiti
        1. Warna/Penampilan/Kejelasan
        2. Analisis Zarah
        3. Penentuan pH
        4. Kandungan lembapan
        5. DNA Sel Hos

        Satu ujian identiti mungkin tidak mencukupi. Pengesahan diperlukan bahawa kaedah yang digunakan disahkan. Ketersediaan bahan rujukan hendaklah disemak. Perbandingan produk dengan penyediaan rujukan dalam bioassay yang sesuai akan memberikan bukti tambahan yang berkaitan dengan identiti dan potensi produk.

        Ujian yang mungkin dihadapi:

        1. Pemetaan Peptida (dikurangkan / tidak dikurangkan)
        2. Elektroforesis Gel
          • HALAMAN SDS
          • Pemfokusan Isoelektrik (IEF)
          • Immunoelectrophoresis
        3. Elektroforesis 2 Dimensi
        4. Elektroforesis Kapilari
        5. HPLC (Pengekalan Kromografi)
          • Imunosassay
          • ELISA
          • Penghapusan Barat
          • Radioimmunoassay
        6. Analisis Asid Amino
        7. Penjujukan Asid Amino
        8. Spektroskopi Jisim
        9. Berat Molekul (SDS PAGE)
        10. Analisis Komposisi Karbohidrat (glikosilasi)

        Ujian yang mungkin dihadapi:

        • Kuantiti Protein
        • Lowry
        • Kaedah Biuret
        • Spektrofotometri UV
        • HPLC
        • Analisis Asid Amino
        • * Analisis Urutan Separa

        "Kemurnian" bermaksud kebebasan relatif daripada bahan luar dalam produk siap, sama ada berbahaya atau tidak kepada penerima atau merosakkan produk. Kesucian merangkumi, tetapi tidak terbatas pada, kebebasan relatif dari sisa kelembapan atau bahan mudah menguap dan bahan pirogenik yang lain. Kekotoran protein adalah bahan cemar yang paling biasa. Ini mungkin timbul daripada proses penapaian, media atau organisma perumah. Retrovirus endogen mungkin terdapat pada hybridoma yang digunakan untuk pengeluaran antibodi monoklonal. Ujian khusus untuk penyusun ini sangat mustahak dalam produk in vivo.Penyingkiran protein antigen luar adalah penting untuk memastikan keselamatan dan keberkesanan produk.

        Ujian yang mungkin dihadapi:

        1. Ujian untuk Kekotoran Protein:
          1. Elektroforesis
            • HALAMAN SDS
            • IEF
            • Elektroforesis 2 Dimensi
          2. Pemetaan Peptida
          3. ELISA Multiantigen
          4. Pengecualian Saiz HPLC HPLC Fasa Terbalik HPLC
          1. Hibridisasi DNA
          2. HPLC
          3. Ujian Pyrogen / Endotoxin
            • U.S.P. Ujian Pirogen Arnab
            • Limulus Amebocyte Lysate (LAL) E
            • Ujian Pyrogen ndogenous
          • U.S.P. Ujian Pirogen Arnab
          • Limulus Amebosit Lysate (LAL)
          • Uji Pyrogen Endogen
          • Kesan sitopatik dalam beberapa jenis sel
          • Ujian Telur Berembrio Heabsorption
          • Tindak balas Rantaian Polimerase (PCR)
          • Antigen Viral dan Antibodi Immunoassay
          • Pengeluaran Antibodi Tetikus (PET)
          • Hibridisasi DNA (Dot Blot)
          • Reaksi Rantai Polimerase (PCR)
          • HALAMAN SDS
          • PLC
          • IEF
          • Imunoassays
          • Radioimmunoassays
          • ELISA
          • Penghapusan Barat
          • Halaman SDS
          • Elektroforesis 2 Dimensi
          • U.S.P. Ujian Kemandulan
          • Kiraan Plat Heterotrofik dan Jumlah Ragi dan Acuan
          • Jumlah Kiraan Plat
          • Ujian Mycoplasma
          • LAL / Pirogen

          "Potensi" ditafsirkan sebagai kemampuan atau kapasitas spesifik produk, seperti yang ditunjukkan oleh ujian makmal yang sesuai atau dengan data klinikal terkawal yang diperoleh melalui pemberian produk dengan cara yang dimaksudkan, untuk menghasilkan hasil yang diberikan. Ujian untuk potensi harus terdiri daripada ujian in vitro atau in vivo, atau kedua-duanya, yang telah dirancang khusus untuk setiap produk untuk menunjukkan potensi. Persediaan rujukan untuk aktiviti biologi harus diwujudkan dan digunakan untuk menentukan bioaktiviti produk akhir. Catatan: Sekiranya berlaku, piawaian potensi biologi dalaman harus dirujuk silang terhadap antarabangsa (Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO), Institut Piawai dan Kawalan Biologi Nasional (NIBSC)) atau nasional (Institut Kesihatan Nasional (NIH), Kanser Nasional Persediaan standard rujukan Institut (NCI), Pentadbiran Makanan dan Dadah (FDA) atau piawaian USP.

          Ujian yang mungkin dihadapi:

          1. Kaedah penentuan potensi yang disahkan
            • Bioassay Seluruh Haiwan
            • Bioassay Kultur Sel
            • Ujian Biokimia / Biofizik
            • Imunoassass berdasarkan reseptor
          2. Had Potensi
          3. Pengenalpastian agen yang boleh menjejaskan potensi
          4. Penilaian aktiviti fungsional dan kekhususan antigen / antibodi
            • Pelbagai kaedah imunodiffusion (tunggal / berganda)
            • Immunoblotting / Radio-atau Enzim yang berkaitan dengan Immunoassays
          5. HPLC-disahkan untuk menghubungkan puncak tertentu dengan aktiviti biologi

          "Kestabilan" ialah kapasiti produk untuk kekal dalam spesifikasi yang ditetapkan untuk memastikan identiti, kekuatan, kualiti, ketulenan, keselamatan dan keberkesanannya sebagai fungsi masa. Kajian untuk menyokong tempoh temu janji yang dicadangkan harus dilakukan pada produk akhir. Data kestabilan masa nyata adalah penting untuk menyokong tempoh janji temu yang dicadangkan. Pengujian mungkin merangkumi kestabilan potensi, pH, kejelasan, warna, zarah, kestabilan fisiokimia, kelembapan dan pengawet. Data ujian kestabilan dipercepat dapat digunakan sebagai data sokongan. Ujian dipercepat atau ujian tekanan adalah kajian yang dirancang untuk meningkatkan nisbah kemerosotan kimia atau fizikal suatu bahan atau produk dengan menggunakan keadaan penyimpanan yang berlebihan. Tujuannya adalah untuk menentukan parameter kinetik untuk meramalkan tentatif jangka masa tamat. Uji tekanan produk sering digunakan untuk mengenal pasti masalah yang mungkin dihadapi semasa penyimpanan dan pengangkutan dan untuk memberikan anggaran jangka masa tamat tempoh. Ini harus merangkumi kajian mengenai kesan turun naik suhu yang sesuai untuk keadaan penghantaran dan penyimpanan. Ujian ini harus menetapkan tempoh temu janji yang sah dalam keadaan lapangan yang realistik dengan bekas dan penutup yang dimaksudkan untuk produk yang dipasarkan.

          Sebilangan protein bioteknologi yang agak rapuh mungkin memerlukan pencampuran dan pemprosesan yang lembut dan hanya satu penapisan pada tekanan rendah. Arahan pembuatan mesti khusus dengan tekanan penapisan maksimum yang diberikan untuk menjaga kestabilan dalam produk akhir. Produk yang mengandungi bahan pengawet untuk mengawal pencemaran mikroba harus dipantau kandungan pengawetnya. Ini boleh dicapai dengan melakukan ujian cabaran mikrob (iaitu Ujian Keberkesanan Pengawet Antimikrob U.S.P.) atau dengan melakukan ujian kimia untuk pengawet. Kawasan yang harus diberi perhatian adalah:

          • Pemantauan berkesan terhadap persekitaran ujian kestabilan (iaitu cahaya, suhu, kelembapan, sisa kelembapan)
          • Sistem penampung / penutupan yang digunakan untuk penyimpanan pukal (contohnya dapat diekstraksi, pengubahsuaian kimia protein, perubahan formulasi penyumbat yang dapat mengubah profil yang dapat diekstrak)
          • Kenal pasti bahan yang boleh menyebabkan ketidakstabilan produk dan uji kehadiran agregasi, denaturasi, fragmentasi, penyahbauan, fotolisis, dan pengoksidaan
          • Ujian untuk menentukan agregat atau produk degradasi.

          Ujian yang mungkin dihadapi:

          1. HALAMAN SDS
          2. IEF
          3. HPLC
          4. Kromatografi Pertukaran Ion
          5. Penapisan Gel
          6. Pemetaan Peptida
          7. Kaedah Spektrofotometri
          8. Pengujian Potensi
          9. Ujian Prestasi
          10. Elektroforesis 2 Dimensi

          Kriteria asas untuk menentukan bahawa pengilang menghasilkan produk yang standard dan boleh dipercayai ialah demonstrasi ketekalan lot-ke-lot berkenaan dengan spesifikasi keluaran tertentu yang telah ditetapkan.

          • Keseragaman: identiti, kesucian, aktiviti berfungsi
          • Kestabilan: prestasi yang boleh diterima semasa jangka hayat, ketepatan, kepekaan, kekhususan

          PERLAKSANAAN ALAM SEKITAR

          Liputan persekitaran / biocontainment untuk kemudahan bioteknologi harus dilakukan sebagai bagian dari pemeriksaan GMP biasa, terutama pemeriksaan pra-persetujuan atau pra-perlesenan. FDA bertanggungjawab di bawah National Policy Policy Act (NEPA) untuk memastikan kesan persekitaran yang mungkin berlaku akibat pembuatan, penggunaan, dan pelupusan produk yang diatur oleh FDA. Tiada agensi kawal selia persekutuan atau negeri lain boleh dimaklumkan oleh FDA tentang kewujudan permohonan produk yang tidak diluluskan. Oleh itu, FDA juga mesti memastikan bahawa penaja produk menjalankan siasatan dengan selamat.

            Penilaian Alam Sekitar

          Biasanya, penaja produk menerangkan langkah-langkah kawalan persekitaran dalam penilaian persekitaran (EA) yang merupakan sebahagian daripada aplikasi produk. Apabila produk diluluskan, EA akan dikeluarkan kepada umum. FDA mesti dapat mengesahkan ketepatan dan kesesuaian maklumat yang terkandung dalam EA. Penyiasat harus mempunyai salinan penilaian persekitaran syarikat, yang menangani pembuatan produk yang menjadi subjek pemeriksaan GMP. EA harus diminta dari pejabat asal jika belum disediakan.

          1. Kaji Garis Panduan NIH untuk Penyelidikan DNA Rekombinan (1987, 1988, 1991). Perhatikan Lampiran K (1991), mengenai penyusunan pedoman untuk tahap pengekangan yang sesuai dengan Amalan Skala Besar Industri yang Baik (lihat rujukan).
          2. Tentukan bahawa peralatan dan kawalan yang dijelaskan dalam EA sebagai sebahagian dari sistem pengawalan dan pengolahan sisa disahkan untuk beroperasi mengikut piawaian yang ada pada peralatan, sedang beroperasi, dan dipelihara dengan baik. Peralatan tersebut mungkin termasuk, misalnya, penapis HEPA, tangki pengumpulan tumpahan dengan rawatan haba atau hipoklorit, dan pengekalan di sekitar bioreaktor dan saluran air yang berkaitan. SOP hendaklah digunakan untuk pembersihan tumpahan, untuk tindakan yang perlu diambil dalam kes pendedahan tidak sengaja kepada kakitangan, untuk membuka dan menutup vesel, untuk pensampelan dan pengendalian sampel, dan untuk prosedur lain yang melibatkan pelanggaran pembendungan atau di mana pendedahan kepada sel hidup mungkin berlaku.
          3. Tentukan sama ada terdapat tempat kerja dan/atau program pemantauan alam sekitar yang direka untuk mengesahkan bahawa organisma tertakluk kepada amalan biobendung yang sesuai. Mengkaji SOP untuk pengambilan sampel, pengasingan, penghitungan, dan pelaporan hasil. Dapatkan salinan SOP yang berkaitan dan data pemantauan untuk dimasukkan ke dalam laporan kepada ibu pejabat.
          4. Minta dan dapatkan salinan semua permit persekutuan, negeri dan tempatan yang mengawal pelepasan dan keselamatan pekerjaan untuk kemudahan yang sedang diperiksa. Tentukan sama ada mana-mana permit telah tamat tempoh dan sama ada terdapat sebarang tindakan yang belum selesai berkaitan dengan pelanggaran permit.
          5. Untuk kemudahan di negara asing, prosedur yang sama perlu diikuti. Pematuhan dengan kehendak negara asing harus ditunjukkan.

          LAMPIRAN:

          KAEDAH UJIAN

          Affinity Chromatography - Kaedah pemisahan kromatografi berdasarkan interaksi kimia yang khusus untuk spesies sasaran. Jenis kaedah pertalian adalah: pengecualian biosorpsi-tapak (contohnya, antibodi monoklonal, protein A) interaksi hidrofobik -berhubungan antara kawasan bukan-kutub dalam larutan berair pewarna-ligan pengikatan spesifik makromolekul dengan triazin dan tripenilmetana pewarna logam chelate - kompleks chelate terikat matriks dengan molekul sasaran dengan menukar ligan terikat logam berat melecular rendah dan ikatan kovalen - disulfida yang boleh diterbalikkan dalam keadaan ringan.

          Analisis Komposisi Asid Amino - Digunakan untuk menentukan komposisi asid amino dan / atau kuantiti protein. Proses dua langkah yang melibatkan hidrolisis lengkap (kimia atau enzimatik) protein ke dalam asid amino komponennya diikuti dengan pemisahan kromatografi dan kuantitatif melalui HPLC. Komposisi asid amino lengkap peptida atau protein harus termasuk nilai yang tepat untuk metionin, sistein, dan triptofan. Komposisi asid amino yang dibentangkan hendaklah purata sekurang-kurangnya tiga (3) hidrolisat berasingan bagi setiap nombor lot. Nilai integral bagi residu asid amino yang biasanya terdapat dalam kuantiti yang rendah, seperti triptofan dan / atau metionin, dapat diperoleh dan digunakan untuk menyokong argumen kesucian.

          Penjujukan Asid Amino - Penjujukan separa (8- 15 sisa) asid amino dalam protein atau polipeptida oleh sama ada penjujukan terminal amino atau terminal karboksi. Kaedah ini dilakukan untuk mendapatkan maklumat mengenai struktur utama protein, homogenitasnya, dan kehadiran atau ketiadaan pembelahan polipeptida. Data urutan yang ditentukan oleh analisis HPLC disajikan dalam bentuk jadual dan harus merangkumi jumlah hasil untuk setiap asid amino pada setiap kitaran pembelahan berurutan. Urutan penuh sering dilakukan dengan mengurutkan pecahan peptida yang diasingkan dari pecahan HPLC.

          Elektroforesis kapilari - Digunakan sebagai pelengkap HPLC, terutamanya untuk pemetaan peptida. Teknik ini lebih pantas dan selalunya akan memisahkan peptida yang bergabung menggunakan HPLC. Pemisahan dicapai dengan mobiliti relatif peptida dalam penampan sebagai tindak balas kepada arus elektrik.

          Analisis Karbohidrat - Digunakan untuk menentukan konsistensi komposisi monosakarida terikat kovalen dalam glikoprotein. Tidak seperti rantai polipeptida glikoprotein di mana pengeluaran dikawal oleh kod genetik, oligosakarida disintesis oleh enzim posttranslational. Mikroheterogeniti rantaian karbohidrat adalah perkara biasa. Penentuan dapat dilakukan pada gula yang kurang bertenaga setelah hidrolisis dengan pemisahan HPLC dengan pengesanan amperometrik berdenyut atau dengan kromatografi gas setelah derivatisasi.

          Circular Dichroism - Dengan penyebaran putaran optik, salah satu kaedah spektrofotometri optik digunakan untuk menentukan struktur sekunder dan untuk mengukur bentuk struktur tertentu (heliks, lembaran B-lipit, dan gegelung rawak) dalam protein. Spektrum yang dihasilkan dibandingkan dengan bentuk protein semula jadi atau dengan standard rujukan untuk rekombinan.

          Analisis Hibridisasi DNA (Dot Blot) - Pengesanan DNA ke tahap nanogram menggunakan hibridisasi DNA selular dengan probe DNA tertentu. Manifestasi boleh dilakukan dengan pelabelan 32P, chemiluminescence, kromogenik atau ujian avidin-biotin.

          Edman Degradation - Sejenis urutan protein dari amino-terminus.

          Elektroforesis - Kaedah di mana molekul atau kompleks molekul diasingkan berdasarkan keupayaan relatifnya untuk berhijrah apabila diletakkan dalam medan elektrik. Analit diletakkan pada sokongan elektroforesis, kemudian dipisahkan dengan cas (pemusatan isoelektrik) atau dengan berat molekul (SDS-PAGE). Visualisasi dicapai dengan mengotorkan protein dengan teknik pewarnaan bukan selektif (Coomassie Blue) atau terpilih (perak).

          Kaedah mengikat pewarna menggunakan Coomassie blue adalah teknik yang dapat diukur ketika laser densitometer digunakan untuk membaca gel. Kaedah pewarnaan perak jauh lebih sensitif dan oleh itu digunakan untuk mengesan tahap kekotoran protein yang rendah, tetapi kerana kebolehubahan pewarnaan dari protein ke protein, ia tidak dapat digunakan untuk kuantitatif.

          Elektroforesis Gel Dua Dimensi - Sejenis elektroforesis di mana protein dipisahkan terlebih dahulu dalam satu arah dengan cas diikuti oleh pemisahan ukuran dalam arah tegak lurus.

          Uji Imunosorben Berkaitan Enzim (ELISA) - Ujian multiantigen untuk protein selular sisa (inang) yang tidak diketahui dan pengesahan protein yang diingini. Ia boleh digunakan untuk menentukan potensi sesuatu produk. Ia sangat spesifik dan sensitif, pada dasarnya sederhana, dan murah. Ia memerlukan penyediaan piawai rujukan bagi kekotoran protein sel perumah untuk berfungsi sebagai imunogen bagi penyediaan antibodi poliklonal yang digunakan untuk ujian.

          Pemeriksaan Pyrogen Endogen - Ujian in vitro berdasarkan pembebasan pirogen endogen yang dihasilkan oleh endotoksin dari monosit manusia. Ujian ini nampaknya lebih sensitif daripada Ujian Pirogen Arnab USP, tetapi jauh lebih sensitif daripada ujian LAL. Ia mempunyai kelebihan bahawa ia dapat mengesan semua bahan yang menyebabkan tindak balas pirogenik dari monosit manusia.

          Gel Permeasi atau Penapisan (Pengecualian Saiz) Kromatografi (GPC, GFC atau SEC) - Kaedah pemisahan berdasarkan ukuran molekul atau isipadu hidrodinamik komponen yang dipisahkan. Ini dapat dicapai dengan protein dalam keadaan semula jadi atau didenaturasi dengan detergen.

          Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC) - Teknik pemisahan instrumental yang digunakan untuk mencirikan atau untuk menentukan kemurnian BDP dengan menyebarkan produk (atau peptida komponennya atau asid amino) dalam bentuk cecair di atas lajur kromatografi yang mengandungi matriks sokongan padat. Mod pemisahan, iaitu fasa terbalik, pertukaran ion, penapisan gel, atau interaksi hidrofobik, ditentukan oleh matriks lajur dan fasa bergerak. Pengesanan biasanya dilakukan dengan penyerapan UV atau dengan kaedah elektrokimia.

          Kromatografi Interaksi Hidrofobik (HIC) - HIC dicapai dalam medium garam tinggi dengan mengikat bahagian hidrofobik protein ke permukaan yang sedikit hidrofobik yang mengandungi entiti seperti fenil, atau hidrokarbon rantai pendek. Protein boleh dicairkan dalam kecerunan garam yang semakin berkurangan, dengan kebanyakan protein hidrofobik dielusi dari lajur terakhir.

          Immunoassay - Teknik ujian kualitatif atau kuantitatif berdasarkan ukuran interaksi antibodi afinitas tinggi dengan antigen yang digunakan untuk mengenal pasti dan mengukur protein.

          Immunoblotting - Teknik untuk memindahkan antibodi / antigen dari gel ke penapis nitroselulosa di mana mereka dapat dikomplekskan dengan antigen / antibodi pelengkap mereka.

          Imunodifusi (tunggal) - Teknik penyebaran identiti di mana produk (antigen) diletakkan di dalam telaga yang dipotong ke dalam medium seperti agar yang mengandungi antibodi pelengkapnya. Produk meresap ke dalam medium membentuk endapan berbentuk cincin yang ketumpatannya adalah fungsi kepekatan antigen.

          Immunodiffusion (double, teknik Ouchterlony) - Teknik di mana antigen dan antibodi diletakkan dalam dua telaga bersebelahan yang dipotong menjadi medium seperti agar. Oleh kerana mereka meresap melalui medium, mereka membentuk garis pemendakan kompleks antigen / antibodi pada titik di mana kepekatan masing-masing berada pada nisbah optimum untuk pembentukan latice.

          Kromatografi Pertukaran Ion (IEC) - Pemisahan berdasarkan kecerunan berdasarkan muatan protein dan pertalian relatifnya dengan tulang belakang kimia lajur. Pertukaran anion/kation biasanya digunakan untuk protein.

          Pemfokusan Isoelektrik (IEF) - Kaedah elektroforesis yang memisahkan protein mengikut pInya. Mereka bergerak melalui medium kecerunan pH dalam medan elektrik sehingga mereka terletak pada titik isoelektrik mereka di mana mereka tidak membawa cas bersih. Sebelum mencapai pI mereka, mobilitas protein juga bergantung pada ukuran, konformasi, kecerunan pH kecerunan, dan kecerunan voltan. Kaedah ini digunakan untuk mengesan bentuk protein yang tidak betul atau diubah serta kekotoran protein.

          Ujian Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) - Ujian sensitif untuk kehadiran endotoksin menggunakan keupayaan endotoksin untuk menyebabkan tindak balas pembekuan dalam darah ketam ladam. Ujian LAL lebih mudah, cepat, lebih murah dan jauh lebih sensitif daripada ujian arnab, tetapi ujian ini hanya dapat mengesan endotoksin dan bukan semua jenis pirogen dan oleh itu mesti disahkan secara menyeluruh sebelum digunakan untuk menggantikan ujian Pyrogen Rabbit USP. Pelbagai bentuk ujian LAL termasuk ujian bekuan gel, ujian kolormetrik, ujian kromogenik, dan ujian turbidimetrik.

          Mass Spectrometry - Teknik yang berguna dalam analisis struktur primer dengan menentukan jisim molekul peptida dan protein kecil. Selalunya digunakan dengan pemetaan peptida untuk mengenal pasti varian dalam komposisi peptida. Berguna untuk mencari ikatan disulfida dan mengenal pasti pengubahsuaian pasca terjemahan.

          Northern Blot - Teknik untuk memindahkan serpihan RNA daripada gel agarosa kepada penapis nitroselulosa yang mana ia boleh dihibridkan kepada DNA pelengkap.

          Pemetaan Peptida - Teknik kuat yang melibatkan pemecahan protein menjadi peptida menggunakan enzim yang sangat spesifik. Enzim membelah protein di tempat asid amino yang dapat diramalkan dan dapat direproduksi dan peptida yang dihasilkan dipisahkan melalui HPLC atau elektroforesis. Peta peptida sampel dibandingkan dengan peta yang dilakukan pada sampel rujukan sebagai langkah pengesahan dalam pemprofilan identiti produk. Ia juga digunakan untuk pengesahan ikatan disulfida, lokasi lampiran karbohidrat, analisis urutan, dan untuk mengenal pasti kekotoran dan penurunan protein.

          Polimerase Chain Reaction (PCR) - Teknik in vitro untuk menguatkan asid nukleik. Teknik ini melibatkan satu siri kitaran berulang denaturasi suhu tinggi, penyepuhlindapan primer oligonukleotida suhu rendah dan lanjutan rantai suhu pertengahan. Asid nukleik dapat diperkuat sejuta kali lipat setelah 25- 30 kitaran.

          Kuantiti Protein - Kuantiti jumlah keseluruhan protein boleh dilakukan dengan beberapa ujian. Tidak ada satu kaedah yang lebih baik daripada yang lain, masing-masing mempunyai kelemahan sendiri dari jumlah protein yang diperlukan untuk melakukan ujian kepada masalah dengan kebolehubahan antara protein. Beberapa jenisnya termasuk Lowry, Bicinchonic Acid (BCA), Bradford, Biuret, Kjeldahl, Spektroskopi Ultraviolet.

          Urutan Protein - (Lihat Urutan Asid Amino).

          Ujian Pirogen Arnab. U.S.P. - Ujian untuk kehadiran pirogen (tidak terhad kepada endotoksin seperti ujian LAL) yang melibatkan suntikan bahan ujian ke dalam arnab yang dikawal dengan baik dan diketahui sejarahnya.Arnab kemudian dipantau untuk kenaikan suhu dalam tempoh tiga jam.

          Radioimmunoassay (RIA) - Istilah generik untuk immunoassays yang mempunyai label radioaktif (tag) pada antigen atau antibodi. Label biasa termasuk I125 dan H3 yang digunakan untuk pengesanan ujian dan kuantiti. RIA klasik adalah ujian pengikatan yang kompetitif di mana antigen dan antigen bertanda bersaing untuk bilangan laman pengikat yang terhad pada antibodi. Kompleks bertanda antibodi berkadar songsang dengan kepekatan antigen.

          Kromatografi Fasa Terbalik - Kaedah pemisahan kromatografi berdasarkan fasa pegun lajur bersalut untuk memberikan permukaan hidrofobik bukan kutub. Pengekalan analit berkadar dengan tindak balas hidrofobik antara zat terlarut dan permukaan. Pengekalan kira-kira sebanding dengan panjang rantai karbon terikat.

          SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) - Pemisahan elektroforetik protein berdasarkan berat molekulnya. Caj negatif bersih yang seragam dikenakan pada molekul dengan penambahan SDS. Di bawah keadaan ini, penghijrahan ke arah anod melalui matriks gel membolehkan pemisahan melalui saiz, bukan caj, dengan molekul yang lebih kecil berhijrah pada jarak terjauh. Teknik ini tidak boleh dipercayai untuk saiz di bawah MW ca. 8000.

          Protein diperhatikan melalui pewarnaan biru atau perak Coomassie atau dapat dipindahkan lebih jauh ke membran untuk ujian kekhususan antigen / antibodi.

          Southern Blot - Teknik untuk memindahkan serpihan DNA dari gel agarose ke penapis nitroselulosa di mana ia dapat di hibridisasi menjadi DNA pelengkap.

          UV Spectroscopy - Teknik kuantitatif untuk protein yang menggunakan spektrum penyerapan khasnya kerana adanya kromofor rantai sampingan (fenilalanin, triptofan, dan tirosin). Oleh kerana serapan ini bersifat linear, protein yang sangat dimurnikan dapat dihitung dengan pengiraan menggunakan pekali kepupusan molarnya.

          Western Blot - Ujian ini digunakan untuk mengesan substrat sel yang mencemari dan untuk menilai polipeptida rekombinan. Selepas pemisahan elektroforetik, protein bermuatan negatif (antigen) dipindahkan secara elektroforetik dari gel poliakrilamida ke membran nitroselulosa yang diletakkan di sisi anod gel. Selepas pengeraman membran dengan antibodi tertentu, ia dilabelkan dengan antibodi lain untuk pengesanan.

          ORGANISME LUAR BIASA - Bakteria, ragi, jamur, mikoplasma atau virus yang berpotensi mencemari sel prokariota atau eukariot yang digunakan dalam pengeluaran. Sumber organisma yang berpotensi termasuk serum yang digunakan dalam media kultur sel, sel yang dijangkiti secara berterusan atau secara laten, atau persekitaran.

          AFFINITI - Kuantiti termodinamik yang mentakrifkan interaksi tenaga atau pengikatan dua molekul, biasanya antibodi dengan penentu antigen yang sepadan.

          ANTIBODI (IMMUNOGLOBULIN) - Molekul protein yang mempunyai struktur ciri yang terdiri daripada dua jenis rantai peptida: berat (H) dan cahaya (L). Antibodi mengandungi kawasan (laman pengikat) yang secara khusus sesuai dengan dan dapat mengikat ke lokasi penentu yang sesuai pada antigen, yang telah menyebabkan penghasilan antibodi itu oleh limfosit B dan sel plasma pada spesies hidup.

          ANTIGEN - Bahan, biasanya protein atau karbohidrat asing, yang apabila dimasukkan ke dalam organisma, mengaktifkan reseptor khusus pada permukaan limfosit T dan B yang imunokompeten. Setelah interaksi antara antigen dan reseptor, biasanya akan terjadi induksi tindak balas imun, iaitu pengeluaran antibodi yang mampu bertindak balas secara khusus dengan lokasi penentu pada antigen.

          ANTIGENIC DETERMINANT - Bahagian spesifik struktur antigen yang akan mendorong tindak balas imun, iaitu sesuai dengan reseptor pada limfosit T dan B dan juga akan dapat bertindak balas dengan antibodi yang dihasilkan.

          ANTISERUM - Serum darah yang mengandungi antibodi terhadap antigen tertentu (atau imunogen). Ini sering bermaksud serum dari haiwan yang telah diinokulasi dengan antigen.

          ASCIT - Pengumpulan cecair di rongga peritoneal. Antibodi monoklonal boleh disucikan daripada asites tikus yang membawa hibridoma yang dipindahkan.

          KONSTAN PERSATUAN - Reaksi antara antibodi dan penentunya yang merangkumi ukuran pertalian. Pemalar dihitung oleh pemalar kadar undang-undang tindakan massa untuk pergaulan dan pemisahan. AUTORADIOGRAFI - Pengesanan molekul berlabel radioaktif pada filem sinar-X.

          KETERANGAN - Kekuatan pengikatan total antara semua tempat pengikatan molekul antibodi yang ada dan penentu yang sesuai yang terdapat pada antigen.

          BACTERIOPHAGE - Virus yang menyerang bakteria. Bakteria lambda sering digunakan sebagai vektor dalam eksperimen gen rekombinan.

          LAMAN BINDING - Bahagian molekul antibodi yang secara khusus akan mengikat antigen.

          BIOACTIVITY - Tahap aktiviti atau potensi tertentu seperti yang ditentukan oleh model haiwan, kultur sel, atau uji biokimia in vitro.

          PENGENDALIAN BIOLOGI - Ciri-ciri organisma yang mengehadkan kemandirian dan/atau pendarabannya dalam persekitaran.

          PENGubahsuai TINDAK BALAS BIOLOGI - Istilah generik untuk hormon, sebatian neuroaktif dan sebatian imunoreaktif yang bertindak pada peringkat selular kebanyakannya adalah calon yang mungkin untuk pengeluaran bioteknologi.

          BIOREACTOR - Sebuah kapal di mana tindak balas pusat proses bioteknologi berlaku. Biasanya vesel itu mengandungi mikrob yang tumbuh di bawah keadaan suhu, pengudaraan, pencampuran, keasidan dan kemandulan terkawal.

          BIOSENSORS - Sistem pengecaman berkuasa bahan kimia biologi (enzim, antibodi, DNA) digabungkan dengan mikroelektronik untuk membolehkan pengesanan tahap rendah yang cepat dan tepat bagi bahan seperti gula dan protein (seperti hormon) dalam cecair badan, bahan pencemar dalam air dan gas di udara.

          CALIBRATOR - Istilah dalam kimia klinikal yang lazimnya merujuk kepada piawai yang digunakan untuk "menentukur" instrumen atau digunakan dalam pembinaan lengkung piawai (calibrator).

          BUDAYA SEL - Pertumbuhan in vitro sel yang diasingkan daripada organisma multisel. Sel-sel ini biasanya terdiri daripada satu jenis.

          PEMBEZAAN SEL - Proses di mana keturunan sel ibu bapa yang sama mencapai dan mengekalkan pengkhususan struktur dan fungsi.

          SEL FUSION - Pembentukan sel hibrid dengan nukleus dan sitoplasma daripada sel yang berbeza, dihasilkan dengan menggabungkan dua sel spesies yang sama atau berbeza.

          CELL LINE - Sel yang memperoleh keupayaan untuk membiak secara in vitro tanpa had.

          CHEMOTAXIS - Pergerakan berorientasi bersih dalam kecerunan kepekatan sebatian tertentu. Pelbagai gula dan asid amino boleh berfungsi sebagai daya tarikan sementara beberapa bahan seperti asid atau alkali berfungsi sebagai penghalau dalam kemotaksis mikrob. Sel darah putih dan makrofag menunjukkan pergerakan kemotaktik dengan adanya produk bakteria, melengkapkan protein dan sel T yang diaktifkan antigen untuk menyumbang kepada reaksi keradangan tempatan dan penentangan terhadap patogen.

          CISTRON - Unit terkecil bahan genetik yang bertanggungjawab untuk sintesis polipeptida tertentu.

          KLON - Garis sel yang berpunca daripada sel nenek moyang tunggal dan biasanya mengekspresikan semua gen yang sama. Sekiranya ini adalah klon limfosit B, mereka biasanya akan menghasilkan antibodi yang sama, iaitu antibodi monoklonal.

          CODON - Kumpulan tiga asas nukleotida dalam DNA atau RNA yang menentukan komposisi satu asid amino dalam "membina" protein dan juga dapat memberi kod untuk penghentian rantai.

          TERMINI KOHESIF - Molekul DNA dengan hujung untai tunggal dengan tapak pelengkap terdedah (padu).

          DNA LENGKAP (cDNA) - DNA yang merupakan pelengkap RNA messenger yang digunakan untuk pengklonan atau sebagai penyelidikan dalam kajian hibridisasi DNA.

          COSMID - Vektor yang serupa dengan plasmid tetapi ia juga mengandungi tapak kohesif (tapak kos) bacteriophage lambda untuk membenarkan pemasukan serpihan besar DNA dan pembungkusan in vitro ke dalam fag.

          REAKSI CROSS - Antibodi terhadap antigen A boleh bertindak balas dengan antigen lain jika yang terakhir mempunyai satu atau lebih penentu yang sama dengan penentu yang terdapat pada antigen A atau membawa satu atau lebih penentu yang secara struktural sangat serupa dengan penentu yang terdapat pada antigen A.

          CYTOKINE - Protein kecil, bukan imunoglobulin yang dihasilkan oleh monosit dan limfosit yang berfungsi sebagai komunikator antara sel setelah mengikat reseptor tertentu pada sel yang bertindak balas. Sitokin mengatur pelbagai aktiviti biologi.

          KESAN CYTOPATHIC - Perubahan morfologi garis sel yang dihasilkan apabila sel dijangkiti virus. Contoh kesan sitopatik termasuk pembulatan dan penggumpalan sel, gabungan membran sel, pembesaran atau pemanjangan sel, atau lisis sel.

          CYTOTOXIC - Merosakkan sel.

          DENATURASI - Membongkar molekul protein ke dalam bentuk yang tidak aktif secara umum. Juga gangguan dupleks DNA menjadi dua helai terpisah.

          DNA (DEOXYRIBONUCLEIC ACID) - Komponen biokimia asas kromosom dan sokongan keturunan. DNA mengandungi gula deoksiribosa dan merupakan asid nukleik di mana maklumat genetik disimpan (selain daripada beberapa virus).

          KLONING DNA - Penghasilan banyak salinan yang sama bagi serpihan DNA yang ditentukan.

          PERPUSTAKAAN DNA - Set serpihan DNA klon yang bersama-sama mewakili keseluruhan genom atau transkripsi tisu tertentu.

          DNA POLYMERASE - Enzim yang menjadi pemangkin sintesis DNA untai ganda dari DNA helai tunggal.

          SINTESIS DNA - Pembentukan DNA dengan penambahan berurutan asas nukleotida.

          DNase - Enzim yang menghasilkan torehan beruntai tunggal dalam DNA. DNase digunakan dalam terjemahan nick.

          ELUTION - Penyingkiran bahan yang diserap dari adsorben seperti penyingkiran produk dari enzim yang terikat pada lajur.

          ENDONULEASES - Enzim yang membelah ikatan dalam molekul asid nukleik.

          ENDOTOXIN - Lipopolisakarida tahan haba yang dikaitkan dengan membran luar bakteria gram negatif tertentu. Ia tidak dirembeskan dan dilepaskan hanya apabila sel-sel terganggu. Apabila disuntik ke dalam manusia, endotoksin menghasilkan tindak balas demam, membawa kepada masalah klinikal yang teruk, termasuk kematian. Unit endotoksin (EU) ditakrifkan berbanding dengan Piawaian Rujukan USP semasa Lot EC- 5. Satu vial lot EC- 5 mengandungi 10,000 EU. Ujian rasmi untuk endotoksin didapati di USP.

          ENZIM - Protein yang bertindak sebagai pemangkin dalam tindak balas biokimia.

          EXONUCLEASES - Enzim yang memangkinkan penyingkiran nukleotida dari hujung molekul DNA.

          PENApaian - Satu bioproses anaerobik. Fermentasi digunakan dalam pelbagai proses industri untuk pembuatan produk seperti alkohol, asid, dan keju dengan tindakan ragi, acuan, dan bakteria. Proses fermentasi digunakan juga dalam penghasilan antibodi monoklonal.

          FUSI PROTOPLAS - Penyatuan dua sel yang dindingnya telah dihapuskan, memungkinkan untuk mengagihkan semula warisan genetik mikro-organisma.

          GENE - Unit asas keturunan, yang berperanan dalam penyataan ciri khas. Ekspresi gen ialah mekanisme di mana maklumat genetik yang terkandung di dalamnya ditranskripsi dan diterjemahkan untuk mendapatkan protein. Gen adalah bahagian molekul DNA yang mengarahkan sintesis rantai polipeptida tertentu. Ia terdiri daripada banyak kodon. Apabila gen dianggap sebagai unit fungsi dengan cara ini, istilah cistron sering digunakan.

          GENE TRANSFER - Penggunaan manipulasi genetik atau fizikal untuk memperkenalkan gen asing ke dalam sel inang untuk mencapai ciri-ciri yang diinginkan dalam keturunan.

          KEJURUTERAAN GENETIK - Teknik yang digunakan untuk mengubah maklumat genetik dalam sel hidup, memprogramkannya semula untuk tujuan yang diinginkan (seperti pengeluaran bahan yang tidak akan dihasilkannya secara semula jadi).

          GENOME - Semua gen yang dibawa oleh sel.

          GLYCOPROTEIN - Protein yang mana kumpulan gula menjadi melekat. Protein kumpulan darah manusia, protein dinding sel dan beberapa hormon adalah contoh glikoprotein.

          GLYCOSYLATION - Lekapan kovalen gula ke asid amino di bahagian protein glikoprotein.

          TERJADI - Bahan berat molekul rendah yang boleh bertindak balas dengan antibodi yang sesuai. Untuk menjadi imunogenik, hapten terikat kepada molekul yang mempunyai berat molekul lebih daripada 5000. Contohnya ialah hapten digoxin yang terikat secara kovalen kepada albumin serum lembu, membentuk imunogen digoxin- BSA.

          ANTIBODI AFFINITY TINGGI - Antibodi dengan pertalian tinggi untuk antigen. Antibodi ini kebanyakannya IgG, dan dihasilkan semasa tindak balas sekunder terhadap antigen. Sel yang menghasilkan antibodi afinitas tinggi dapat dipicu oleh kepekatan antigen yang rendah.

          KROMATOGRAFI CECAIR BERPRESTASI TINGGI (HPLC ATAU LC) - (Lihat Kaedah Ujian)

          HOST - Sel yang metabolisme digunakan untuk pertumbuhan dan pembiakan virus, plasmid, atau bentuk DNA asing yang lain.

          TEKNOLOGI HYBRIDOMA - Penyatuan antara sel pembentuk antibodi (limfosit) dan sel myeloma malignan ("abadi"), yang akan menghasilkan klon sel yang terus berkembang (hybridoma), yang dapat menghasilkan antibodi dengan kekhususan tunggal.

          KECERGASAN IMMUNOASSAY - Karakteristik prestasi yang ditentukan dengan melakukan kajian kereaktifan silang dengan bahan serupa yang mungkin terdapat dalam matriks analit. Kajian kekhususan ditentukan dengan setiap lot baru antibodi poliklonal yang digunakan dalam immunoassay. Untuk antibodi monoklonal, setiap lot baru berikutnya biasanya dicirikan oleh teknik biokimia dan biofizik sebagai pengganti kajian kekhususan yang komprehensif.

          IMMUNOELECTROPHORESIS (IEP) - (Lihat Kaedah Uji - Imunodiffusion (double, Ouchterlony techiques))

          IMMUNOTOXIN - Antibodi monoklonal ditambah dengan toksin yang mampu menghantar bahagian toksin ke sel sasaran.

          DI SITU HYBRIDISASI - Hibridisasi dengan probe yang sesuai dijalankan secara langsung pada penyediaan kromosom atau bahagian histologi.

          IN VITRO - Reaksi biologi berlaku di luar badan dalam sistem buatan.

          IN VIVO - Tindak balas biologi yang berlaku di dalam sel atau organisma hidup.

          INDUCER - Perubahan kimia atau bersyarat yang mengaktifkan ungkapan yang membawa kepada pengeluaran produk yang diinginkan. Molekul kecil yang berinteraksi dengan protein pengatur dan mencetuskan transkripsi gen.

          LIGASE - Enzim digunakan untuk bergabung dengan molekul DNA.

          LOCUS - Tapak gen pada kromosom.

          LYMPHOKINES - Bahan yang dibebaskan terutamanya dari limfosit T setelah reaksi dengan antigen tertentu. Limfokin secara biologi sangat aktif dan akan menyebabkan kemotaksis dan pengaktifan makrofag dan reaksi imun yang dimediasi sel lain. Gamma- interferon ialah limfokin.

          LYSIS - Proses di mana pecahan dinding sel berlaku melepaskan kandungan selular ke dalam persekitaran sekeliling. Pemusnahan bakteria oleh fage infektif.

          MASTER CELL BANK (MCB) - Banyak biji sel yang terdiri daripada banyak kultur tunggal (dalam kebanyakan kes, berkembang dari satu sel) dan disimpan secara kriogenik untuk memastikan kestabilan genetik. Harus ada cukup ampul MCB untuk menyediakan bahan sumber untuk bank benih yang berfungsi.

          MESSENGER RNA (mRNA) - RNA yang berfungsi sebagai templat sintesis protein, ia membawa kod genetik yang ditranskripsikan dari DNA ke kompleks sintesis protein untuk mengarahkan sintesis protein.

          MICROHETEROGENEITY - Perbezaan sedikit dalam makromolekul besar dan kompleks yang mengakibatkan populasi struktur yang berkait rapat tetapi tidak sama. Protein microheterogeneity boleh timbul dari banyak sumber: varian genetik, aktiviti proteolitik dalam sel, semasa terjemahan ke dalam protein, semasa pelekat gula dan semasa pengeluaran komersial.

          ANTIBODI MONOKLONAL - Antibodi yang dihasilkan oleh klon selular dan semuanya serupa.

          MUTAGENESIS - Induksi mutasi genetik secara fizikal atau kimia bermaksud untuk mendapatkan ciri yang dikehendaki oleh penyelidik.

          MUTASI - Perubahan dalam bahan genetik, sama ada pasangan asas tunggal (mutasi titik) atau dalam bilangan atau struktur kromosom.

          MYELOMA - Garis sel tumor berasal daripada limfosit.

          TERJEMAHAN NICK - Kaedah in vitro digunakan untuk memperkenalkan nukleotida berlabel radioaktif ke dalam DNA.

          NICK - Penembusan tulang belakang gula-fosfat pada helai DNA atau RNA.

          OLIGONUCLEOTIDES - Segmen pendek DNA atau RNA, iaitu rantai beberapa nukleotida.

          OPERATOR GENE - Gen yang menghidupkan gen struktur bersebelahan.

          OPERON - Unit lengkap ekspresi gen bakteria yang terdiri daripada gen pengawal selia, elemen kawalan (promotor dan pengendali) dan gen struktur bersebelahan.

          PATOGEN - Ejen penghasil penyakit, biasanya terhad kepada agen hidup, seperti bakteria atau virus.

          PEPTIDE BOND - Ikatan kimia antara kumpulan karboksil (- COOH) satu asid amino dan kumpulan amino (- NH2) yang lain.

          PLAK - Kawasan jernih dalam kultur bakteria bersalut akibat lisis oleh faj.

          PLASMID - Segmen pekeliling DNA extrachromosomal, replikasi diri, dan lingkaran (dan beberapa virus) digunakan sebagai "vektor" untuk mengklon DNA dalam sel "inang" bakteria.

          POLIKLIN - Berasal dari pelbagai jenis sel.

          PROKARYOTE - Organisma (mis. Bakteria, virus, alga hijau-hijau) yang DNAnya tidak tertutup dalam membran nuklear.

          PROTEIN - Polipeptida yang terdiri daripada asid amino. Dalam keadaan aktif secara biologi, protein berfungsi sebagai pemangkin metabolisme dan, sampai tahap tertentu, sebagai unsur struktur sel dan tisu.

          PYROGENICITY - Kecenderungan beberapa sel bakteria atau bahagian sel menyebabkan tindak balas keradangan dalam badan, yang boleh menjejaskan kegunaannya sebagai produk farmaseutikal.

          DNA PENGAMBILAN - DNA yang mengandungi gen dari pelbagai sumber yang telah digabungkan dengan kaedah kejuruteraan genetik berbanding percubaan pembiakan tradisional.

          PETA PEMBATASAN - Susunan linear dari pelbagai laman enzim sekatan.

          TAPAK SEKATAN - Urutan asas yang diiktiraf oleh enzim.

          RETROVIRUS - Virus RNA yang mereplikasi melalui penukaran kepada dupleks DNA.

          TRANSCRIPTASE REVERSE - Enzim yang memangkinkan sintesis DNA dari RNA.

          RNA (ASID RIBONUCLEIC) - Komponen biokimia asas kromosom yang terdapat terutamanya dalam nukleolus dan ribosom. Messenger RNA memindahkan maklumat genetik dari nukleus ke ribosom di sitoplasma dan juga bertindak sebagai templat untuk sintesis polipeptida. Pemindahan RNA memindahkan asid amino yang diaktifkan dari sitoplasma ke RNA messenger.

          RNA POLYMERASE - Enzim yang memangkinkan sintesis RNA dalam transkripsi.

          SODIUM DODECYL SULFATE POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPORESIS (SDS- PAGE) (Lihat Kaedah Ujian)

          STRAIN - Sekumpulan organisma daripada spesies yang sama mempunyai ciri tersendiri, tetapi biasanya tidak dianggap sebagai baka atau varieti yang berasingan.

          T- HELPER CELLS - T- limfosit dengan keupayaan khusus untuk membantu sel lain, seperti B-limfosit, untuk membuat antibodi. Sel T-penolong juga diperlukan untuk induksi aktiviti T-limfosit yang lain. Sinonim adalah sel induktor T, sel T4, atau limfosit CD 4.

          T- SUPPRESSOR CELLS - T- limfosit dengan kapasiti khusus untuk menghalang fungsi sel T- pembantu.

          TRANSKRIPSI - Peringkat pertama dalam ekspresi gen melalui maklumat genetik yang dihantar dari DNA dalam kromosom kepada RNA messenger.

          TERJEMAHAN - Tahap kedua dalam ekspresi gen melalui maklumat genetik yang dihantar dari mRNA ke sintesis protein.

          VECTOR - Plasmid, phage atau cosmid di mana DNA asing boleh dimasukkan untuk pengklonan.

          WESTERN BLOT - (Lihat Kaedah Ujian).

          BANK CELL KERJA (WCB) - Sejumlah sel yang berasal dari satu atau lebih ampul Master Cell Bank dan digunakan untuk memulakan kumpulan pengeluaran.


          Lampiran

          Perkhidmatan Makmal

          Bilangan perkhidmatan makmal berikut setiap kitaran dianggap perlu dari segi perubatan.

          Jadual : Perkhidmatan Makmal setiap Kitaran
          Pemantauan semula jadi Pemantauan Clomid Clomid IUI Kitaran Inj Mon Inj IUI IVF HADIAH Kod FET PM
          Ultrasound transvaginal 2 6 6 8 10
          Estradiol 2 6 6 8 10 10 10 10
          FSH 2 6 6 8 10 10 10 10
          LH 2 6 6 8 10 10 10 10
          Progesteron 2 Nota kaki untuk progesteron * 2 Nota kaki untuk progesteron * 2 Nota kaki untuk progesteron * 8 10 10 10 10 3
          hCG 2 2 2 2 2 2 2 2 3

          Kunci : IUI: inseminasi dalam rahim Inj: suntikan Mon: IVF bulanan: persenyawaan in-vitro HADIAH: pemindahan intra-fallopian gamet FET: pemindahan embrio beku PM: pemantauan kehamilan FSH: hormon perangsang folikel LH: hormon luteinizing hCG: gonadotropin korionik manusia .

          Nota kaki untuk progesteron *Catatan: Lebih dari 2 pengukuran progesteron mungkin diperlukan secara perubatan untuk wanita yang tidak subur dengan kitaran haid yang tidak teratur dan berpanjangan. Bagi wanita yang tidak subur dengan kitaran haid yang tetap, ukuran progesteron serum pertengahan luteal (hari ke-21 dalam kitaran 28 hari) dianggap perlu dari segi perubatan. Bagi wanita yang tidak subur dengan kitaran haid yang tidak teratur, ujian ini perlu diulang pada fasa pertengahan luteal dan setiap minggu selepas itu sehingga kitaran haid berikutnya bermula.

          Gonadotropin/Menotropin (Nota Kaki Kitaran Permulaan untuk Kitaran Permulaan *)

          Kurang daripada umur 35 tahun: 20 ampul (sehingga 35 ampul jika tahap FSH lebih besar daripada 12 dan kurang daripada 19)

          Umur 35 hingga 39 tahun: 20 hingga 30 ampul (sehingga 40 ampul jika tahap FSH lebih besar daripada 12 dan kurang daripada 19)

          Umur 40 tahun dan lebih tua: 40 ampul (sehingga 50 ampul jika tahap FSH lebih besar daripada 12 dan kurang dari 19)

          Kurang dari umur 35 tahun: 30 hingga 40 ampul (sehingga 50 ampul jika tahap FSH lebih besar daripada 12 dan kurang dari 19)

          Umur 35 hingga 39 tahun: 35 hingga 45 ampul (sehingga 55 ampul jika FSH lebih besar daripada 12 dan kurang daripada 19)

          Umur 40 tahun ke atas: 45 hingga 60 ampul (permintaan untuk lebih daripada 60 ampul tertakluk kepada semakan klinikal jika tahap FSH lebih daripada 12 dan kurang daripada 19, minta protokol ubat dan semakan klinikal (BMI, PCOS))

          Nota Kaki telur penderma untuk Telur Donor ** (semua peringkat umur): 30 hingga 40 ampul (sehingga 50 ampul jika tahap FSH lebih besar daripada 12 dan kurang daripada 19)

          Luteinizing Hormone (Nota Kaki Kitaran Awal untuk Kitaran Awal *)

          Kurang dari umur 35 tahun: 1 hingga 10 ampul

          Umur 35 hingga 39 tahun: 10 hingga 15 ampul

          Umur 40 tahun ke atas: 15 hingga 20 ampul

          Kurang dari umur 35 tahun: 10 ampul

          Umur 35 hingga 39 tahun: 10 hingga 20 ampul

          Umur 40 tahun dan lebih tua: 20 hingga 30 ampul

          Suntikan subkutan HCG (Nota Kaki Kitaran Awal untuk Kitaran Awal *)

          Suntikan intramuskular HCG (Nota Kaki Kitaran Awal untuk Kitaran Awal *)

          Kunci: SENI: teknologi pembiakan termaju BMI: indeks jisim badan FSH: hormon perangsang folikel HCG: gonadotropin korionik manusia IU: unit antarabangsa MDV: botol dos pelbagai PCOS: sindrom ovarium polikistik PFS: jarum suntikan U: unit.

          Nota kaki untuk Kitaran Awal * Isi semula berdasarkan dokumentasi dalam helaian kitaran.

          Nota kaki untuk Telur Donor ** Beberapa rancangan tidak termasuk perkhidmatan kemandulan untuk kegagalan ovari sila periksa keterangan rancangan faedah.

          Nota kaki untuk Kuantiti Inseminasi † Andaikan kitaran inseminasi intra-rahim menggunakan ubat selama 10 hari

          Nota kaki untuk Kuantiti ART ‡ Andaikan kitaran ART menggunakan ubat selama 10 hari.

          Nota kaki untuk Contoh §Untuk kepekatan yang berbeza gunakan 75 IU sebagai asas.

          Nama jenama

          Panjang kelulusan

          450 unit MDV, 1050 unit MDV

          150, 300, 600, 900 unit kartrij berbilang dos

          Setelah normalisasi tahap testosteron serum, gunakan Gonal F bersamaan dengan hCG: 150 unit tiga kali seminggu dos maksimum 300 unit tiga kali seminggu hingga 18 bulan

          Setelah normalisasi tahap testosteron serum, gunakan Follistim AQ bersamaan dengan hCG: 450 unit seminggu (atau 225 unit dua kali seminggu atau 150 unit tiga kali seminggu).

          suntikan intramuskular hCG

          Contoh: Pregnyl, Novarel, hCG

          500-1000 unit tiga kali seminggu x 3 minggu diikuti dengan dos yang sama dua kali seminggu x 3 minggu

          4000 unit tiga kali seminggu selama 6-9 bulan, berikutan dosnya dapat diturunkan menjadi 2000 unit tiga kali seminggu selama 3 bulan tambahan

          Nota kaki untuk follitropin * Terapi follitropin rekombinan bersama dan terapi gonadotropin chorionic manusia harus dilanjutkan sekurang-kurangnya 3 hingga 4 bulan sebelum peningkatan spermatogenesis dapat diharapkan.

          Definisi

          Untuk tujuan dasar ini, definisi berikut akan digunakan:

          Klasifikasi gangguan ovulasi:

          Anovulasi dan oligo-ovulasi adalah gangguan ovulasi yang dianggarkan menyebabkan 21% masalah kesuburan wanita. Pertubuhan Kesihatan Sedunia mengklasifikasikan gangguan ovulasi kepada 3 kumpulan.

          Kumpulan I:
          Kumpulan II:
          Kumpulan III :

          Kualiti Embrio dalam Kitaran ART:

          Embrio dianggap berkualiti (gred B atau yang setaraf dengannya) jika mempunyai fragmentasi kurang dari 50% (lihat, misalnya, Ebner, et al., 2001 Rhenman, et al., 2015 Shaw-Jackson, et al. , 2013) ..

          Kadar Pembajaan dalam Kitaran IVF:

          Kadar persenyawaan dianggap buruk jika kitaran IVF mengakibatkan persenyawaan kurang dari 50%.

          Rizab Ovari sebagai Tindak Balas kepada Rangsangan Gonadotropin :

          Cadangan ovari dianggap normal jika 3 atau lebih folikel berkembang dan tahap estrogen lebih besar daripada 500 mIU / ml berikutan hiperstimulasi ovari dengan gonadotropin. Cadangan ovari yang berkurang ditunjukkan oleh kadar estrogen puncak kurang dari 500 mIU / ml atau kurang dari 3 folikel matang tersedia pada masa rangsangan dan pengambilan.

          Kualiti dan Kuantiti Air mani:

          Kekurangan dalam kuantiti air mani dianggap berat jika terdapat kurang dari 10 juta jumlah sperma bergerak per ejakulasi (spesimen yang tidak dicuci) atau kurang dari 3 juta jumlah sperma bergerak (spesimen yang dicuci) pada 2 kesempatan terpisah sekurang-kurangnya 2 minggu. Kekurangan dalam kualiti air mani dianggap teruk jika terdapat kurang dari 4% bentuk normal menggunakan morfologi ketat Kruger. Pada lelaki yang telah memenuhi definisi ketidaksuburan faktor lelaki yang teruk dengan kualiti atau kuantiti sperma yang tidak normal lebih dari 2 minggu pada masa lalu dan kemudian mengalami varikoselektomi yang berjaya menghasilkan kualiti atau kuantiti sperma yang normal, ICSI dianggap tidak diperlukan secara perubatan.

          Analisis Air mani: Nilai Rujukan Organisasi Kesihatan Sedunia
          • pH: 7.2 atau lebih
          • Kepekatan sperma: 15 juta spermatozoa setiap ml atau lebih
          • Morfologi sperma (peratusan bentuk normal): 4 % atau lebih
          • Isi padu air mani: 1.5 ml atau lebih
          • Keseluruhan pergerakan (peratusan motif progresif dan motilitas tidak progresif): 40% atau lebih motil atau 32% atau lebih dengan pergerakan progresif
          • Jumlah bilangan sperma: 39 juta spermatozoa setiap ejakulasi atau lebih
          • Vitality: 58% atau lebih spermatozoa hidup
          Tahap Endometriosis

          Secara pembedahan, endometriosis boleh dilakukan I-IV (Klasifikasi Semula Perubatan Reproduktif Persatuan Amerika). Pelbagai peringkat menunjukkan penemuan ini:

          Tahap I (Minimal) -

          Peringkat II (Ringan) -

          Tahap III (Sederhana) -

          Tahap IV (Parah) -

          Sumber: Diadaptasi dari ASRM, 1997.


          Penggunaan RNAi sebagai alat awal untuk menyaring reseptor berpotensi toksin nematicidal dari Bacillus thuringiensis

          Bacillus thuringiensis adalah agen kawalan yang berpotensi untuk nematod parasit tumbuhan. Reseptor usus nematod untuk toksin jenis Cry21 kurang diketahui. Oleh itu, strategi diuji sebagai alat penyaringan utama untuk mencari kemungkinan reseptor Cry toxin, menggunakan strain Bt nematicidal dan teknik RNAi pada Caenorhabditis elegans. Enam gen yang mengekod protein membran usus dipilih (abt-4, bre-1, bre-2, bre-3, asps-1, abl-1sebagai sasaran yang mungkin untuk protein Cry. Pecahan setiap gen yang dipilih telah dikuatkan oleh PCR. Amplicon telah diklon ke dalam vektor L4440 untuk mengubah E coli ketegangan HT155 (DE3). Bakteria yang diubah digunakan untuk membungkam gen yang dipilih menggunakan kaedah pemberian makanan RNAi. Nematoda dengan gen yang disenyapkan diuji dengan strain Bt LBIT-107, yang menyimpan protein nematicidal Cry21Aa3, antara lain. Keputusan menunjukkan bahawa nematod dengan disenyapkan abt-4 gen adalah 69.5% lebih tahan terhadap strain LBIT-107, secara umum, dan 79% terhadap toksin Cry21Aa3, khususnya.

          Ini ialah pratonton kandungan langganan, akses melalui institusi anda.


          Kesimpulan

          Pemilihan gRNA untuk eksperimen perlu mengimbangi memaksimumkan aktiviti pada sasaran sambil meminimumkan aktiviti luar sasaran, yang kelihatan jelas tetapi selalunya memerlukan keputusan yang sukar. Sebagai contoh, adakah lebih baik menggunakan gRNA yang kurang aktif yang menargetkan laman web yang benar-benar unik dalam genom, atau gRNA yang lebih aktif dengan satu laman sasaran tambahan di kawasan genom tanpa fungsi yang diketahui? Untuk penciptaan model sel stabil yang akan digunakan untuk kajian jangka panjang, yang pertama mungkin merupakan pilihan yang lebih baik. Namun, untuk perpustakaan seluas genom melakukan pemeriksaan genetik, perpustakaan yang terdiri daripada yang kedua kemungkinan akan lebih berkesan, asalkan diambil perhatian dalam penafsiran hasil dengan memerlukan beberapa urutan yang menargetkan gen untuk mendapat skor untuk memanggilnya. gen hit.

          Ini adalah masa yang menarik untuk genomik berfungsi, dengan senarai alat yang terus berkembang untuk menyelidiki fungsi gen. Alat terbaik hanya sama baiknya dengan orang yang menggunakannya, dan penggunaan teknologi CRISPR yang tepat akan selalu bergantung pada reka bentuk, pelaksanaan, dan analisis eksperimental yang teliti.

          Terima kasih banyak kepada blogger jemputan kami John Doench!

          John Doench adalah Pengarah R & ampD di Genetik Perturbation Platform di Broad Institute dan telah bekerjasama dengan banyak Addgenies untuk membantu meningkatkan pemahaman, kurasi, dan penjelasan mengenai sumber CRISPR kami. Dia sangat suka RNA kecil.


          Tonton video: Reseptor Tirosin kinase u0026 Reseptor Sitokin - Kelompok 7B (Oktober 2022).