Maklumat

Apa yang datang dahulu? DNA atau polimerase DNA?

Apa yang datang dahulu? DNA atau polimerase DNA?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya tahu ini kedengarannya seperti pertanyaan ayam dan telur dan sementara yang terakhir mempunyai jawapan, saya tertarik dengan yang pertama.

Bentuk soalan yang diubah suai ialah, dalam perjalanan abiogenesis, apakah yang terbentuk dahulu? DNA atau protein (oleh itu enzim dan polimerase DNA)?

Prinsip di sebalik itu adalah bahawa DNA memerlukan enzim untuk meniru. (DNA pol)

Tetapi DNA pol itu sendiri, sebagai protein, memerlukan gen DNA pol A/B/C pada DNA! (Transkripsi dan terjemahan) Belum lagi semua protein lain yang diperlukan untuk transkripsi dan terjemahan.

Begitu juga dengan RNA dan RNA pol.

Jika DNA/RNA terbentuk dahulu, bagaimanakah ia mereplikasi tanpa protein? Jika Protein terbentuk dahulu, maka bagaimana ia wujud tanpa DNA/RNA?

Mari buat anggapan besar dan katakan bahawa asid nukleik terbentuk untuk pertama kalinya dan direplikasi tanpa protein. Adakah mungkin asid nukleik mereplikasi tanpa protein? Sebagai contoh, urutan DNA yang terbentuk secara abiogenetik secara rawak menarik helai pelengkapnya dan apa sahaja yang sesuai, dipasang dan entah bagaimana ikatan fosfodiester adalah protein yang dilekatkan. Kedengarannya terlalu tidak masuk akal.

Suka jika ada yang memberikan sumber bukti DNA / protein secara abiotik membentuk enzim de novo sans, gen.


Jawapan lurus ke hadapan ialah: kami tidak tahu. Kami tidak mempunyai sebarang bukti langsung untuk apa yang berlaku pada masa itu mahupun sebarang teori yang dibangunkan sepenuhnya dan koheren tentang cara ia berfungsi.

Hipotesis yang dipercayai ramai adalah hipotesis "Dunia RNA". RNA, tidak seperti DNA, mampu melipat secara spontan untuk membentuk molekul pemangkin dan dengan itu mengelakkan keperluan terjemahan dan transkripsi oleh protein kerana dapat menguatkan sintesisnya sendiri. Idenya adalah bahawa, dari masa ke masa, RNA mengembangkan cara untuk mensintesis protein dan kemudian mula menggunakan DNA sebagai molekul penyimpanan yang lebih stabil. Polimerase RNA berasaskan RNA yang terdahulu telah digantikan oleh polimerase protein kesetiaan yang lebih tinggi sepanjang masa evolusi supaya kita tidak lagi melihatnya dalam sel moden.


Kornberg, A. Untuk Cinta Enzim: Odyssey Ahli Biokimia. (Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts, 1989).

Kornberg, A. Penyakit hati laten pada orang yang pulih dari penyakit kuning catarrhal dan pada pelajar perubatan biasa, seperti yang dinyatakan oleh ujian ekskresi bilirubin. J. Clin. melabur. 21, 299?308 (1942).

Kornberg, A. Tidak pernah menjadi enzim yang membosankan. Annu. Rev. Biochem. 58, 1?30 (1989).

Watson, J. D. & Crick, F. C. Struktur untuk asid nukleik deoksiribosa. Alam semula jadi 171, 737?738 (1953).

Kornberg, A. Sintesis biologi asid deoksiribonukleik. Sains 131, 1503?1508 (1960).

Grunberg-Manago, M. & Ochoa, S. J. Sintesis enzimatik dan pecahan polynucleotides polynucleotide phosphorylase. J. Am. Kimia. Soc. 77, 3165?3166 (1955).

Weiss, S. B. & amp Gladstone, L. Sistem mamalia untuk penggabungan sitidin trifosfat ke dalam asid ribonukleat. J. Am. Kimia. Soc. 81, 4118?4119 (1959).

Lehman, I. R. Penemuan polimerase DNA. J. Biol. Kimia. 278, 34743?34738 (2003).

Kornberg, A., Lehman, I. R. & amp Simms, E. S. Sintesis polydesoxyribonucleotide oleh enzim dari Escherichia coli. makan. Pro. 15, 291 (1956).

Kornberg, A. dalam Asas Kimia Keturunan. (eds McElroy, W. D. & amp Glass, B.) 579? 608 (Johns Hopkins Press, Baltimore, 1957).

Kornberg, A., Lehman, I. R., Bessman, M. J. & Simms, E. S. Sintesis enzimatik asid desoksiribonukleik. Biochim. Biophys. Acta 21, 197?198 (1956).

Lehman, I. R., Bessman, M. J., Simms, E. S. & amp Kornberg, A. Sintesis enzimatik asid deoksiribonukleik I. Penyediaan substrat dan pembersihan sebahagian enzim dari Escherichia coli. J. Biol. Kimia. 233, 163?170 (1958).

Bessman, M., Lehman, I. R., Simms, E. S. & amp Kornberg, A. Sintesis enzimatik asid deoksiribonukleik II. Sifat am tindak balas. J. Biol. Kimia. 233, 171?177 (1958).

Adler, H. I., Fisher, W. D. & amp Stapleton, G. E. Akademi Sains Kebangsaan. Abstrak kertas kerja yang dibentangkan pada mesyuarat musim luruh, Durham, North Carolina, 17?19 Oktober 1966. Sains 154, 417 (1966).

Adler, H. I., Fisher, W. D., Cohen, A. & Harigree, A. A. Miniatur Escherichia coli sel kekurangan DNA. Pro. Natl Acad. Sains. USA 57, 321?326 (1967).

Cohen, A., Fisher, W. D., Curtiss, R. 3rd & Adler, H. I. Sifat-sifat DNA dipindahkan ke minisel semasa konjugasi. Simptom Pelabuhan Cold Spring. Kuantiti. Biol. 33, 635?641 (1968).

Friedberg, E. C. Membetulkan Pelan Kehidupan: Akaun Sejarah Penemuan Mekanisme Pembaikan DNA. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1997).

De Lucia, P. & amp Cairns, J. Pengasingan sebuah E coli terikan dengan mutasi yang menjejaskan DNA polimerase. Alam semula jadi 224, 1164?1166 (1969).

Kornberg, T. & Gefter, M. L. sintesis DNA dalam ekstrak bebas sel bagi mutan cacat DNA polimerase. Biokim. Biophys. Res. Commun. 40, 1348?1355 (1970).

Knippers, R. DNA polimerase II. Alam semula jadi 228, 1050?1053 (1970).

Moses, R. E. & amp Richardson, C. C. Satu aktiviti polimerase DNA baru bagi Escherichia coli. I. Pemurnian dan sifat aktiviti yang terdapat dalam E coli PolA1. Biokim. Biophys. Res. Commun. 40, 1557?1564 (1970).

Kornberg, T. & Gefter, M. L. Pemurnian dan sintesis DNA dalam ekstrak bebas sel: sifat DNA polimerase II. Pro. Natl Acad. Sains. USA 68, 761?764 (1971).

Bollum, F. J. & amp Potter, V. R. Thymidine dimasukkan ke dalam asid deoksiribonukleik homogenat hati tikus. J. Am. Kimia. Soc. 79, 3603?3604 (1957).

Hubscher, U., Maga, G. & Spadari, S. Polimerase DNA Eukariotik. Annu. Rev. Biochem. 71, 133?163 (2002).

Kalf, G. F. & Ch'ih, J. J. Pemurnian dan sifat polimerase asid deoksiribonukleik daripada mitokondria hati tikus. J. Biol. Kimia. 243, 4904?4916 (1968).

Meyer, R. R. & amp; Simpson, M. V. Biosintesis DNA dalam mitokondria: pemurnian separa polimerase DNA yang berbeza dari mitokondria hati tikus yang terpencil. Pro. Natl Acad. Sains. USA 61, 130?137 (1968).

Baltimore, D. polimerase DNA yang bergantung kepada RNA dalam virion virus tumor RNA. Alam semula jadi 226, 1209?1211 (1970).

Temin, H. M & amp Mizutani, S. RNA polimerase yang bergantung pada RNA pada virion virus sarkoma Rous. Alam semula jadi 226, 1211?1213 (1970).

Echols, H. & Goodman, M. F. Mekanisme kesetiaan dalam replikasi DNA. Annu. Rev. Biochem. 60, 477?551 (1991).

Rajagopalan, M. et al. Aktiviti protein mutagenesis yang telah dimurnikan UmuC, UmuD', dan RecA dalam pintasan replikatif lesi DNA abasic oleh DNA polimerase III. Pro. Natl Acad. Sains. USA 89, 10777?10781 (1992).

Tang, M. et al. UmuD'2C ialah polimerase DNA yang mudah ralat, Escherichia coli pol V. Pro. Natl Acad. Sains. USA 96, 8919?8924 (1999).

Reuven, N. B., Arad, G., Maor-Shoshani, A. & Livneh, Z. Protein mutagenesis UmuC ialah polimerase DNA yang diaktifkan oleh UmuD', RecA dan SSB dan khusus untuk sintesis translesi. J. Biol. Kimia. 274, 31763?31766 (1999).

Wagner, J. et al. The dinB gen mengekod novel E coli DNA polimerase, DNA Pol IV, terlibat dalam mutagenesis. Mol. sel 4, 281?286 (1999).

Ohmori, H. et al. Keluarga Y polimerase DNA. Mol. sel 8, 7?8 (2001).

Byrnes, J. J., Downey, K. M., Black, V. L. & So, A. G. Polimerase DNA mamalia baharu dengan aktiviti exonuclease 3′ hingga 5′: DNA polimerase δ. Biokimia 15, 2817?2823 (1976).

Bolden, A., Noy, G. P. & amp Weissbach, A. DNA polimerase mitokondria adalah polimerase γ. J. Biol. Kimia. 252, 3351?3356 (1977).

Focher, F. et al. DNA polimerase timus anak lembu δ bebas daripada antigen nuklear sel yang membiak. Asid Nukleik Res. 17, 1805?1821 (1989).

Morrison, A. et al. REV3, a Saccharomyces cerevisiae gen yang fungsinya diperlukan untuk mutagenesis teraruh, diramalkan mengekod polimerase DNA yang tidak penting. J. Bakteriol. 171, 5659?5667 (1989).

Nelson, J. R., Lawrence, C. W. & Hinkle, D. C. Deoxynucleotidyl transferase aktiviti protein REV1 yis. Alam semula jadi 382, 729?731 (1996).


Kandungan

Pada tahun 1956, Arthur Kornberg dan rakannya menemui DNA polimerase I (Pol I), di Escherichia coli. Mereka menerangkan proses replikasi DNA di mana polimerase DNA menyalin urutan asas helai DNA templat. Kornberg kemudiannya dianugerahkan Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Perubatan pada tahun 1959 untuk karya ini. [7] DNA polimerase II ditemui oleh Thomas Kornberg (anak kepada Arthur Kornberg) dan Malcolm E. Gefter pada tahun 1970 sambil menjelaskan lagi peranan Pol I dalam E coli replikasi DNA. [8] Tiga lagi polimerase DNA telah dijumpai di E coli, termasuk DNA polimerase III (ditemui pada tahun 1970-an) dan DNA polimerase IV dan V (ditemui pada tahun 1999). [9]

Fungsi utama DNA polimerase adalah untuk mensintesis DNA daripada deoksiribonukleotida, blok binaan DNA. Salinan DNA dibuat oleh pasangan nukleotida dengan asas yang terdapat pada setiap helai molekul DNA asal. Pasangan ini selalu berlaku dalam kombinasi tertentu, dengan sitosin bersama dengan guanin, dan timin bersama dengan adenin, masing-masing membentuk dua pasangan yang terpisah. Sebaliknya, polimerase RNA mensintesis RNA daripada ribonukleotida daripada RNA atau DNA.

Semasa mensintesis DNA baru, polimerase DNA dapat menambahkan nukleotida bebas hanya pada hujung 3 'helai yang baru terbentuk. Ini menghasilkan pemanjangan helai yang baru terbentuk dalam arah 5'– 3 '.

Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa arah helai yang baru terbentuk (helai anak perempuan) adalah bertentangan dengan arah di mana polimerase DNA bergerak di sepanjang helai templat. Oleh kerana polimerase DNA memerlukan kumpulan 3' OH bebas untuk memulakan sintesis, ia boleh mensintesis hanya dalam satu arah dengan memanjangkan hujung 3' rantai nukleotida sedia ada. Oleh itu, DNA polimerase bergerak di sepanjang helai templat dalam arah 3'-5 ', dan helai putri terbentuk dalam arah 5'-3'. Perbezaan ini membolehkan DNA untai dua terhasil yang terbentuk terdiri daripada dua untaian DNA yang antiselari antara satu sama lain.

Fungsi polimerase DNA tidak begitu sempurna, dengan enzim membuat satu kesalahan untuk setiap bilion pasangan asas yang disalin. Pembetulan ralat adalah hak milik beberapa, tetapi tidak semua polimerase DNA. Proses ini membetulkan kesilapan pada DNA yang baru disintesis. Apabila pasangan asas yang salah dikenali, polimerase DNA bergerak ke belakang oleh satu pasangan asas DNA. Aktiviti eksonuklease 3'–5' enzim membenarkan pasangan asas yang salah dikeluarkan (aktiviti ini dikenali sebagai pembuktian). Setelah pengecutan asas, polimerase dapat memasukkan semula asas yang betul dan replikasi dapat diteruskan ke hadapan. Ini memelihara integriti helai DNA asal yang dihantar ke sel anak perempuan.

Kesetiaan sangat penting dalam replikasi DNA. Ketidakpadanan dalam pasangan asas DNA berpotensi mengakibatkan protein tidak berfungsi dan boleh menyebabkan kanser. Banyak polimerase DNA mengandungi domain exonuclease, yang bertindak dalam mengesan ketidakpadanan pasangan asas dan seterusnya bertindak dalam penyingkiran nukleotida yang salah untuk digantikan dengan yang betul. [10] Bentuk dan interaksi yang sesuai dengan pasangan asas Watson dan Crick adalah yang utama menyumbang kepada pengesanan atau kesilapan. Ikatan hidrogen memainkan peranan penting dalam pengikatan dan interaksi pasangan asas. Hilangnya interaksi, yang terjadi pada ketidakcocokan, dikatakan memicu pergeseran keseimbangan, untuk pengikatan templat-primer, dari polimerase, ke domain eksonuklease. Di samping itu, penggabungan nukleotida yang salah menyebabkan terencat dalam pempolimeran DNA. Kelewatan ini memberi masa untuk DNA ditukar dari tapak polimerase ke tapak exonuclease. Perubahan konformasi yang berbeza dan kehilangan interaksi berlaku pada ketidakpadanan yang berbeza. Dalam ketidakpadanan purin:pirimidin terdapat anjakan pirimidin ke arah alur utama dan purin ke arah alur kecil. Berkaitan dengan bentuk poket pengikat DNA polimerase, pertembungan sterik berlaku antara purin dan residu di alur minor, dan van der Waals yang penting dan interaksi elektrostatik hilang oleh piramidin. [11] Pyrimidine:pirimidin dan purin:purin tidak padan menunjukkan perubahan yang kurang ketara kerana asasnya disesarkan ke arah alur utama, dan kurang halangan sterik dialami. Walau bagaimanapun, walaupun ketidakcocokan yang berbeza menghasilkan sifat sterik yang berbeza, polimerase DNA masih dapat mengesan dan membezakannya dengan sekata dan mengekalkan kesetiaan dalam replikasi DNA. [12] Pempolimeran DNA juga penting untuk banyak proses mutagenesis dan digunakan secara meluas dalam bioteknologi.

Suntingan Struktur

Polimerase DNA yang diketahui mempunyai struktur yang sangat terpelihara, yang bermaksud bahawa subunit pemangkin keseluruhannya sedikit berbeza dari spesies ke spesies, tidak bergantung pada struktur domainnya. Struktur yang dipelihara biasanya menunjukkan fungsi sel yang penting dan tidak boleh diganti, yang penyelenggaraannya memberikan kelebihan evolusi. Bentuknya dapat digambarkan menyerupai tangan kanan dengan ibu jari, jari, dan tapak tangan. Domain kelapa sawit tampaknya berfungsi dalam memangkin pemindahan kumpulan fosforil dalam reaksi pemindahan fosforil. DNA terikat pada tapak tangan apabila enzim aktif. Tindak balas ini dipercayai dikatalisis oleh mekanisme ion dua logam. Domain jari berfungsi untuk mengikat trifosfat nukleosida dengan asas templat. Domain ibu jari memainkan peranan yang berpotensi dalam proses, translokasi dan kedudukan DNA. [13]

Suntingan Proses

Pemangkinan pantas DNA polimerase adalah kerana sifat prosesnya. Prosestiviti ialah ciri enzim yang berfungsi pada substrat polimer. Dalam kes polimerase DNA, tahap prosestiviti merujuk kepada jumlah nukleotida rata-rata yang ditambahkan setiap kali enzim mengikat templat. Polimerase DNA purata memerlukan kira-kira satu saat untuk mencari dan mengikat persimpangan primer / templat. Sebaik sahaja ia terikat, polimerase DNA tanpa proses menambahkan nukleotida pada kadar satu nukleotida sesaat. [14]: 207–208 Polimerase DNA prosesif, menambah banyak nukleotida sesaat, meningkatkan kadar sintesis DNA secara drastik. Tahap prosestiviti adalah berkadar terus dengan kadar sintesis DNA. Kadar sintesis DNA dalam sel hidup pertama kali ditentukan sebagai kadar pemanjangan DNA fag T4 dalam faj yang dijangkiti E coli. Semasa tempoh peningkatan DNA eksponen pada 37 °C, kadarnya ialah 749 nukleotida sesaat. [15]

Keupayaan DNA polimerase meluncur di sepanjang templat DNA memungkinkan peningkatan proses. Terdapat peningkatan dramatik dalam prosestiviti pada garpu replikasi. Peningkatan ini difasilitasi oleh hubungan DNA polimerase dengan protein yang dikenali sebagai penjepit DNA gelongsor. Pengapit adalah berbilang subunit protein yang dikaitkan dalam bentuk cincin. Dengan menggunakan hidrolisis ATP, sekumpulan protein yang dikenali sebagai protein pemuat gelongsor membuka struktur gelang pengapit gelongsor DNA yang membolehkan mengikat dan melepaskan dari helai DNA. Interaksi protein-protein dengan pengapit menghalang polimerase DNA daripada meresap daripada templat DNA, dengan itu memastikan enzim mengikat simpang primer/templat yang sama dan meneruskan replikasi. [14] : 207–208 DNA polimerase mengubah konformasi, meningkatkan pertalian pada pengapit apabila dikaitkan dengannya dan mengurangkan pertalian apabila ia melengkapkan replikasi regangan DNA untuk membenarkan pelepasan daripada pengapit.

Berdasarkan homologi urutan, polimerase DNA dapat dibahagikan lagi kepada tujuh keluarga yang berbeza: A, B, C, D, X, Y, dan RT.

Sesetengah virus juga mengekodkan polimerase DNA khas, seperti polimerase DNA virus Hepatitis B. Ini secara selektif dapat meniru DNA virus melalui pelbagai mekanisme. Retrovirus menyandikan polimerase DNA luar biasa yang dipanggil reverse transcriptase, iaitu polimerase DNA (RdDp) yang bergantung kepada RNA. Ia memolimerisasi DNA dari templat RNA.

Keluarga [16] Jenis-jenis DNA polimerase cukai Contoh Ciri
A Polimerase Replikatif dan Pembaikan Eukariotik dan Prokariotik T7 DNA polimerase, Pol I, Pol γ, θ, dan ν Dua domain exonuclease (3'-5' dan 5'-3')
B Polimerase Replikatif dan Pembaikan Eukariotik dan Prokariotik Pol II, Pol B, Pol ζ, Pol α, δ, και ε 3'-5 exonuclease (membaca pruf) yang virus menggunakan primer protein
C Polimerase Replikatif Prokariotik Pol III Exonuclease 3'-5 (pembacaan bukti)
D Polimerase Replikatif Euryarchaeota PolD (heterodimer DP1/DP2) [17] Tidak ada ciri "tangan", eksonuklease 3'-5 seperti polimerase RNA laras ganda (pembacaan bukti)
X Polimerase Replikatif dan Pembaikan Eukariotik Pol β, Pol σ, Pol λ, Pol μ, dan terminal deoxynucleotidyl transferase templat pilihan 5' fosfatase (hanya Pol β) ciri "tangan" lemah
Y Polimerase Replikatif dan Pembaikan Eukariotik dan Prokariotik Pol ι, Pol κ, Pol η, [18] Pol IV, dan Pol V Sintesis terjemahan [19]
RT Polimerase Replikatif dan Pembaikan Virus, Retrovirus, dan Eukariotik Telomerase, virus Hepatitis B Bergantung pada RNA

Edit polimerase prokariotik

Polimerase prokariotik wujud dalam dua bentuk: polimerase teras dan holoenzim. Inti polimerase mensintesis DNA dari templat DNA tetapi tidak dapat memulakan sintesis itu sendiri atau tepat. Holoenzyme memulakan sintesis dengan tepat.

Pol I Edit

Polimerase keluarga A prokariotik termasuk enzim DNA polimerase I (Pol I), yang dikodkan oleh polA gen dan terdapat di mana-mana dalam kalangan prokariot. Polimerase pembaikan ini terlibat dalam pembaikan eksisi dengan aktiviti exonuclease 3'-5 'dan 5'-3' dan pemprosesan serpihan Okazaki yang dihasilkan semasa sintesis ketinggian helai. [20] Pol I adalah polimerase yang paling banyak, menyumbang & gt95% aktiviti polimerase di E coli namun sel yang kekurangan Pol I didapati menunjukkan aktiviti Pol I dapat digantikan oleh empat polimerase yang lain. Pol saya menambah

15-20 nukleotida sesaat, sekali gus menunjukkan prosestiviti yang lemah. Sebaliknya, Pol I mula menambahkan nukleotida pada primer RNA: simpang templat yang dikenali sebagai asal replikasi (ori). Kira-kira 400 bp hilir dari asalnya, holoenzyme Pol III dipasang dan mengambil alih replikasi dengan kelajuan dan sifat yang sangat proses. [21]

Taq polimerase adalah enzim tahan panas dari keluarga ini yang tidak mempunyai kemampuan membaca semula. [22]

Pol II Suntingan

DNA polimerase II adalah polimerase keluarga B yang dikodkan oleh gen polB. Pol II mempunyai aktiviti exonuclease 3'–5' dan mengambil bahagian dalam pembaikan DNA, replikasi dimulakan semula untuk memintas lesi, dan kehadiran selnya boleh melompat dari

200–300 semasa induksi SOS. Pol II juga dianggap sebagai sandaran kepada Pol III kerana ia boleh berinteraksi dengan protein holoenzim dan mempunyai tahap proses yang tinggi. Peranan utama Pol II dianggap keupayaan untuk mengarahkan aktiviti polimerase di garpu replikasi dan membantu menghentikan ketidakcocokan terminal pintas Pol III. [23]

Pfu DNA polimerase adalah enzim yang tahan panas dari keluarga ini yang terdapat di archaeon hyperthermophilic Pyrococcus furiosus. [24] Klasifikasi terperinci membahagikan keluarga B di archaea menjadi B1, B2, B3, di mana B2 adalah sekumpulan pseudoenzim. Pfu tergolong dalam keluarga B3. PolB lain yang ditemui dalam archaea adalah sebahagian daripada "Casposon", transposon yang bergantung kepada Cas1. [25] Beberapa virus (termasuk polimerase DNA Φ29) dan plasmid mitokondria membawa polB juga. [26]

Pol III Suntingan

DNA polimerase III holoenzim ialah enzim utama yang terlibat dalam replikasi DNA dalam E coli dan tergolong dalam polimerase keluarga C. Ia terdiri daripada tiga rakitan: teras pol III, faktor pemrosesan beta slaid clamp, dan kompleks pengapit penjepit. Inti terdiri daripada tiga subunit: α, pusat aktiviti polimerase, ɛ, pembaca bukti eksonukleolitik, dan θ, yang boleh bertindak sebagai penstabil bagi ɛ. Faktor proses pengapit slaid beta juga terdapat dalam rangkap, satu untuk setiap teras, untuk membuat penjepit yang merangkumi DNA yang memungkinkan proses yang tinggi. [27] Perhimpunan ketiga adalah kompleks pemuat penjepit tujuh-subunit (τ2γδδ′χψ).

Buku teks lama "model trombone" menggambarkan kompleks pemanjangan dengan dua setara enzim teras pada setiap garpu replikasi (RF), satu untuk setiap helai, ketinggalan dan pendahulu. [23] Walau bagaimanapun, bukti terkini daripada kajian molekul tunggal menunjukkan purata tiga persamaan stoikiometrik bagi enzim teras pada setiap RF untuk kedua-dua Pol III dan rakan sejawatannya dalam B. subtilis, PolC. [28] Mikroskopi pendarfluor dalam sel telah mendedahkan bahawa sintesis untai utama mungkin tidak berterusan sepenuhnya, dan Pol III* (iaitu, subunit holoenzim α, ε, τ, δ dan χ tanpa pengapit gelongsor ß2) mempunyai frekuensi tinggi pemisahan daripada RF aktif. [29] Dalam kajian ini, kadar pusing ganti garpu replikasi adalah kira-kira 10s untuk Pol III*, 47s untuk pengapit gelongsor ß2, dan 15m untuk helicase DnaB. Ini menunjukkan bahawa helikase DnaB mungkin kekal dikaitkan secara stabil di RF dan berfungsi sebagai titik nukleasi untuk holoenzim yang kompeten. In vitro kajian molekul tunggal telah menunjukkan bahawa Pol III* mempunyai kadar perolehan RF yang tinggi apabila berlebihan, tetapi kekal stabil dikaitkan dengan garpu replikasi apabila kepekatan mengehadkan. [29] Satu lagi kajian molekul tunggal menunjukkan bahawa aktiviti helikas DnaB dan pemanjangan untai boleh diteruskan dengan kinetik stokastik yang dipisahkan. [29]

Suntingan Pol IV

Dalam E coli, DNA polimerase IV (Pol IV) adalah polimerase DNA rawan kesalahan yang terlibat dalam mutagenesis yang tidak disasarkan. [30] Pol IV adalah polimerase Keluarga Y yang dinyatakan oleh gen dinB yang dihidupkan melalui induksi SOS yang disebabkan oleh polimerase terhenti di garpu replikasi. Semasa induksi SOS, pengeluaran Pol IV meningkat sepuluh kali ganda dan salah satu fungsi pada masa ini adalah untuk mengganggu prosestiviti holoenzim Pol III. Ini mewujudkan pusat pemeriksaan, menghentikan replikasi dan memberi masa untuk membaiki lesi DNA melalui laluan pembaikan yang sesuai. [31] Fungsi lain dari Pol IV adalah untuk melakukan sintesis translesi pada garpu replikasi terhenti seperti, misalnya, melewati aduan N2-deoxyguanine pada kadar yang lebih cepat daripada memindahkan DNA yang tidak rosak. Sel yang tidak mempunyai gen dinB mempunyai kadar mutagenesis yang lebih tinggi yang disebabkan oleh agen merosakkan DNA. [32]

Suntingan Pol V

DNA polimerase V (Pol V) adalah polimerase DNA keluarga Y yang terlibat dalam tindak balas SOS dan mekanisme pembaikan DNA sintesis translesion. [33] Transkripsi Pol V melalui gen umuDC sangat diatur untuk menghasilkan hanya Pol V apabila DNA yang rosak ada di dalam sel yang menghasilkan tindak balas SOS. Polimerase yang terhenti menyebabkan RecA terikat pada ssDNA, yang menyebabkan protein LexA dicerna secara automatik. LexA kemudian kehilangan kemampuannya untuk menekan transkripsi operon umuDC. Nukleoprotein RecA-ssDNA yang sama posttranslation mengubah protein UmuD menjadi protein UmuD. UmuD dan UmuD' membentuk heterodimer yang berinteraksi dengan UmuC, yang seterusnya mengaktifkan aktiviti pemangkin polimerase umuC pada DNA yang rosak. [34] Di E. coli, model "alat tali" polimerase untuk menukar pol III dengan pol IV di garpu replikasi terhenti, di mana kedua polimerase mengikat serentak dengan β-penjepit, telah diusulkan. [35] Walau bagaimanapun, penglibatan lebih daripada satu TLS polimerase bekerja berturut-turut untuk memotong lesi belum ditunjukkan di E. coli. Lebih-lebih lagi, Pol IV dapat menjadi pemangkin penyisipan dan pemanjangan dengan kecekapan tinggi, sedangkan pol V dianggap sebagai polimerase SOS TLS utama. Salah satu contohnya ialah pintasan pautan silang timah intra untai guanin di mana ia ditunjukkan berdasarkan perbezaan perbezaan tanda tangan mutasi kedua polimerase, bahawa pol IV dan pol V bersaing untuk TLS pautan silang intra-untai. [35]

Keluarga D Sunting

Pada tahun 1998, keluarga D polimerase DNA ditemui di Pyrococcus furiosus dan Methanococcus jannaschii. [36] Kompleks PolD adalah heterodimer dari dua rantai, masing-masing dikodkan oleh DP1 (proofreading kecil) dan DP2 (pemangkin besar). Tidak seperti polimerase DNA lain, struktur dan mekanisme teras pemangkin DP2 menyerupai polimerase RNA berbilang subunit. Antara muka DP1-DP2 menyerupai jari zink polimerase Kelas B Eukariotik dan subunit kecilnya. [17] DP1, exonuclease seperti Mre11, [37] kemungkinan merupakan pendahulu subunit kecil Pol α dan ε, yang memberikan kemampuan membaca semula yang kini hilang di Eukaryotes. [25] Domain HSH N-terminalnya mirip dengan protein AAA, terutama subunit Pol III δ dan RuvB, dalam struktur. [38] DP2 mempunyai domain KH Kelas II. [17] Pyrococcus abyssi polD lebih tahan panas dan lebih tepat daripada Taq polimerase, tetapi belum dikomersialkan. [39] Telah diusulkan bahawa polimerase DNA keluarga D adalah yang pertama berkembang dalam organisma selular dan bahawa polimerase replikasi dari Leluhur Sel Sel Universal Terakhir (LUCA) adalah milik keluarga D. [40]

Edit polimerase DNA eukariotik

Polimerase β, λ, σ, μ (beta, lambda, sigma, mu) dan TdT Edit

Polimerase Keluarga X mengandungi polimerase eukariotik pol β (beta) yang terkenal, serta polimerase eukariotik lain seperti Pol σ (sigma), Pol λ (lambda), Pol μ (mu), dan Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). Polimerase keluarga X ditemui terutamanya dalam vertebrata, dan beberapa ditemui dalam tumbuhan dan kulat. Polimerase ini mempunyai kawasan yang sangat terpelihara yang merangkumi dua motif helix-hairpin-helix yang penting dalam interaksi DNA-polimerase. Satu motif terletak dalam domain 8 kDa yang berinteraksi dengan DNA hiliran dan satu motif terletak dalam domain ibu jari yang berinteraksi dengan untaian primer. Pol β, yang dikodkan oleh gen POLB, diperlukan untuk pembaikan eksisi asas patch pendek, jalur pembaikan DNA yang penting untuk memperbaiki asas alkilasi atau pengoksidaan serta tapak abasik. Pol λ dan Pol μ, masing-masing dikodkan oleh gen POLL dan POLM, terlibat dalam penyambungan hujung yang tidak homologis, suatu mekanisme untuk bergabung semula dengan rehat untaian ganda DNA kerana hidrogen peroksida dan radiasi pengion. TdT dinyatakan hanya dalam tisu limfoid, dan menambahkan "n nukleotida" pada rehat dua helai yang terbentuk semasa penggabungan V (D) J untuk mempromosikan kepelbagaian imunologi. [41]

Polimerase α, δ dan ε (alpha, delta, dan epsilon) Edit

Pol α (alfa), Pol δ (delta), dan Pol ε (epsilon) adalah ahli Polimerase Keluarga B dan merupakan polimerase utama yang terlibat dengan replikasi DNA nuklear. Kompleks Pol α (kompleks primase pol α-DNA) terdiri daripada empat subunit: subunit katalitik POLA1, subunit pengatur POLA2, dan subunit primase kecil dan besar masing-masing PRIM1 dan PRIM2. Sebaik sahaja primase telah mencipta primer RNA, Pol α memulakan replikasi memanjangkan primer dengan

20 nukleotida. [42] Oleh kerana prosesnya yang tinggi, Pol δ mengambil alih sintesis helai terkemuka dan ketinggalan dari Pol α. [14]: 218-219 Pol δ dinyatakan oleh gen POLD1, mencipta subunit katalitik, POLD2, POLD3, dan POLD4 mewujudkan subunit lain yang berinteraksi dengan Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), yang merupakan penjepit DNA yang membolehkan Pol δ untuk mempunyai proses. [43] Pol ε dikodkan oleh gen POLE1, subunit katalitik, POLE2, dan POLE3. Telah dilaporkan bahawa fungsi Pol ε adalah untuk memanjangkan helai utama semasa replikasi, [44] [45] sementara Pol δ terutama meniru helai ketinggalan namun, bukti terbaru menunjukkan bahawa Pol δ mungkin mempunyai peranan dalam meniru helai utama DNA juga. [46] Rantau "peninggalan polimerase" terminal-C Pol ε, walaupun tidak diperlukan untuk aktiviti polimerase, [47] dianggap penting untuk kecergasan sel. Rantau C-terminus dianggap menyediakan pusat pemeriksaan sebelum memasuki anafasa, memberikan kestabilan kepada holoenzim, dan menambah protein kepada holoenzim yang diperlukan untuk memulakan replikasi. [48] ​​Pol ε mempunyai domain "sawit" yang lebih besar yang menyediakan prosestiviti tinggi tanpa PCNA. [47]

Berbanding polimerase Keluarga B yang lain, keluarga exonuclease DEDD yang bertanggungjawab untuk membaca pruf dinyahaktifkan dalam Pol α. [25] Pol ε adalah unik kerana ia mempunyai dua domain jari zink dan salinan tidak aktif polimerase B keluarga lain dalam terminal-Cnya. Kehadiran jari zink ini mempunyai implikasi pada asal-usul Eukariota, yang dalam hal ini diletakkan ke dalam Asgard kumpulan dengan polimerase B3 archaeal. [49]

Polimerase η, ι dan κ (eta, iota, dan kappa) Edit

Pol η (eta), Pol ι (iota), dan Pol κ (kappa), adalah polimerase DNA Keluarga Y yang terlibat dalam pembaikan DNA dengan sintesis terjemahan dan masing-masing dikod oleh gen POLH, POLI, dan POLK. Anggota Keluarga Y mempunyai lima motif umum untuk membantu mengikat substrat dan terminal primer dan semuanya merangkumi domain ibu jari tangan kanan, telapak tangan dan jari dengan domain tambahan seperti jari kelingking (LF), domain yang berkaitan dengan polimerase (PAD), atau pergelangan tangan. Laman aktif, bagaimanapun, berbeza antara ahli keluarga kerana berlainan luka yang diperbaiki. Polimerase dalam Keluarga Y ialah polimerase berkesetiaan rendah, tetapi telah terbukti lebih baik daripada bahaya kerana mutasi yang menjejaskan polimerase boleh menyebabkan pelbagai penyakit, seperti kanser kulit dan Varian Xeroderma Pigmentosum (XPS). Kepentingan polimerase ini dibuktikan dengan fakta bahawa pengekodan gen DNA polimerase η dirujuk sebagai XPV, kerana kehilangan gen ini mengakibatkan penyakit Varian Xeroderma Pigmentosum. Pol η sangat penting untuk membenarkan sintesis translesion yang tepat terhadap kerosakan DNA akibat sinaran ultraviolet. Fungsi Pol κ tidak difahami sepenuhnya, tetapi penyelidik telah menemui dua fungsi yang berkemungkinan. Pol κ dianggap bertindak sebagai pemanjang atau penyusun asas tertentu pada lesi DNA tertentu. Ketiga-tiga polimerase sintesis translesion, bersama dengan Rev1, direkrut ke luka yang rosak melalui polimerase DNA replikasi terhenti. Terdapat dua jalan pembaikan kerosakan yang menyebabkan para penyelidik menyimpulkan bahawa jalur yang dipilih bergantung pada helai mana yang mengandungi kerosakan, helai yang terdepan atau ketinggalan. [50]

Polimerase Rev1 dan ζ (zeta) Edit

Pol ζ lain polimerase keluarga B, terbuat dari dua subunit Rev3, subunit katalitik, dan Rev7 (MAD2L2), yang meningkatkan fungsi pemangkin polimerase, dan terlibat dalam sintesis translesion. Pol ζ tidak mempunyai aktiviti eksonukase 3 'hingga 5', unik kerana ia dapat memanjangkan primer dengan ketidakcocokan terminal. Rev1 mempunyai tiga kawasan kepentingan dalam domain BRCT, domain pengikat ubiquitin dan domain C-terminal dan mempunyai keupayaan pemindahan dCMP, yang menambah lesi bertentangan deoxycytidine yang akan menghalang polimerase replika Pol δ dan Pol ε. Polimerase terhenti ini mengaktifkan kompleks ubiquitin yang seterusnya memisahkan polimerase replikasi dan merekrut Pol ζ dan Rev1. Bersama-sama Pol ζ dan Rev1 menambah deoxycytidine dan Pol ζ melampaui lesi. Melalui proses yang belum ditentukan, Pol ζ memisahkan dan mereplikasi polimerase mengaitkan semula dan meneruskan replikasi. Pol ζ dan Rev1 tidak diperlukan untuk replikasi, tetapi kehilangan gen REV3 dalam ragi pemula dapat menyebabkan peningkatan kepekaan terhadap agen yang merosakkan DNA akibat keruntuhan garpu replikasi di mana polimerase replikasi telah terhenti. [51]

Edit Telomerase

Telomerase adalah ribonukleoprotein yang berfungsi untuk meniru hujung kromosom linier kerana polimerase DNA normal tidak dapat meniru hujung, atau telomer. Jalur 3 helai tunggal kromosom untai dua dengan urutan 5'-TTAGGG-3 'merekrut telomerase. Telomerase bertindak seperti polimerase DNA lain dengan memanjangkan hujung 3 ', tetapi, tidak seperti polimerase DNA lain, telomerase tidak memerlukan templat. Subunit TERT, contoh transkripase terbalik, menggunakan subunit RNA untuk membentuk persimpangan templat primer yang membolehkan telomerase memanjangkan hujung 3' hujung kromosom. Pengurangan saiz telomer secara beransur-ansur akibat banyak replikasi sepanjang hayat dianggap dikaitkan dengan kesan penuaan. [14]: 248–249

Polimerase γ, θ dan ν (gamma, theta dan nu) Edit

Pol γ (gamma), Pol θ (theta), dan Pol ν (nu) adalah polimerase Keluarga A. Pol γ, dikodkan oleh gen POLG, telah lama dianggap sebagai satu-satunya polimerase mitokondria. Walau bagaimanapun, penyelidikan baru-baru ini menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya Pol β (beta), keluarga X polimerase, juga terdapat di mitokondria. [52] [53] Apa-apa mutasi yang membawa kepada Pol γ yang terhad atau tidak berfungsi mempunyai kesan yang signifikan terhadap mtDNA dan merupakan penyebab yang paling biasa dari gangguan mitokondria yang diwarisi autosomal. [54] Pol γ mengandungi domain polimerase C-terminus dan domain exonuclease 3'– 5 'N-terminal yang dihubungkan melalui kawasan penghubung, yang mengikat subunit aksesori. Subunit aksesori mengikat DNA dan diperlukan untuk prosestiviti Pol γ. Mutasi titik A467T di rantau penghubung bertanggungjawab untuk lebih daripada satu pertiga daripada semua gangguan mitokondria yang berkaitan dengan Pol γ. [55] Walaupun banyak homolog Pol θ, yang dikodkan oleh gen POLQ, ditemui dalam eukariota, fungsinya tidak difahami dengan jelas. Urutan asid amino dalam terminal-C adalah apa yang mengklasifikasikan Pol θ sebagai polimerase Keluarga A, walaupun kadar ralat untuk Pol θ lebih berkait rapat dengan polimerase Keluarga Y. Pol θ memperluas istilah primer yang tidak sesuai dan dapat memintas laman web abasik dengan menambahkan nukleotida. Ia juga mempunyai aktiviti Deoxyribophosphodiesterase (dRPase) dalam domain polimerase dan boleh menunjukkan aktiviti ATPase berdekatan dengan ssDNA. [56] Pol ν (nu) dianggap paling berkesan daripada enzim polimerase. [57] Namun, DNA polimerase nu memainkan peranan aktif dalam pembaikan homologi semasa tindak balas selular terhadap pautan silang, memenuhi peranannya dalam kompleks dengan helikase. [57]

Tumbuhan menggunakan dua polimerase Keluarga A untuk menyalin genom mitokrondria dan plastid. Mereka lebih serupa dengan bakteria Pol I daripada yang sama dengan mamallian Pol γ. [58]

Suntingan transkripase terbalik

Retrovirus mengekodkan polimerase DNA yang tidak biasa yang disebut transkripase terbalik, yang merupakan polimerase DNA yang bergantung pada RNA (RdDp) yang mensintesis DNA dari templat RNA. Keluarga transkripase terbalik mengandungi kedua-dua fungsi polimerase DNA dan fungsi RNase H, yang merendahkan pasangan asas RNA kepada DNA. Contoh retrovirus ialah HIV. [14]: Transkripase terbalik biasanya digunakan dalam penguatan RNA untuk tujuan penyelidikan. Dengan menggunakan templat RNA, PCR dapat menggunakan transkripase terbalik, membuat templat DNA. Templat DNA baru ini kemudian dapat digunakan untuk penguatan PCR khas. Produk percubaan seperti itu diperkuatkan produk PCR dari RNA. [9]

Setiap zarah retrovirus HIV mengandungi dua genom RNA, tetapi, setelah jangkitan, setiap virus menghasilkan hanya satu provirus. [59] Selepas jangkitan, transkripsi terbalik disertakan dengan penukaran templat antara dua salinan genom (penggabungan semula pilihan salinan). [59] Daripada 5 hingga 14 peristiwa penggabungan semula setiap genom berlaku pada setiap kitaran replikasi. [60] Pensuisan templat (penggabungan semula) nampaknya perlu untuk mengekalkan integriti genom dan sebagai mekanisme pembaikan untuk menyelamatkan genom yang rosak. [61] [59]

Bakteriofaj T4 DNA polimerase Sunting

Bacteriophage (phage) T4 mengodkan polimerase DNA yang memangkinkan sintesis DNA dalam arah 5’ hingga 3’. [62] Polimerase fag juga mempunyai aktiviti exonuclease yang bertindak dalam arah 3’ hingga 5’, [63] dan aktiviti ini digunakan dalam membaca pruf dan menyunting pangkalan yang baru dimasukkan. [64] Mutan faj dengan polimerase DNA sensitif suhu, apabila ditanam pada suhu permisif, diperhatikan mengalami penggabungan semula pada frekuensi yang kira-kira dua kali ganda lebih tinggi daripada fag jenis liar. [65]

Telah dicadangkan bahawa perubahan mutasi dalam polimerase DNA fag boleh merangsang penukaran untaian templat (penggabungan semula pilihan salinan) semasa replikasi. [65]


Cabaran dengan polimerase DNA tradisional

Polimerase DNA tradisional yang digunakan dalam PCR biasanya mempunyai proses yang rendah dan hanya menggabungkan beberapa nukleotida setiap peristiwa yang mengikat. Ini kerana mereka sering kekurangan faktor prosestiviti polimerase, yang mengakibatkan:

  • Memerlukan satu minit atau lebih untuk memperkuat templat DNA 1 kb,
  • Tidak dapat menguatkan amplikon lebih panjang daripada 4–5 kb,
  • Terpengaruh oleh perencat seperti etanol, EDTA atau faktor lain dalam sampel DNA.

Prosestiviti enzim PCR yang rendah boleh menjadi faktor pengehad untuk kecekapan PCR. Oleh itu, meningkatkan proses DNA polimerase penting untuk meningkatkan prestasi PCR dan membantu mengaktifkan aplikasi baru.


Polimerase DNA

Penyelenggaraan maklumat yang tertanam dalam urutan DNA genomik adalah penting untuk kehidupan. DNA polimerase memainkan peranan penting dalam proses kompleks yang mengekalkan integriti genetik. Selain tugas mereka dalam vivo, polimerase DNA adalah tenaga kerja dalam pelbagai aplikasi bioteknologi seperti tindak balas rantai polimerase (PCR), pengklonan cDNA, penjujukan genom, diagnostik berasaskan asid nukleik dan dalam teknik untuk menganalisis DNA purba dan sebaliknya rosak. Selain itu, beberapa penyakit berkaitan dengan kecacatan DNA polimerase, dan kemoterapi melalui perencatan polimerase DNA digunakan untuk melawan jangkitan HIV, Herpes dan Hepatitis B dan C. Kami baru-baru ini menyaksikan penemuan banyak polimerase DNA baru dalam virus, bakteria, archaea dan eukariota dengan sifat khusus yang fungsi fisiologinya baru mula difahami. Buku ini merangkum pengetahuan terkini mengenai enzim-enzim menarik ini. Ia bertujuan untuk khalayak luas daripada saintis asas, kepada makmal diagnostik dan kepada doktor yang mencari pemahaman yang lebih baik tentang enzim yang menarik ini.


Bahagian 2: Mekanisme Replikasi DNA Kromosom: Permulaan Replikasi DNA

00:00:0809 Hai. Nama saya Steve Bell,
00:00:0915 dan saya seorang profesor biologi di MIT
00:00:1123 dan seorang penyiasat Institut Perubatan Howard Hughes.
00: 00: 1422 Dan apa yang ingin saya ceritakan sekarang
00:00:1612 ialah mekanisme yang mengawal
00: 00: 2019 permulaan replikasi DNA pada kromosom.
00:00:2210 Ini adalah kesinambungan perbincangan saya sebelum ini
00:00:2528 peristiwa yang berlaku pada garpu replikasi.
00:00:3201 Kini, proses ini melibatkan dua peristiwa penting.
00:00:3319 Pertama, lepaskan sebahagian daripada DNA
00: 00: 3703 untuk membuat templat helai tunggal
00:00:3911 untuk memasang replisome pada.
00: 00: 4028 Dan, kedua, anda perlu
00:00:4300 kumpulkan dua salinan replisome,
00:00:4426 kerana semua genomik
00:00:4805 atau asal-usul kromosom replikasi
00:00:4924 memulakan replikasi DNA secara dua arah,
00: 00: 5300 bermaksud bahawa mereka.
00:00:5406 replisomes yang dipasang
00: 00: 5707 menjauh dari kedua arah
00:00:5923 dari tapak permulaan replikasi.
00:01:0116 Jadi, tapak permulaan replikasi DNA
00:01:0304 dipanggil asal-usul replikasi,
00:01:0613 dan di sinilah DNA untai tunggal pertama terbentuk
00: 01: 0808 dan di mana sintesis DNA pertama berlaku.
00:01:0923 Mereka boleh menembak dengan pelbagai yang dipanggil kecekapan,
00: 01: 1307 yang ditakrifkan sebagai peratusan pembahagian sel
00:01:1528 di mana asal memulakan replikasi DNA.
00:01:1900 Sesetengah asal mempunyai kecekapan yang tinggi,
00:01:2125 yang lain mempunyai lebih rendah,
00:01:2306 dan saya akan memberitahu anda lebih lanjut mengenainya sebentar lagi.
00: 01: 2516 Sekarang, semua DNA yang ditiru
00:01:2804 oleh dua replisomes yang terbentuk
00: 01: 2928 pada setiap asal replikasi.
00:01:3117 dan, peringatan,
00:01:3313 semua asal kromosom adalah dua arah.
00:01:3505 bahawa DNA dipanggil replika.
00:01:3721 Dan ini berpunca daripada model yang dicadangkan pada tahun 1963
00: 01: 4025 oleh Jacob, Brenner, dan Cuzin
00:01:4218 untuk mekanisme permulaan
00: 01: 4501 replikasi bakteria.
00:01:4704 Ia adalah model yang sangat mudah.
00:01:4824 Mereka mencadangkan hanya dua komponen:
00:01:5017 replikator dan pemula.
00:01:5221 Replikator ialah jujukan DNA
00: 01: 5520 yang diperlukan untuk memulakan replikasi DNA.
00:01:5807 Pemula adalah protein
00: 02: 0021 yang dicadangkan untuk diikat dengan peniru
00:02:0224 dan mencetuskan permulaan replikasi DNA.
00:02:0624 Sekarang, replikator,
00:02:0906 walaupun ia biasanya bertindih dengan asal replikasi,
00:02:1024 tidak sama dengan itu,
00: 02: 1225 dan sebaliknya adalah semua urutan
00:02:1512 yang diperlukan.
00: 02: 1611 Dan ini kadang-kadang agak sukar difahami,
00:02:1810 tetapi fikirkannya dari segi transkripsi,
00:02:2027 di mana penganjur adalah semua urutan
00:02:2329 diperlukan untuk mengawal selia permulaan transkripsi dengan betul
00:02:2707 daripada gen,
00: 02: 2818 tetapi laman web permulaan transkrip
00:02:3008 adalah urutan yang sangat spesifik
00: 02: 3211 di mana permulaan sebenarnya berlaku.
00:02:3406 Dalam analogi itu,
00:02:3524 promoter adalah bersamaan dengan replikator,
00:02:3805 dan tapak permulaan transkrip
00:02:3922 adalah bersamaan dengan asal replikasi.
00: 02: 4308 Jadi, inilah asal usulnya
00:02:4720 dan bagaimana replikator itu.
00: 02: 4915 bagaimana ia diedarkan di seluruh kromosom?
00:02:5112 Jadi, dalam E. coli,
00:02:5500 tidak menghairankan, di mana terdapat satu asal replikasi,
00:02:5613 asal usul adalah 100% cekap.
00:02:5822 Jika asal tidak menyala,
00: 03: 0018 itu bermaksud salah satu daripada dua sel anak perempuan
00:03:0202 tidak mendapat keseluruhan kromosom.
00: 03: 0513 Ini berbeza dalam sel eukariotik,
00:03:0713 di mana terdapat banyak, banyak asal usul.
00:03:0903 Apa yang ditemui ialah kebanyakan asal usul
00:03:1110 jangan mulakan 100% masa,
00:03:1307 tetapi tidak mengapa,
00: 03: 1501 kerana ketika mereka tidak memulakan,
00:03:1624 garpu replikasi di kedua-dua belah
00: 03: 1901 akan meniru di rantau ini
00:03:2029 bahawa mereka akan meniru sebaliknya,
00:03:2300 kerana terdapat banyak lebihan kapasiti replikasi.
00:03:2629 Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa
00:03:2826 mana-mana asal yang tidak bermula
00: 03: 3011 tetapi ditiru
00:03:3123 tidak diaktifkan.
00: 03: 3308 Oleh itu, anda tidak pernah mempunyai inisiatif asal
00:03:3512 selepas ia direplikasi oleh garpu bersebelahan.
00:03:3817 Kini, satu lagi ciri menarik replikasi eukariotik
00:03:4200 ialah apabila asal mula dimulakan
00:03:4506 adalah ciri asal yang berbeza.
00: 03: 4612 Sebilangan akan bermula lebih awal semasa fasa S kitaran sel,
00:03:4929 masa dalam kitaran sel eukariotik
00: 03: 5221 apabila replikasi DNA berlaku,
00:03:5420 yang lain akan meniru di tengah,
00:03:5600 dan masih lagi yang lain akan meniru lewat dalam fasa S.
00:03:5824 Dan ia agak tidak jelas pada mulanya
00:04:0203 mengapa anda ingin mengedarkan ini.
00: 04: 0316 Mengapa tidak meniru semuanya sekaligus?
00:04:0522 Tetapi ia lebih jelas apabila anda berfikir tentang fakta itu
00: 04: 0829 bahawa kadangkala anda akan mengalami kerosakan pada DNA anda
00:04:1109 -- ini boleh berlaku dengan
00:04:1307 perubahan mendadak dalam persekitaran anda --
00:04:1707 dan jika anda melakukannya dan anda menghentikan dua garpu,
00:04:1900 dan mereka tidak meniru DNA campur tangan,
00: 04: 2228 satu-satunya cara untuk menyelamatkan keadaan itu
00:04:2510 adalah untuk memulakan replikasi
00: 04: 2709 antara dua garpu itu
00:04:2825 dan buat dua replisomes baharu
00:04:3011 yang boleh mengisi jurang itu.
00:04:3126 Dan dengan menempah subset asal
00:04:3410 untuk memulakan lewat dalam fasa S,
00: 04: 3610 anda akan meningkatkan kemungkinan
00:04:3826 bahawa anda boleh membetulkan jurang
00: 04: 4027 yang disebabkan oleh kerosakan DNA
00:04:4225 dan garpu replikasi terhenti.
00:04:4526 Okay?
00:04:4724 Jadi, kita telah bercakap tentang asal usul,
00:04:5024 mari kita bincangkan tentang bagaimana permulaan berlaku?
00: 04: 5210 Jadi, kita akan bermula dengan permulaan replikasi DNA pada bakteria.
00:04:5501 Jadi, ini adalah ilustrasi asal usul replikasi E. coli.
00: 04: 5913 Ia mempunyai 5 salinan
00:05:0123 daripada apa yang dipanggil ulangan 9-mer,
00:05:0304 yang merupakan tapak yang mengikat
00:05:0508 untuk protein pemula bakteria,
00:05:0621 yang dipanggil DNA,
00: 05: 0814 dan 3 salinan ulangan 13-mer,
00:05:1103 yang kaya dengan AT,
00: 05: 1226 urutan DNA yang mudah dilepaskan.
00:05:1526 Sekarang, apabila DNA hadir,
00:05:2014 iaitu. dan aktif dalam sel,
00:05:2200 dan ini adalah langkah yang sangat terkawal
00: 05: 2403 dalam proses dalam sel bakteria,
00:05:2624 ia akan terikat pada jujukan 9-mer.
00: 05: 3110 Ini giliran membentuk filamen heliks,
00:05:3414 yang memesongkan DNA,
00:05:3619 menyebabkan DNA itu terikat
00:05:3913 untuk mempunyai superhelicity positif,
00:05:4028 dan DNA bersebelahan dengan, dalam cara pampasan,
00: 05: 4428 menghasilkan superhelicity negatif,
00:05:4615 yang suka berehat
00: 05: 4906 dari kawasan 13-mer yang berdekatan.
00:05:5126 Menariknya,
00:05:5320 DNA yang membentuk filamen ini
00:05:5519 sebenarnya boleh memanjangkan filamen itu
00:05:5724 dengan mengikat DNA untai tunggal
00: 05: 5918 daripada DNA untai dua,
00:06:0123 walaupun ia hanya melakukan ini pada helai atas,
00: 06: 0408 seperti yang digambarkan di sini,
00:06:0603 bukan pada kedua-dua helai.
00:06:0807 Sekarang, pada ketika ini,
00:06:1003 kami telah mencapai satu acara penting,
00:06:1108 iaitu untuk melepaskan DNA pada asalnya,
00: 06: 1329 tetapi kita jelas kekurangan
00:06:1528 kebanyakan jentera yang lain,
00: 06: 1713 dan perkara seterusnya yang kita perlukan untuk memulakan replikasi
00:06:2020 adalah untuk memuatkan helicase replikatif.
00:06:2301 dengan helikase DnaB,
00:06:2507 helikas replikatif.
00:06:2626 Kini, ternyata ia tidak sampai ke asalnya sendiri
00: 06: 3029 ia terikat dengan protein lain, DnaC,
00:06:3300 yang dipanggil pemuat helicase,
00: 06: 3504 dan ia mempunyai banyak sifat penting
00:06:3709 yang menjadikannya sesuai untuk memuatkan helikase pada DNA.
00:06:4122 Jadi, satu sifat ialah apabila DnaC terikat kepada DnaB,
00:06:4604 ia menyahaktifkan aktiviti helikasenya,
00:06:4710 menghalangnya daripada bertindak di kawasan bukan asal genom.
00: 06: 5119 Kedua, DnaC menyebabkan cincin DnaB
00:06:5513 untuk membukanya sedemikian rupa
00: 06: 5817 cukup ruang untuk dimuatkan
00:07:0102 DNA untai tunggal
00:07:0403 supaya ia boleh mendapatkan akses ke
00:07:0529 saluran pusat struktur cincin heksamerik.
00:07:1009 Harta ketiga yang penting ialah itu
00: 07: 1221 DnaC mempunyai pertalian dengan DnaA,
00:07:1508 yang merekrut kompleks DnaB-C
00: 07: 1816 ke DNA helai tunggal
00:07:2023 dan membenarkannya sekarang
00:07:2317 mengelilingi DNA,
00:07:2504 jadi ia mengikat sedemikian rupa sehingga sekarang
00:07:2705 mengelilingi DNA untai tunggal.
00: 07: 2904 Sekarang, yang penting,
00:07:3100 bukan sahaja kompleks DnaB-C
00: 07: 3305 beban pada helai atas
00:07:3513 yang mempunyai DNA yang dikaitkan dengannya,
00:07:3716 tetapi ia juga dimuatkan pada helai bawah,
00:07:3908 tetapi dalam orientasi yang bertentangan,
00:07:4026 supaya ia akan meninggalkan replikasi.
00: 07: 4314 asal dalam arah yang bertentangan.
00:07:4603 Jadi, anda boleh melihatnya di bahagian atas
00: 07: 4802 ia akan bergerak ke kiri,
00:07:4919 di bahagian bawah ia akan bergerak ke kanan.
00:07:5304 Sekarang, kami tidak faham secara terperinci
00:07:5508 bagaimana kompleks DnaB-C kedua itu direkrut,
00:07:5808 walaupun terdapat teori yang mencadangkan bahawa
00: 08: 0026 DnaA, yang juga mempunyai hubungan dengan DnaB,
00:08:0411 boleh menggunakan interaksi itu
00: 08: 0617 untuk merekrut kompleks B-C kedua
00:08:0805 dalam orientasi yang bertentangan.
00:08:1025 Sekarang, pada ketika ini,
00:08:1203 anda akan ingat bahawa kompleks B-C tidak aktif,
00:08:1505 jadi helicase belum aktif lagi.
00: 08: 1725 Walaupun begitu, anda akan ingat bahawa
00:08:2105 interaksi antara primase DNA
00: 08: 2302 dan helicase
00:08:2418 merangsang primase untuk mensintesis primer baharu,
00:08:2702 dan itulah langkah seterusnya dalam proses ini.
00:08:2911 Primase DNA direkrut,
00:08:3202 mengikat pada helicase,
00: 08: 3318 dan mensintesis buku asas,
00:08:3520 dan sesuatu tentang proses ini
00: 08: 3800 menyebabkan subunit DnaC dilepaskan.
00:08:4025 Sekali lagi, kami tidak faham bahawa secara terperinci,
00:08:4304 tetapi itu jelas langkah di mana ini berlaku,
00:08:4507 dan kini anda mempunyai helikas aktif,
00:08:4708 yang boleh bergerak ke kanan dan kiri
00: 08: 5007 - atas ke kiri, bawah ke kanan -
00:08:5214 untuk melepaskan lebih banyak DNA,
00: 08: 5409 sehingga anda mendapat wilayah yang belum dilanjutkan.
00:08:5721 Sekarang, pada ketika ini, kita mempunyai dua persimpangan templat primer
00:09:0111 yang boleh dikenali oleh holoenzim DNA polimerase III,
00:09:0406 muatkan pengapit gelongsor,
00:09:0617 dan kemudian pengapit gelongsor boleh dikenali
00: 09: 0807 oleh salah satu daripada tiga enzim DNA polimerase III.
00:09:1206 Ia kemudiannya akan memulakan sintesis untaian terkemuka.
00: 09: 1514 Kemudian, pada tahap tertentu ditentukan oleh pertalian
00:09:1822 antara helikase dan primase,
00:09:2020 buku asas kedua akan disintesis.
00:09:2223 Itu akan diiktiraf oleh pemuat pengapit
00:09:2428 dan subunit polimerase kedua,
00: 09: 2707 dan kemudian anda telah memulakan
00:09:2913 kedua-dua sintesis helai terkemuka dan ketinggalan,
00: 09: 3116 dan ini benar-benar titik permulaan
00:09:3306 yang kita bincangkan dari segi fungsi
00:09:3524 daripada replisome semasa pemanjangan,
00:09:3723 jadi anda tahu apa yang berlaku dari sini.
00:09:4015 Sekarang, saya mahu membuat beberapa perkara lain
00: 09: 4307 pada ketika ini.
00:09:4403 Anda akan perhatikan bahawa hanya ada satu
00: 09: 4722 protein pengikat DNA khusus urutan yang terlibat dalam proses ini.
00:09:4909 Kebanyakan proses didorong
00:09:5209 oleh sama ada interaksi protein-protein
00:09:5418 atau tidak khusus
00:09:5629 atau interaksi protein-DNA khusus struktur.
00: 09: 5905 Jadi, sebagai contoh,
00:10:0107 pengiktirafan persimpangan templat primer
00: 10: 0229 adalah urutan-tidak spesifik,
00:10:0419 tetapi sangat khusus untuk struktur tertentu,
00:10:0800 iaitu buku asas dengan 3' OH yang tersedia
00:10:1118 dan kawasan terkandas tunggal bersebelahan
00:10:1324 untuk polimerase DNA yang akan digunakan.
00: 10: 1707 Baiklah?
00:10:1808 Dan itu benar juga untuk primase
00: 10: 2006 berinteraksi dengan helicase
00:10:2203 dan holoenzim DNA polimerase III
00:10:2419 berinteraksi dengan helikase juga.
00:10:2707 Jadi, ini dibina bukan oleh
00:10:2917 siri interaksi khusus jujukan,
00: 10: 3113 tetapi oleh beberapa siri
00:10:3324 interaksi khusus protein-protein
00: 10: 3515 atau interaksi khusus struktur.
00:10:3827 Okay, jadi itu permulaan dalam bakteria.
00:10:4108 Saya mahu mengalihkan perhatian saya, sekarang,
00:10:4323 kepada permulaan dalam sel eukariotik,
00:10:4604 yang jauh lebih kompleks.
00: 10: 4928 Jadi, ini hanya gambaran keseluruhan peristiwa
00:10:5216 replikasi DNA eukariotik,
00: 10: 5407 dan pertama saya ingin membincangkan gambaran keseluruhan,
00:10:5608 kemudian saya akan menerangkan
00:10:5810 bagaimana acara ini dikawal,
00:11:0003 dan kemudian saya akan membawa anda melalui langkah-langkah terperinci
00:11:0218 acara permulaan ini.
00: 11: 0505 Jadi, langkah pertama dalam proses ini
00:11:0710 tidak berlaku semasa fasa S kitaran sel,
00: 11: 0829 apabila sintesis DNA berlaku,
00:11:1021 tetapi semasa fasa G1 kitaran sel,
00:11:1311 jadi persediaan untuk replikasi berlaku
00:11:1529 sebelum sebarang nukleotida ditambah
00:11:1901 kepada mana-mana untaian DNA.
00: 11: 2127 Semasa proses memuat helikase ini di G1,
00:11:2604 helikas replikatif, kompleks Mcm2-7 ini,
00: 11: 2901 dipasang di sekitar DNA pada setiap asal.
00:11:3300 Sebenarnya, ini menandakan semua potensi asal dalam sel
00:11:3701 dan sering dirujuk sebagai pelesenan asal
00:11:3911 atau kadangkala pembentukan kompleks pra-replikasi.
00:11:4313 Tiga protein tambahan diperlukan untuk mencapai ini.
00: 11: 4725 Selain helicase,
00:11:4910 kompleks pengecaman asal,
00: 11: 5120 Cdc6,
00:11:5305 dan Cdt1,
00:11:5501 dan saya akan mempunyai banyak lagi untuk bercakap tentang mereka dalam beberapa minit.
00:11:5817 Apabila sel pergi dari fasa G1
00:12:0104 ke fasa S kitaran sel,
00: 12: 0224 tindakan dua kinase,
00:12:0503 kinase bergantung kepada siklik fasa S,
00: 12: 0701 dan kinase yang bergantung kepada Dbf4, atau DDK,
00:12:1021 membawa kepada pengumpulan beberapa protein yang berbeza
00:12:1328 ke helikas replika yang dimuatkan,
00:12:1628 kerana apa yang saya tidak beritahu anda ialah itu
00:12:1923 apabila ia mula dimuatkan
00: 12: 2114 ia mengelilingi DNA helai dua
00:12:2311 dan ia benar-benar tidak aktif, okay?
00: 12: 2526 Oleh itu, penting untuk tidak aktif pada ketika itu
00:12:2720 dan anda akan lihat sebabnya.
00:12:2828 Sekarang, protein berkaitan ini
00:12:3029 termasuk dua protein yang saya bincangkan sebelum ini,
00:12:3315 Cdc45 dan GINS,
00: 12: 3527 dan mereka bersatu
00:12:3818 untuk mengaktifkan helicase dan
00: 12: 4104 membentuk helikase replikasi aktif,
00:12:4223 kompleks CMG.
00:12:4404 Sekarang, DNA untai tunggal
00:12:4612 yang terbentuk pada ketika ini
00:12:4802 membenarkan pengambilan seluruh jentera sintetik DNA
00: 12: 5100 dan pemasangan sepasang replis dua arah.
00:12:5504 Sekarang, apa yang penting tentang proses ini
00: 12: 5629 adalah langkah memuat helikase
00:12:5917 dipisahkan daripada langkah pengaktifan helikase.
00:13:0220 Dan ini penting untuk seseorang
00:13:0427 atribut yang sangat penting dalam replikasi DNA eukariotik,
00:13:0727 iaitu genom direplikasi
00: 13: 1009 tepat sekali setiap kitaran sel.
00: 13: 1216 Anda tidak pernah mahu asal usul bermula
00: 13: 1424 lebih daripada sekali setiap kitaran sel.
00: 13: 1622 Jadi, saya ingin membincangkan bagaimana sel memastikannya
00: 13: 1910 dalam beberapa slaid seterusnya.
00:13:2112 Jadi, semasa fasa G1 kitaran sel,
00:13:2313 terdapat tahap rendah enzim
00: 13: 2619 disebut kinase yang bergantung kepada siklin.
00: 13: 2819 Ini adalah enzim utama
00: 13: 3021 yang mendorong perkembangan kitaran sel.
00: 13: 3203 Semasa G1, hanya ada
00: 13: 3420 kinase yang bergantung pada siklin
00: 13: 3607 - tiada kinase bergantung pada siklin fasa S -
00: 13: 3815 dan secara amnya aktiviti mereka jauh lebih rendah.
00: 13: 4107 Dalam keadaan ini,
00:13:4318 anda boleh memasang atau memuatkan helikas replika baharu
00:13:4619 pada asal-usul replikasi,
00: 13: 4800 tetapi anda tidak dapat mengaktifkannya, kerana,
00: 13: 5005 seperti yang saya katakan pada slaid sebelumnya,
00:13:5122 anda memerlukan aktiviti CDK fasa S untuk ini.
00: 13: 5522 Apabila anda beralih ke fasa S kitaran sel,
00:14:0001 CDK fasa S,
00:14:0128 dan sebenarnya CDK secara amnya,
00: 14: 0314 menjadi lebih terwakili,
00:14:0523 aktiviti yang lebih tinggi,
00: 14: 0705 dan mereka mempunyai dua akibat.
00:14:0902 Satu ialah mereka
00: 14: 1217 mencetuskan permulaan heliks yang dimuatkan,
00:14:1518 seperti yang saya nyatakan dalam slaid sebelumnya.
00:14:1729 Akibat penting kedua
00:14:1927 ialah mereka juga menyasarkan
00: 14: 2212 tiga daripada empat protein
00: 14: 2421 terlibat dalam pemuatan helikase
00:14:2624 -- kompleks Mcm2-7, ORC dan Cdc6 --
00: 14: 3113 dan setiap kejadian fosforilasi ini
00: 14: 3327 menghalang pemuatan helikase.
00: 14: 3606 Saya akan menerangkannya secara terperinci sebentar lagi,
00: 14: 3813 tetapi izinkan saya menerangkan logik sistem ini terlebih dahulu.
00: 14: 4121 Oleh itu, anda dapat melihatnya dalam sistem ini
00: 14: 4329 hanya ada satu peluang, semasa G1,
00:14:4525 untuk memuatkan helikase replika setiap kitaran sel,
00: 14: 4817 dan hanya ada satu peluang,
00: 14: 5014 semasa fasa S, biasanya,
00:14:5202 tetapi benar-benar sepanjang tempoh dari S, G2, dan M,
00: 14: 5426 di mana anda sebenarnya boleh mengaktifkan helicase.
00:14:5700 Dalam amalan, ini semua berlaku semasa fasa S
00: 15: 0005 kerana pelbagai alasan yang tidak akan saya teliti,
00: 15: 0227 tetapi maksudnya ialah
00:15:0510 anda pada asasnya hanya boleh memulakan replikasi dari asal
00:15:0800 sekali setiap kitaran sel.
00: 15: 0928 Dan sistem ini berfungsi seperti yang anda ada
00:15:1118 10 asal usul, 1000 asal usul atau 30000 asal usul.
00:15:1505 Ia akan berfungsi dengan baik.
00:15:1704 Dan oleh itu ia sangat mampu untuk menampung
00: 15: 1909 pelbagai saiz genom.
00:15:2110 Sekarang, anda mungkin tertanya-tanya apa yang berlaku
00: 15: 2313 pada peralihan G1-S dan M-G1.
00: 15: 2613 Itu benar-benar tempoh yang berbahaya
00:15:2815 di mana anda ingin menghentikan pemuatan helicase
00: 15: 3100 sebelum anda memulakan pengaktifan helicase.
00: 15: 3226 Sekiranya terdapat peralihan secara beransur-ansur,
00: 15: 3428 anda boleh mempunyai tempoh yang singkat
00:15:3628 di mana kedua-duanya boleh berlaku pada masa yang sama,
00: 15: 3815 dan itu boleh memungkinkan replikasi berlaku.
00:15:4111 Walau bagaimanapun, ternyata kitaran sel
00:15:4316 telah menghasilkan mekanisme,
00: 15: 4525 dan saya tidak akan membahasnya secara terperinci,
00: 15: 4712 yang mematikan pemuatan helikase
00: 15: 4914 sebelum anda menghidupkan pengaktifan helikase
00:15:5200 pada peralihan G1-S,
00:15:5325 dan begitu juga anda mematikan pengaktifan
00:15:5613 sebelum anda menghidupkan pemuatan helicase
00: 15: 5929 pada peralihan M-G1.
00: 16: 0113 Jadi, pada setiap peralihan utama ini,
00: 16: 0310 anda mempunyai tingkap kecil
00: 16: 0526 di mana kedua-duanya tidak boleh berlaku.
00: 16: 0729 Baiklah?
00: 16: 0927 Dan saya harus menekankan bahawa peralihan ini
00: 16: 1122 di M ke G1
00:16:1322 ialah tempat pembahagian sel berlaku,
00: 16: 1510 sehingga sekarang anda dapat memulakan prosesnya lagi,
00:16:1817 kerana anda kini mempunyai dua sel,
00: 16: 2004 yang masing-masing mempunyai pelengkap yang lengkap
00:16:2213 genom di dalamnya
00: 16: 2406 dan bersedia untuk memulakan pusingan baru
00: 16: 2626 pembahagian sel dan oleh itu sintesis DNA.
00:16:3019 Sekarang, bagaimana S CDK
00: 16: 3305 mengawal protein pemuatan helikase?
00: 16: 3501 Kami tahu yang terbaik dalam ragi S. cerevisiae,
00:16:3724 di mana kita tahu bahawa, sebagai contoh,
00:16:4006 cyclin-CDK memfosforilasi protein Mcm,
00:16:4305 yang menyebabkan mereka menjadi
00:16:4517 dieksport keluar dari nukleus.
00: 16: 4700 Sekarang, ini mungkin membingungkan anda
00:16:4826 kerana jelas terdapat banyak protein Mcm
00:16:5128 yang dimuatkan ke dalam DNA
00:16:5315 bahawa anda tidak mahu meninggalkan nukleus,
00:16:5513 dan perkara penting di sini ialah
00: 16: 5703 hanya Mcms yang tidak berkaitan dengan DNA
00: 17: 0011 dieksport.
00:17:0203 Jadi, sebaik sahaja mereka menyelesaikan fungsi mereka,
00:17:0316 mereka dieksport ke sitoplasma,
00: 17: 0423 tetapi jika mereka menunggu asal, dimuatkan,
00:17:0707 untuk diaktifkan,
00:17:0824 mereka tidak dieksport keluar oleh fosforilasi CDK.
00: 17: 1217 Cdc6 juga difosforilasi oleh CDK,
00:17:1604 dan fosforilasi itu
00:17:1800 membawa kepada pengiktirafannya oleh kompleks protein yang dipanggil SCF,
00: 17: 2124 yang merupakan ligase ubiquitin,
00: 17: 2322 yang mensasarkan Cdc6
00:17:2625 dengan pelbagai pengubahsuaian ubiquitin,
00:17:2818 yang seterusnya menyebabkan Cdc6
00: 17: 3127 untuk dikenali oleh proteasome dan terdegradasi.
00:17:3502 Jadi, kecuali dalam G1,
00: 17: 3620 Cdc6 secara konsisten mengalami penurunan nilai
00:17:3810 dan oleh itu tidak boleh berfungsi.
00: 17: 4014 Akhirnya, ORC juga difosforilasi,
00: 17: 4222 dan dalam hal ini kita kurang mengetahui tentang ini,
00: 17: 4425 tetapi itu adalah masalah.
00: 17: 4626 kemungkinan besar peristiwa yang menghalang interaksi
00: 17: 5014 salah satu protein pemuatan helikase yang lain
00: 17: 5206 dengan ORC.
00: 17: 5401 Baiklah.
00: 17: 5522 Jadi, saya telah memberitahu anda mengenai peraturan acara ini,
00: 17: 5719 mari kita bincangkan bagaimana ia sebenarnya berlaku.
00: 18: 0017 Jadi, ini hanyalah gambaran mengenai kejadian pemuatan helikase.
00: 18: 0410 Kami tahu bahawa langkah pertama dalam proses ini
00: 18: 0622 adalah pengiktirafan DNA asal
00: 18: 0820 oleh kompleks pengenalan asal,
00: 18: 1006 atau apa yang saya akan panggil ORC mulai sekarang.
00:18:1225 ORC kemudian merekrut Cdc6
00:18:1522 apabila sel memasuki fasa G1 kitaran sel,
00: 18: 1713 ketika baru disintesis,
00: 18: 1913 dan kemudian kompleks ORC-Cdc6
00: 18: 2205 dapat merekrut kompleks antara heliksase Mcm2-7 dan Cdt1.
00: 18: 2807 Dan ini membentuk kompleks awal ini
00: 18: 3005 dipanggil OCCM,
00: 18: 3129 untuk kompleks ORC, Cdc6, Cdt1, Mcm.
00: 18: 3422 Dan saya ingin menunjukkan bahawa, pada ketika ini,
00: 18: 3825 ini adalah hujung terminal C kompleks Mcm,
00:18:4022 di sini,
00:18:4209 itu berinteraksi dengan ORC.
00: 18: 4401 Cincin masih terbuka pada ketika ini,
00: 18: 4527 tetapi mereka terikat dengan kepingan DNA yang berdekatan,
00:18:4809 menjelaskan cara anda merekrut
00: 18: 5029 Mcm pertama ke DNA.
00:18:5320 Sekarang, langkah seterusnya selepas ini
00:18:5629 memerlukan hidrolisis ATP,
00: 18: 5817 dan melibatkan beberapa langkah
00:19:0015 yang akan saya bincangkan dengan lebih terperinci
00: 19: 0215 dalam bahagian kedua pembentangan saya.
00:19:0416 Tetapi keputusan akhirnya ialah itu
00: 19: 0715 anda berakhir dengan pengganda ganda Mcms pada DNA,
00:19:1002 dengan kemudian berinteraksi
00:19:1222 melalui kawasan N-terminal mereka
00:19:1424 untuk membentuk heksamer berganda head-to-head
00: 19: 1706 protein pada DNA,
00: 19: 1818 dan ini benar-benar penanda permulaan permulaan dua arah,
00:19:2200 kerana mereka kini sudah bersedia
00: 19: 2411 untuk meninggalkan asal pada arah yang bertentangan.
00: 19: 2802 Jadi, ini berlaku semasa G1.
00: 19: 3029 Sekali lagi, heliks tidak aktif pada masa ini,
00: 19: 3310 dan apa yang berlaku seterusnya adalah anda
00: 19: 3527 peralihan ke fasa S
00: 19: 3807 dan anda menjalani pengaktifan helikase.
00:19:3921 Sekarang, ini adalah gambaran keseluruhan proses ini,
00: 19: 4121 dan saya akan membincangkan perkara ini terlebih dahulu
00: 19: 4328 dan kemudian saya akan menerangkan langkah-langkahnya secara terperinci.
00:19:4615 Jadi, acara pertama ialah.
00: 19: 4812 ia memerlukan kinase DDK
00:19:5025 dan ia menghasilkan pengambilan
00: 19: 5300 salah satu daripada dua pengaktif,
00: 19: 5429 protein Cdc45.
00:19:5726 Kemudian, S-CDK boleh bertindak
00:19:5928 dan ini merekrut pengaktif lain,
00: 20: 0219 kompleks GINS,
00:20:0411 serta Pol ε dan beberapa protein lain.
00:20:0717 Pada ketika ini,
00:20:1024 anda mempunyai dua CMG yang telah terbentuk pada templat,
00: 20: 1311 tetapi menariknya mereka belum aktif.
00:20:1605 Ia memerlukan aktiviti protein ketiga,
00: 20: 1816 protein Mcm10,
00: 20: 2026 untuk benar-benar mencetuskan pengambilan DNA
00:20:2228 dan pengaktifan CMG.
00: 20: 2500 Dan ini juga memerlukan pergaulan
00: 20: 2711 protein pengikat helai tunggal eukariotik
00: 20: 3000 RPA.
00:20:3201 Akhirnya, sebaik sahaja DNA untai tunggal terbentuk,
00: 20: 3402 baki polimerase DNA,
00:20:3708 serta protein tambahan lain,
00:20:3908 direkrut untuk membentuk replisome.
00: 20: 4128 Sekarang, ini banyak yang perlu dilihat,
00: 20: 4409 jadi saya mahu membahagikan ini kepada beberapa langkah
00: 20: 4629 supaya anda dapat memahami bagaimana ini berlaku dengan lebih terperinci.
00:20:5008 Jadi, inilah heksamer berganda kami yang dimuatkan,
00:20:5218 dan ia sedia untuk diaktifkan,
00:20:5506 baru sahaja memasuki fasa S.
00: 20: 5723 Jadi, langkah pertama adalah pengiktirafan DDK
00: 21: 0020 wilayah N-terminal
00: 21: 0219 daripada beberapa subunit Mcm.
00: 21: 0513 Ia mengfosforilasi subunit ini
00: 21: 0716 dan itu mewujudkan laman web yang mengikat
00: 21: 0921 untuk protein kedua yang dipanggil Sld3,
00: 21: 1312 yang seterusnya membolehkan pengambilan pekerja
00:21:1510 daripada salah satu daripada dua protein pengaktifan,
00: 21: 1801 Cdc45.
00:21:1918 Sekarang, saya telah menunjukkan ini untuk heksamer yang betul,
00: 21: 2119 tetapi tentunya ini juga mesti berlaku
00:21:2314 untuk heksamer kiri juga.
00: 21: 2606 Baiklah, jadi sekarang kita ada pengaktif pertama,
00: 21: 3012 dan itulah peristiwa yang bergantung kepada DDK, atau kinase yang bergantung kepada Dbf4.
00:21:3311 Langkah seterusnya benar-benar memerlukan
00: 21: 3617 kinase yang bergantung pada siklin fasa S,
00: 21: 3810 dan apa yang dilakukannya
00:21:4114 fosforilat, pertama, Sld3,
00:21:4405 dan kemudian, kedua, ia memfosforilasi.
00:21:4706 tidak semestinya mengikut susunan itu,
00:21:4825 tetapi ia juga memfosforilasi Sld2.
00: 21: 5117 Sekarang, kejadian fosforilasi ini
00:21:5308 menyebabkan pengambilan pelbagai protein tambahan.
00:21:5618 Paling ketara,
00:21:5824 Sld2 diiktiraf oleh protein yang dipanggil Dpb11,
00:22:0116 dan ia melakukan ini menggunakan sepasang motif ulangan BRCT,
00: 22: 0607 yang mengenali,
00: 22: 0800 dengan cara khusus fosforilasi,
00:22:0916 peptida pada Sld2.
00:22:1123 Acara fosforilasi ini
00: 22: 1403 juga menyebabkan pengambilan pekerja
00:22:1618 Pol ε dan protein GINS
00:22:1904 ke dalam kompleks yang lebih besar
00: 22: 2120 yang disebut kompleks pendaratan, atau pra-LC.
00:22:2519 Sekarang, kompleks ini direkrut secara keseluruhan
00:22:2900 kepada yang tidak aktif,
00: 22: 3206 helikase sedia untuk diaktifkan,
00: 22: 3424 menggunakan interaksi protein Dpb11
00:22:3820 dengan fosforilasi yang berbeza.
00:22:4100 peptida terfosforilasi, okay?
00: 22: 4317 Dan ini sekali lagi dimediasi oleh
00:22:4603 sepasang motif BRCT yang berasingan,
00: 22: 4816 yang mengenali,
00:22:5017 dengan cara khusus fosforilasi,
00: 22: 5206 peptida dalam Sld3.
00: 22: 5423 Jadi, pada ketika ini, kami telah merekrut
00: 22: 5706 kedua Cdc45 dan GINS,
00: 22: 5908 dan begitu juga
00: 23: 0129 kompleks CMG hadir,
00: 23: 0319 baik-baik saja, tetapi masih belum aktif.
00: 23: 0503 Dan tentunya kita juga harus melakukan ini
00: 23: 0727 untuk hexamer yang lain.
00: 23: 0908 Baiklah, jadi apa yang akan berlaku seterusnya
00: 23: 1204 benar-benar merupakan titik penyiasatan utama di lapangan,
00: 23: 1604 tetapi ada beberapa perkara yang kita tahu mesti berlaku.
00: 23: 1822 Jadi, salah satunya ialah
00: 23: 2021 beberapa protein meninggalkan replika.
00: 23: 2309 Ini termasuk Sld2, Sld3, dan Dpb11.
00:23:2720 Jadi, kami mempunyai kompleks CMG kami,
00:23:2913 dan ini, sekali lagi, helikase replika aktif,
00: 23: 3204 tetapi belum aktif
00: 23: 3329 kerana agar DNA pertama kali berlaku
00: 23: 3728 protein Mcm10 harus bertindak.
00: 23: 4020 Dan kita tahu bahawa ini sebenarnya
00: 23: 4307 secara langsung merangsang aktiviti helicase,
00: 23: 4512 dan itu boleh
00: 23: 4718 menyebabkan sejumlah perubahan
00: 23: 4921 untuk menyebabkan penolakan awal.
00:23:5211 Tepat susunan perubahan ini,
00:23:5515 dan sama ada acara Mcm10 atau lebih awal boleh merangsangnya,
00: 23: 5803 tidak diketahui.
00: 23: 5912 Kami hanya tahu bahawa anda tidak melihat DNA helai tunggal
00:24:0107 sehingga Mcm10 tiba.
00: 24: 0325 Tetapi struktur ini,
00:24:0528 yang kini telah mendapat RPA
00:24:0814 mengikat kepada kawasan terkandas tunggal,
00: 24: 1001 mempunyai sejumlah perubahan dramatik
00:24:1200 berbanding struktur sebelumnya.
00: 24: 1320 Jadi, tentu saja DNA asal
00:24:1509 terpaksa dicairkan untuk mencipta
00: 24: 1724 DNA helai tunggal.
00:24:1828 Selain itu, helai bukan translokasi
00:24:2215 terpaksa dieksport dari saluran pusat.
00:24:2603 Ingat, Mcms ada di sekeliling
00: 24: 2804 DNA helai dua pada mulanya,
00: 24: 2916 bagaimanapun, selepas peralihan ini
00:24:3122 helikas yang betul
00: 24: 3400 akan mempunyai satu helai di dalamnya,
00: 24: 3618 dan heliks kiri
00: 24: 3820 akan mempunyai helai tunggal yang berbeza di dalamnya.
00: 24: 4010 Jadi, ini bermaksud kompleks Mcm ini
00: 24: 4210 harus dibuka, mengeluarkan satu helai,
00: 24: 4422 dan kemudian tutup lagi di sekitar yang lain.
00:24:4715 Dan, akhirnya, anda akan ingat itu
00: 24: 4922 heliks berada dalam hexamer berkembar kepala-ke-kepala yang ketat ini, pada mulanya,
00: 24: 5304 dan mereka harus berpisah dalam proses ini.
00:24:5504 Jadi, saya telah menyenaraikannya mengikut urutan,
00: 24: 5712 tetapi kami tidak tahu apakah ini sebenarnya pesanannya
00:24:5924 ia berlaku dalam
00: 25: 0116 - itu adalah bidang penyiasatan aktif.
00: 25: 0323 Baiklah.
00:25:0519 Jadi, pada ketika ini kita tahu mempunyai DNA untai tunggal
00: 25: 0722 diperlukan untuk priming,
00:25:0918 dan apa yang berlaku ialah itu
00:25:1125 seluruh jentera sintetik DNA telah diambil.
00:25:1422 Khususnya, Pol α-primase,
00: 25: 1623 direkrut oleh interaksi dari
00:25:1921 Ctf4 dengan kompleks GINS,
00: 25: 2316 dan juga dengan Pol α.
00: 25: 2515 Ini membolehkan sintesis primer RNA pertama
00:25:3007 dan kemudian lanjutan primer tersebut oleh Pol α dalam bentuk DNA.
00: 25: 3327 Primer tersebut kemudian boleh diambil alih,
00: 25: 3612 baik oleh Pol δ atau oleh Pol ε,
00: 25: 3912 bergantung pada sama ada mereka berada di kedudukan teratas
00:25:4116 atau helai yang ketinggalan,
00: 25: 4300 dan anda kini mempunyai replika aktif.
00:25:4523 Jadi, banyak lagi yang perlu difahami
00:25:4902 tentang proses ini
00: 25: 5021 - lebih kurang difahami
00: 25: 5214 apa seni bina kompleks ini -
00: 25: 5407 dan ada banyak penyiasatan yang sedang dilakukan pada masa ini
00:25:5703 untuk memahaminya.
00:25:5808 Sebagai contoh, saya telah menggambarkan Pol δ
00:26:0101 berada di tapak replikasi,
00: 26: 0226 tetapi banyak bukti menunjukkan bahawa ia benar-benar berlaku.
00: 26: 0700 ia berlaku setelah garpu itu berlalu.
00: 26: 0824 Jadi, ia menjalankan tugasnya,
00: 26: 1013 tetapi agak terpisah dari pekerjaan
00: 26: 1216 polimerase selebihnya.
00: 26: 1327 Saya juga akan menunjukkan bahawa saya belum menunjukkan
00: 26: 1603 sama ada slaid loader loader, RF-C,
00:26:1910 atau pengapit gelongsor.
00: 26: 2018 Mereka berdua akan berlakon, tetapi, sekali lagi,
00:26:2211 mereka bukan sebahagian daripada garpu replikasi sebenar.
00: 26: 2420 Jadi, saya harap anda telah belajar
00:26:2725 banyak tentang cara replikasi berfungsi, di sini,
00: 26: 3013 dan jika anda menantikan, saya akan memberitahu anda
00: 26: 3218 lebih terperinci
00:26:3511 tentang cara helikas dimuatkan,
00: 26: 3704 dan apa yang telah kita pelajari dengan menggunakan
00: 26: 3821 biokimia molekul tunggal
00:26:4016 untuk menyiasat proses ini.
00:26:4219 Jadi, saya ingin mengucapkan terima kasih kepada Sera Thornton,
00: 26: 4419 yang melakukan semua animasi di bahagian pembentangan saya.
00: 26: 4714 Ini dilakukan sebagai sebahagian daripada pembangunan
00:26:4928 kursus yang dipanggil 728x,
00: 26: 5124 yang tersedia di
00:26:5416 platform MITx dan edX,
00: 26: 5618 dan tentunya tertumpu pada biologi molekul,
00: 26: 5910 bukan hanya replikasi DNA tetapi semua dogma pusat.
00:27:0229 Saya juga ingin mengucapkan terima kasih kepada sumber pembiayaan saya,
00:27:0502 Institut Perubatan Howard Hughes,
00: 27: 0628 serta Institut Sains Perubatan Am Negara.


DNA Eukariotik Polimerase α

Pol α dan Helicase

Dua motor molekul utama dalam mesin pemanjangan replikasi adalah DNA polimerase dan helikase. Penyelarasan kedua-dua aktiviti ini pada kedua-dua helai terdepan dan ketinggalan adalah penting untuk replikasi serentak kedua helai serta pencegahan pendedahan sehelai helai yang berlebihan kerana melepaskan diri. Selain itu, gandingan helikas dan Pol α pada helai terputus memastikan jarak dan masa yang sesuai untuk de novo sintesis primer Okazaki. Kepentingan hubungan intim antara aktiviti primase dan helicase digambarkan dengan baik dalam bakteriofag dan prokariota. Pada bacteriophage T7 dan p4, primase dan helicase dikodkan dalam satu polipeptida. Dalam Escherichia coli , primase (DnaG) dan helicase (DnaB) berinteraksi untuk membentuk kompleks. Interaksi ini merangsang kedua-dua aktiviti primase dan helikase dan melonggarkan kekhususan jujukan DnaG, membolehkan DnaG memupuk sintesis serpihan Okazaki secara berturut-turut semasa sintesis untaian tertinggal. Helikase DnaB heksamerik membentuk struktur gelang yang mengelilingi untaian tertinggal 5' semasa ia dipindahkan dan dilepaskan, manakala DnaG menggunakan DNA untai tunggal (ssDNA) yang baru terdedah sebagai templat. Hubungan topologi helicase ke DNA meningkatkan prosestiviti helicase dan memudahkan translokasi primase ke lokasi priming.

Dalam eukariota, helikase MCM dianggap sebagai helikase replikasi utama. Seperti DnaB, helikase MCM adalah enzim heksamerik yang membentuk struktur cincin, tetapi tidak seperti DnaB, enam subunit tidak bersifat identik walaupun sangat terpelihara. Helikase MCM dimuat ke DNA dupleks sebagai heksamer ganda, mengelilingi DNA dupleks yang menunjukkan bahawa mekanisme melepas mungkin berbeza dari DnaB. Telah diusulkan bahawa helikase MCM dapat bertindak sebagai translocase DNA dua helai yang mengepam DNA dupleks ke dalam heksamer ganda dengan cara yang serupa dengan antigen T besar SV40 atau enzim migrasi cawangan persimpangan RuvAB Holliday bakteria ( Rajah 1 ). Di bawah senario ini, menyambungkan helikas MCM yang diletakkan di hadapan garpu pada DNA dupleks dengan Pol α yang memulakan pada helai tunggal yang tidak digulung mesti bergantung pada faktor lain. Sesungguhnya, interaksi langsung antara Pol α dan helikase MCM belum diperhatikan. Calon protein penghubung adalah Mcm10 dalam ragi pemula, yang diperlukan untuk permulaan sintesis DNA pada peralihan fasa G1 ke S dan sepanjang proses pemanjangan. Mcm10 berinteraksi dengan kedua-dua helikase Pol α dan MCM dan diperlukan untuk kestabilan Pol α dalam yis tunas dan manusia ( Rajah 1 ). Interaksi antara subunit helikase MCM dan Mcm10 telah disahkan dalam Xenopus, dan interaksi fizikal antara Pol α dan Mcm10 manusia telah ditentukan oleh kristalografi. Dalam Xenopus dan manusia, faktor pembentukan kohesi Ctf4 / And1 juga berinteraksi dengan Pol α. Tambahan pula, interaksi dengan RPA dan Ctf4/And1 merangsang aktiviti primas dan menjadikan enzim lebih proses.


Apa yang didahulukan? DNA atau polimerase DNA? - Biologi

PCR (tindak balas rantai polimerase) ialah teknik di mana kitaran denaturasi, penyepuhlindapan dengan primer, dan lanjutan dengan polimerase DNA, digunakan untuk menguatkan bilangan salinan jujukan DNA sasaran lebih daripada 100 kali dalam beberapa jam. Ahli biologi molekul Amerika Kary Mullis membangunkan teknik PCR pada tahun 1970-an. Atas ciptaannya yang cerdik, beliau telah dianugerahkan Hadiah Nobel 1993 dalam fisiologi atau ubat.

Penguatan DNA PCR adalah seperti mana-mana replikasi DNA oleh DNA polimerase dalam vivo. (dalam sel hidup) Perbezaannya ialah PCR menghasilkan DNA dalam tabung uji. Untuk tindak balas PCR diteruskan, empat komponen diperlukan: templat, primer, deoksiribonekleotida (adenine, timin, sitosin, guanin) dan polimerase DNA. Di samping itu, sebahagian daripada urutan DNA yang disasarkan perlu diketahui untuk mereka bentuk primer mengikut. Pada langkah pertama, DNA untai berkembar yang disasarkan dipanaskan hingga lebih dari 194 & degF (90 & degC) untuk denaturasi. Semasa proses ini, dua helai DNA yang disasarkan dipisahkan antara satu sama lain. Setiap helai mampu menjadi templat. Langkah kedua dilakukan sekitar 122 & deg (50 & degC). Pada ini diturunkan suhu, kedua-dua primer itu menyepuh jujukan pelengkapnya pada setiap templat. Polimerase DNA kemudian memanjangkan primer menggunakan nukleotida yang disediakan. Akibatnya, pada akhir setiap kitaran, bilangan molekul DNA berganda.

PCR pada mulanya dilakukan secara manual dalam inkubator dengan suhu yang berbeza untuk setiap langkah sehingga pengekstrakan DNA polimerase dari termofilik bakteria. Bakteria itu Thermus aquaticus ditemui di Taman Negara Batu Kuning. Bakteria ini hidup di mata air panas pada suhu 203 & degF (95 & degC). Polimerase DNA daripada T. akuatik mengekalkan aktivitinya di atas 95 & degC selama berjam-jam. Beberapa polimerase DNA tahan haba tambahan juga kini telah dikenal pasti.

Kejuruteraan genetik haba polimerase DNA tahan, yang mempunyai fungsi membaca semula dan membuat sedikit mutasi pada produk DNA yang diperkuat, tersedia secara komersial. Tindak balas PCR kini dilakukan dalam termosikular yang berbeza. Thermocyclers dirancang untuk mengubah suhu secara automatik. Penyelidik menetapkan suhu dan masa, dan pada akhir prosedur mengeluarkan tiub uji dari mesin.

Penemuan PCR adalah revolusi untuk Biologi molekul. PCR sangat berharga bagi penyelidik kerana ia membolehkan mereka memperbanyak kuantiti urutan DNA yang unik kepada & mdash yang besar sehingga dapat dilaksanakan & jumlahnya dalam masa yang sangat singkat. Penyelidik dalam Projek Genom Manusia gunakan PCR untuk mencari penanda dalam segmen DNA klon dan untuk memesan serpihan DNA dalam perpustakaan. Ahli biologi molekul menggunakan PCR untuk mengklon DNA. PCR juga digunakan untuk menghasilkan biotin atau probe berlabel kimia lain. Probe ini digunakan dalam asid nukleik hibridisasi, in situ hibridisasi dan molekul lain biologi prosedur.

PCR, ditambah dengan pendarfluor teknik dan teknologi komputer, membolehkan penguatan DNA masa nyata. Ini membolehkan pengesanan kuantitatif molekul DNA yang terdapat dalam jumlah minit. PCR juga digunakan secara meluas dalam ujian klinikal. Hari ini, rutin untuk menggunakan PCR dalam diagnosis penyakit berjangkit seperti bantuan dan dalam beberapa ujian forensik.


Bes Sitosin Tidak Semulajadi Diiktiraf sebagai Timina oleh Polimerase DNA oleh Pembentukan Geometri Watson-Crick

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pengarang-pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Institut Kimia Teori dan Pengiraan, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pengarang-pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Institut Kimia Teori dan Komputasi, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pengarang-pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Institut Kimia Teori dan Pengiraan, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsian, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsian, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Institut Kimia Teori dan Komputasi, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsian, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pengarang-pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Institut Kimia Teori dan Pengiraan, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pengarang-pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Institut Kimia Teori dan Komputasi, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pengarang-pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Institut Kimia Teori dan Pengiraan, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsian, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsian, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Institut Kimia Teori dan Pengiraan, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Inovasi Perintis Bioperubatan, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Pusat Pengajian Sains Hayat, Jabatan Biologi Kimia dan Pusat Biomolekul Sintetik dan Fungsional, Kolej Kimia dan Kejuruteraan Molekul dan Pusat Sains Hayat Peking-Tsinghua, Universiti Peking, Beijing, 100871 China

Abstrak

Kemunculan pangkalan DNA yang tidak wajar memberi peluang untuk mengungkap mekanisme di mana DNA polimerase dengan tepat menguraikan maklumat kimia pada templat. Sebelum ini ditunjukkan bahawa dua asas sitosin tidak wajar (disebut "M-fC" dan "I-fC"), yang merupakan penambah pelabelan kimia dari asas epigenetik 5-formilcytosine, dapat mendorong peralihan C-ke-T semasa penguatan DNA. Walau bagaimanapun, bagaimana DNA polimerase mengenali asas sitosin yang tidak wajar tetap misteri. Di sini, struktur kristal asas sitosin tidak wajar berpasangan dengan dA / dG dalam sistem kompleks polimerase-host-tamu KlenTaq dan pasangan ke dATP di laman aktif polimerase KlenTaq telah ditentukan. Kedua-dua pasangan asas M-fC dan I-fC dengan dA/dATP, tetapi tidak dengan dG, dalam geometri Watson-Crick. Kajian ini mendedahkan bahawa pembentukan geometri Watson – Crick, yang mungkin diaktifkan oleh peraturan-A, penting untuk pengiktirafan sitosin yang tidak wajar.

Sebagai perkhidmatan kepada pengarang dan pembaca kami, jurnal ini memberikan maklumat sokongan yang diberikan oleh pengarang. Bahan-bahan tersebut dikaji semula oleh rakan sebaya dan mungkin disusun semula untuk penghantaran dalam talian, tetapi tidak disunting atau diatur. Masalah sokongan teknikal yang timbul daripada maklumat sokongan (selain fail yang hilang) harus diajukan kepada penulis.

Nama fail Penerangan
anie201807845-sup-0001-misc_information.pdf1.4 MB Tambahan

Harap maklum: Penerbit tidak bertanggungjawab atas kandungan atau fungsi maklumat sokongan yang diberikan oleh pengarang. Sebarang pertanyaan (selain kandungan yang tiada) hendaklah ditujukan kepada pengarang yang sepadan untuk artikel tersebut.


Polimerase DNA

I. Ciri-ciri keseluruhan.

Taq DNA Pol I terdiri daripada 832 asid amino (Mr 94,000) (1). Residu N- dan C-terminal diprediksi akan Bertemu dan Glu, masing-masing. Enzim tidak mengandungi Cys.

Taq DNA Pol menunjukkan ology50% homologi urutan dengan E. coli DNA Pol I dalam C-terminal ∼400 residu yang membentuk domain polimerase. Taq Pol mempunyai aktiviti 5--nuclease bebas dalam domain terminal-N (residu 1-290) tetapi tidak mempunyai aktiviti 3 ′ → 5′-exonuclease.

Struktur kristal dari Taq Pol (69) dan Klentaql (75) mengungkapkan bahawa domain polimerase C-terminal sama dengan lipatan dengan Klenow Pol. Mengenai domain 3′ → 5′-exonuclease (sisa 324–515) Klenow Pol, Taq Pol amat berbeza dengan pemadaman empat gelung dengan panjang 8 hingga 27 sisa. Keempat-empat residu berasid (D424, D501, D355, E357) yang diketahui penting untuk pengikatan logam divalen dan pemangkinan eksonukleolitik di Klenow Pol digantikan oleh residu yang tidak mampu mengikat ion logam (L356, R405, G308, V310) dalam rompi 3 ′ → 5′-exonuclease domain dari Taq Pol.

Domain N-terminal 5′-nuklease bagi Taq Pol mempunyai celah yang dalam yang mengandungi sekumpulan residu berasid yang sangat terpelihara dalam domain 5′-nuclease dari keluarga Pol I. Tujuh kumpulan karboksilat dianggap membentuk tiga tapak pengikat logam divalen (segitiga ∼5 Å × −10 Å × ∼10 Å). Dua residu (R25 dan R74) penting untuk aktiviti 5′-nuclease.

Di antara perbezaan lain yang ketara dari Klenow Pol, Klentaql mempunyai 19 penggantian caj bertentangan, menunjukkan pengagihan semula caj global yang mungkin berperanan dalam termostabiliti.


Perbezaan antara DNA polimerase 1 dan 3

DNA polimerase 1 vs 3

DNA polimerase adalah enzim yang direka khas yang membantu pembentukan molekul DNA dengan mengumpulkan blok bangunan kecil DNA yang disebut sebagai nukleotida. DNA polimerase membantu dalam membelah molekul DNA menjadi dua DNA yang serupa. Proses pemisahan DNA ini dipanggil sebagai replikasi DNA. DNA polimerase bertindak sebagai pemangkin dalam replikasi DNA dan oleh itu sangat penting. DNA polimerase membantu dalam membaca helai DNA sedia ada untuk mencipta dua helai baharu yang sepadan dengan DNA sedia ada asal. Dengan cara ini, maklumat genetik diteruskan ke sel anak dan dihantar dari satu generasi ke generasi yang lain.

Perbezaan Struktur

Terdapat banyak jenis polimerase DNA berdasarkan fungsi berbeza yang perlu mereka lakukan. DNA polimerase 1 adalah penting untuk replikasi DNA dan ia juga dipanggil sebagai Pol 1. Ia ditemui oleh Arthur Kornberg. DNA polimerase 3 sangat penting untuk replikasi DNA pro-kariotik dan ditemui oleh Thomas Kornberg dan Malcolm Gefter. DNA polimerase 3 juga disebut sebagai holoenzim dan ia adalah komponen yang paling penting bagi replisom.

Perbezaan dalam fungsi

Fungsi DNA polimerase 1 membantu dalam replikasi DNA. Ia digunakan untuk penyelidikan biologi molekul. Semasa proses replikasi, primer RNA diisi dalam untaian tertinggal DNA. DNA polimerase 1 mengeluarkan primer RNA dan mengisi nukleotida yang diperlukan untuk pembentukan DNA dalam arah- 5’ hingga 3’. Ini juga membantu dalam pembacaan bukti untuk melihat apakah ada kesilapan yang dilakukan semasa replikasi dan semasa memadankan pasangan asas. Fakta yang mesti diingat adalah bahawa polimerase 1 DNA ini hanya menambahkan nukleotida tetapi tidak bergabung dengannya. Pencantuman DNA dilakukan oleh enzim lain yang dipanggil ligase yang membentuk untaian DNA yang berterusan. Fungsi utama DNA polimerase 1 adalah pelabelan DNA dengan terjemahan nick dan sintesis helai kedua cDNA. DNA polimerase 1 juga memangkinkan sintesis 5’ hingga 3’ DNA. DNA polimerase 1 membaca bentuk dan kekutuban dNTP yang masuk. DNA polimerase 1 mempunyai 3 aktiviti seperti polimerase, exonuclease 3 hingga 5 dan exonuclease 5 hingga 3 ’. DNA polimerase 1 ialah polimerase DNA yang bergantung kepada templat.

Pusat pemangkin Pol 3 mempunyai subunit terikat rapat yang dipanggil alpha, epsilon dan theta. Subunit alfa bertanggungjawab untuk aktiviti polimerase DNA, subunit epsilon mempunyai aktiviti pembacaan bukti eksonuklease dan subunit theta adalah yang terkecil dan membantu dalam meningkatkan sifat membaca bukti epsilon. Replisome terletak di garpu replikasi. DNA polimerase 3 adalah komponen dari replisom dan dengan itu membantu dalam replikasi.

DNA polimerase 3 sangat mustahak untuk mereplikasi helai terdepan dan ketinggalan sedangkan DNA polimerase 1 sangat penting untuk mengeluarkan primer RNA dari serpihan dan menggantinya dengan nukleotida yang diperlukan. Enzim ini tidak dapat menggantikan satu sama lain kerana kedua-duanya mempunyai fungsi yang berbeza untuk dilakukan. Polimerase DNA membantu dalam memindahkan maklumat genetik dan sifat dari satu generasi ke generasi yang lain melalui proses replikasi DNA.


Tonton video: Why does the universe exist? Jim Holt (Disember 2022).