Maklumat

Apa yang menghadkan panjang kromosom?

Apa yang menghadkan panjang kromosom?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Apakah had atas dan bawah untuk panjang kromosom? Adakah had ini berbeza dalam pelbagai spesies atau kerajaan? Jika terdapat sebarang had, faktor selular atau molekul manakah yang menjadi sebab?


Terdapat kedua-dua had atas dan bawah yang khusus spesies. Had atas disebabkan oleh pemisahan kromatid saudari yang tidak lengkap dan pemangkasan lengan panjang berikutnya. Sebab untuk had yang lebih rendah adalah, sejauh yang saya tahu, tidak diketahui.


Had Atas

Schubert I, Oud JL. 1997. Terdapat Had Atas Ukuran Kromosom untuk Perkembangan Normal Organisma. Sel 88: 515-520.

Hudakova S, Künzel G, Endo TR, Schubert I. 2002. Lengan kromosom barli lebih panjang daripada separuh paksi gelendong mengganggu pembahagian nuklear. Cytogenet Genome Res 98: 101-107.

Rens W, Torosantucci L, Degrassi F, Ferguson-Smith MA. 2006. Pemisahan kromatid kakak yang tidak lengkap bagi lengan kromosom yang panjang. Kromosoma 115 (6): 481-490.

Dalam makalah ini mereka mendapati bahawa pada tumbuhan mono dan dikotik dan satu haiwan, panjang lengan kromosom dibatasi hingga separuh daripada panjang purata paksi lengan gelendong (panjang antara sentromer). Oleh kerana mekanisme dan keberadaannya di kedua-dua tumbuhan dan haiwan, mungkin masuk akal untuk mengharapkan domain kehidupan lain mengalami batasan serupa. Schubert dan Oud (1997) membuat spekulasi bahawa panjang paksi gelendong adalah spesies tetap secara khusus.

Ini adalah gambar mikroskop confocal yang membahagi Vicia faba sel (kacang) (Schubert dan Oud, 1997). (a) Sel jenis liar pada anafasa. (b-d) Apabila lengan kromosom lebih panjang, kromatid tidak dapat dipisahkan sepenuhnya di anafase. (e) Sel jenis liar pada telofasa. (f, g) Kromatid yang lebih panjang tidak dapat dipisahkan dengan cukup dan jambatan terbentuk antara kedua-dua inti anak perempuan. (h-j) Jambatan itu rosak apabila plat sel terbentuk. (k) Sel jenis liar pada interphase. (l) Pecahan jambatan antara sel dengan kromosom yang dipanjangkan menghasilkan nukleus dan mikronukleus yang tidak teratur - mikronukleus ini mewakili kehilangan DNA dari genom dan akhirnya hilang secara langsung melalui pembelahan sel yang lebih jauh.


Had Bawah

Terdapat had yang lebih rendah, tetapi nampaknya tiada sesiapa yang tahu sebabnya, yang menjadikannya mustahil untuk menentukan dengan tepat.

Schubert dan Oud (1997): Data dari berbagai kerajaan eukariotik menunjukkan adanya had ukuran kromosom yang lebih rendah untuk pemisahan mitosis dan meiotik yang stabil. Kromosom tiruan ragi tidak menunjukkan kestabilan meiotik normal sehingga ukurannya antara 120 hingga 500 kb yang hampir dengan urutan ukuran kromosom ragi asli, selain urutan telomere dan sentromer berfungsi (Niwa et al., 1989). Untuk minichromosom Drosophila, sebuah pulau DNA kompleks 220 kb terbukti diperlukan untuk fungsi sentromer yang betul (Murphy dan Karpen, 1995). Walau bagaimanapun, untuk pengasingan mitosis dan meiotik yang stabil, tambahan 200 kb jujukan satelit mengapit diperlukan. Untuk gangguan minima kromosom achiasmate semasa meiosis pada Drosophila wanita, 1000 kb urutan heterokromatin sentrik bertindih diperlukan (Karpen et al., 1996). Schriever-Schwemmer dan Adler (1993) telah menunjukkan bahawa minikromosom yang mewakili produk sentris kecil dari translokasi antara kromosom 7 dan 15 tetikus dan terdiri daripada sekitar 1% genom haploid hilang semasa meiosis pada organisma pembawa wanita sementara yang sesuai hasil daripada translokasi yang melibatkan kromosom 4 dan 8 tidak. Yang terakhir agak besar. Sama ada tingkah laku yang berbeza ini disebabkan oleh adanya maklumat genetik penting pada produk translokasi kecil 4⁸, atau minikromosom 7¹⁵ terlalu kecil untuk pemisahan yang stabil, walaupun mengandung sentromer lengkap dan telomer. Akhirnya, kami telah memerhatikan bahawa kekerapan pengasingan meiotik, tetapi bukan penghantaran kepada generasi seterusnya, adalah berkorelasi songsang dengan saiz kromosom translokasi dalam Vicia faba (Schubert et al., 1986). Oleh itu, kewujudan julat panjang yang tepat untuk kromosom eukariotik adalah jelas.

Sebab-sebab fizikal untuk had bawah yang masih memungkinkan pemisahan mitosis dan meitotik yang stabil kurang jelas pada masa ini daripada kekangan untuk had atas panjang kromosom

Sudah tentu, "hadir" dalam kertas itu merujuk kepada penghujung 90-an tetapi, dalam carian ringkas yang diakui, saya tidak dapat mencari terlalu banyak yang menghalang keputusan yang lebih terkini. Makalah berikut nampaknya agak menjanjikan, tetapi saya tidak dapat mengaksesnya dan hanya dapat memetik dari abstrak. Ia juga tidak lebih baru.

Schubert I. 2001. Perubahan bilangan kromosom mengikut generasi minichromosomes - adakah had ukuran kromosom yang lebih rendah untuk pemisahan stabil? Gen Gen Sel Cytogenet 93: 175-181.

[A] had ukuran yang lebih rendah untuk transmisi kromosom yang stabil… mungkin berdasarkan, misalnya, pada sokongan sentromer lateral yang tidak mencukupi atau pada kestabilan bivalen yang tidak mencukupi karena ketidakmampuan pembentukan chiasma.


13.1 Teori Kromosom dan Hubungan Genetik

Lama sebelum kromosom divisualisasikan di bawah mikroskop, bapa genetik moden, Gregor Mendel, mula mengkaji keturunan pada tahun 1843. Dengan peningkatan teknik mikroskopik pada akhir 1800-an, ahli biologi sel boleh mengotorkan dan menggambarkan struktur subselular dengan pewarna dan memerhatikan tindakan mereka semasa pembahagian sel dan meiosis. Dengan setiap pembelahan mitotik, kromosom ditiru, dikondensasi dari jisim nuklear amorf (tanpa bentuk tetap) menjadi badan berbentuk X yang berbeza (sepasang kromatid saudara yang sama), dan bermigrasi untuk memisahkan kutub selular.

Teori Pewarisan Kromosom

Spekulasi bahawa kromosom mungkin menjadi kunci untuk memahami keturunan menyebabkan beberapa saintis meneliti penerbitan Mendel dan menilai semula modelnya dari segi tingkah laku kromosom semasa mitosis dan meiosis. Pada tahun 1902, Theodor Boveri memerhatikan bahawa perkembangan embrio landak yang betul tidak akan berlaku kecuali jika terdapat kromosom. Pada tahun yang sama, Walter Sutton memerhatikan pemisahan kromosom ke dalam sel anak semasa meiosis (Rajah 13.2). Bersama-sama, pemerhatian ini membawa kepada pengembangan Teori Warisan Kromosom, yang mengenal pasti kromosom sebagai bahan genetik yang bertanggungjawab untuk pewarisan Mendel.

Teori Pewarisan Kromosomal selaras dengan undang-undang Mendel dan disokong oleh pemerhatian berikut:

  • Semasa meiosis, pasangan kromosom homolog berpindah sebagai struktur diskrit yang tidak bergantung kepada pasangan kromosom yang lain.
  • Pengisihan kromosom dari setiap pasangan homolog ke pra-gamet nampaknya secara rawak.
  • Setiap ibu bapa mensintesis gamet yang hanya mengandungi separuh pelengkap kromosom mereka.
  • Walaupun gamet lelaki dan wanita (sperma dan telur) berbeza dalam ukuran dan morfologi, mereka mempunyai bilangan kromosom yang sama, menunjukkan sumbangan genetik yang sama dari setiap ibu bapa.
  • Kromosom gametik bergabung semasa persenyawaan untuk menghasilkan anak dengan nombor kromosom yang sama seperti ibu bapa mereka.

Walaupun terdapat korelasi yang menarik antara tingkah laku kromosom semasa meiosis dan undang-undang abstrak Mendel, Teori Pewarisan Kromosom telah dicadangkan lama sebelum terdapat sebarang bukti langsung bahawa ciri-ciri dibawa pada kromosom. Pengkritik menegaskan bahawa individu mempunyai sifat mengasingkan jauh lebih bebas daripada mereka mempunyai kromosom. Ia hanya selepas beberapa tahun menjalankan salib dengan lalat buah, Drosophila melanogaster, bahawa Thomas Hunt Morgan memberikan bukti eksperimen untuk menyokong Teori Warisan Kromosom.

Hubungan Genetik dan Jarak

Kerja Mendel mencadangkan bahawa sifat diwarisi secara bebas antara satu sama lain. Morgan mengenal pasti korespondensi 1: 1 antara sifat pemisah dan kromosom X, menunjukkan bahawa pemisahan kromosom secara rawak adalah asas fizikal model Mendel. Ini juga menunjukkan bahawa gen yang dikaitkan mengganggu hasil ramalan Mendel. Hakikat bahawa setiap kromosom boleh membawa banyak gen yang berkaitan menerangkan bagaimana individu boleh mempunyai lebih banyak sifat daripada mereka mempunyai kromosom. Walau bagaimanapun, pemerhatian oleh penyelidik di makmal Morgan menunjukkan bahawa alel yang diletakkan pada kromosom yang sama tidak selalu diwarisi bersama. Semasa meiosis, gen yang dipaut entah bagaimana menjadi tidak terikat.

Penggabungan Semula Homolog

Pada tahun 1909, Frans Janssen mengamati chiasmata — titik di mana kromatid bersentuhan antara satu sama lain dan mungkin bertukar segmen — sebelum pembahagian pertama meiosis. Dia mencadangkan agar alel menjadi tidak berpaut dan kromosom bertukar secara fizikal segmen. Ketika kromosom kental dan dipasangkan dengan homolognya, kromosom kelihatan berinteraksi pada titik yang berbeza. Janssen mencadangkan bahawa titik-titik ini sesuai dengan wilayah di mana segmen kromosom ditukar. Sekarang diketahui bahawa pasangan dan interaksi antara kromosom homolog, yang dikenali sebagai sinapsis, lebih daripada sekadar mengatur homolog untuk penghijrahan untuk memisahkan sel anak. Ketika disinaps, kromosom homolog mengalami pertukaran fizikal timbal balik di tangan mereka dalam proses yang disebut penggabungan homolog, atau lebih sederhana, "menyeberang."

Untuk lebih memahami jenis hasil eksperimen yang diperoleh penyelidik pada masa ini, pertimbangkan individu yang heterozigot yang mewarisi alel ibu dominan untuk dua gen pada kromosom yang sama (seperti AB) dan dua alel bapa resesif untuk gen yang sama (seperti ab). Sekiranya gen dihubungkan, seseorang akan mengharapkan individu ini menghasilkan gamet yang ada AB atau ab dengan nisbah 1: 1. Jika gen tidak dipautkan, individu itu harus menghasilkan AB, Ab, aB, dan ab gamet dengan frekuensi yang sama, mengikut konsep Mendelian tentang pelbagai bebas. Oleh kerana ia sesuai dengan kombinasi alel baru, genotip Ab dan aB adalah jenis bukan ibu bapa yang disebabkan oleh penggabungan homolog semasa meiosis. Jenis ibu bapa adalah keturunan yang menunjukkan gabungan alelik yang sama dengan ibu bapa mereka. Walau bagaimanapun, Morgan dan rakan-rakannya mendapati bahawa apabila individu yang heterozigot tersebut diuji kepada ibu bapa resesif homozigot (AaBb × aabb), kedua-dua kes ibu bapa dan bukan ibu bapa berlaku. Sebagai contoh, 950 keturunan mungkin dipulihkan sama ada AaBb atau aabb, tetapi 50 keturunan juga akan diperoleh baik Aabb atau aaBb. Hasil ini menunjukkan bahawa hubungan berlaku paling kerap, tetapi sebilangan besar keturunan adalah hasil pengumpulan semula.

Sambungan Visual

Dalam ujian silang untuk dua ciri seperti yang ditunjukkan di sini, bolehkah kekerapan ramalan anak rekombinan ialah 60 peratus? Mengapa atau mengapa tidak?

Peta Genetik

Janssen tidak mempunyai teknologi untuk menunjukkan persilangan jadi ia kekal sebagai idea abstrak yang tidak diterima secara meluas. Para saintis berpendapat chiasmata adalah variasi pada sinapsis dan tidak dapat memahami bagaimana kromosom dapat pecah dan bergabung semula. Namun, data adalah jelas bahawa kaitan tidak selalu berlaku. Pada akhirnya, diperlukan seorang pelajar sarjana muda dan "semua orang" untuk secara matematik menjelaskan masalah hubungan dan penggabungan semula.

Pada tahun 1913, Alfred Sturtevant, seorang pelajar di makmal Morgan, mengumpulkan hasil dari penyelidik di makmal, dan membawa mereka pulang satu malam untuk memikirkannya. Menjelang keesokan paginya, dia telah mencipta "peta kromosom" pertama, perwakilan linear susunan gen dan jarak relatif pada kromosom (Rajah 13.4).

Sambungan Visual

Pernyataan berikut, yang manakah benar?

  1. Penggabungan semula warna badan dan alel mata merah / cinnabar akan berlaku lebih kerap daripada penggabungan alel untuk panjang sayap dan panjang aristae.
  2. Penggabungan semula warna badan dan alel panjang aristae akan berlaku lebih kerap daripada penggabungan alel mata merah / coklat dan alel panjang aristae.
  3. Penggabungan semula warna badan kelabu/hitam dan alel aristae panjang/pendek tidak akan berlaku.
  4. Penggabungan semula alel mata merah/coklat dan panjang/pendek aristae akan berlaku lebih kerap daripada penggabungan semula alel untuk panjang sayap dan warna badan.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 13.4, dengan menggunakan kekerapan penggabungan semula untuk meramalkan jarak genetik, susunan relatif gen pada kromosom 2 boleh disimpulkan. Nilai yang ditunjukkan mewakili jarak peta dalam centiorgans (cM), yang sepadan dengan frekuensi penggabungan semula (dalam peratus). Oleh itu, gen untuk warna badan dan ukuran sayap adalah 65.5 - 48.5 = 17 cM, menunjukkan bahawa alel ibu dan bapa untuk gen ini bergabung semula pada 17 peratus keturunan, secara purata.

Untuk membina peta kromosom, Sturtevant menganggap bahawa gen disusun secara bersiri pada kromosom seperti utas. Dia juga menganggap bahawa kejadian penggabungan semula antara dua kromosom homolog dapat terjadi dengan kemungkinan yang sama di mana saja sepanjang kromosom tersebut. Beroperasi berdasarkan anggapan ini, Sturtevant mendalilkan bahawa alel yang berjauhan pada kromosom lebih cenderung berpisah semasa meiosis hanya kerana terdapat wilayah yang lebih besar di mana penggabungan boleh berlaku. Sebaliknya, alel yang berdekatan antara satu sama lain pada kromosom cenderung diwarisi bersama. Purata bilangan persilangan antara dua alel - iaitu frekuensi pengumpulan semula - berkorelasi dengan jarak genetik antara satu sama lain, berbanding dengan lokasi gen lain pada kromosom itu. Mengambil kira contoh silang antara AaBb dan aabb di atas, kekerapan penggabungan semula boleh dikira sebagai 50/1000 = 0.05. Iaitu, kemungkinan terjadinya persilangan antara gen A/a dan B / b ialah 0.05, atau 5 peratus. Hasil seperti itu akan menunjukkan bahawa gen tersebut dihubungkan secara pasti, tetapi gen itu cukup jauh agar crossover sesekali terjadi. Sturtevant membahagikan peta genetiknya menjadi unit peta, atau centimorgans (cM), di mana frekuensi penggabungan 0,01 sepadan dengan 1 cM.

Dengan mewakili alel dalam peta linier, Sturtevant mencadangkan bahawa gen boleh berkisar dari dihubungkan dengan sempurna (frekuensi pengumpulan semula = 0) hingga tidak terikat dengan sempurna (frekuensi pengumpulan semula = 0,5) ketika gen berada pada kromosom yang berbeza atau gen dipisahkan sangat jauh pada yang sama kromosom. Gen yang tidak dipautkan dengan sempurna sepadan dengan frekuensi yang diramalkan oleh Mendel untuk bercampur secara bebas dalam persilangan dihibrid. Frekuensi penggabungan 0,5 menunjukkan bahawa 50 peratus keturunan adalah rekombinan dan 50 peratus yang lain adalah jenis ibu bapa. Iaitu, setiap jenis gabungan alel diwakili dengan kekerapan yang sama. Perwakilan ini membolehkan Sturtevant mengira jarak antara beberapa gen pada kromosom yang sama. Namun, ketika jarak genetik mendekati 0,50, ramalannya menjadi kurang tepat kerana tidak jelas apakah gen itu terpisah jauh pada kromosom yang sama atau pada kromosom yang berbeza.

Pada tahun 1931, Barbara McClintock dan Harriet Creighton menunjukkan penyebaran kromosom homolog pada tanaman jagung. Beberapa minggu kemudian, penggabungan semula homolog masuk Drosophila ditunjukkan secara mikroskopik oleh Curt Stern. Stern memerhatikan beberapa fenotip yang berkaitan dengan X yang dikaitkan dengan pasangan kromosom X yang tidak biasa dan tidak serupa secara struktural di mana satu X kehilangan segmen terminal kecil, dan X yang lain menyatu dengan sekeping kromosom Y. Dengan menyeberangi lalat, memerhatikan keturunan mereka, dan kemudian memvisualisasikan kromosom anak, Stern menunjukkan bahawa setiap kali gabungan alel anak menyimpang daripada salah satu kombinasi ibu bapa, terdapat pertukaran sepadan segmen kromosom X. Menggunakan lalat mutan dengan kromosom X yang berbeza dari segi struktur adalah kunci untuk memerhati produk penggabungan semula kerana penjujukan DNA dan alat molekul lain belum tersedia. Sekarang diketahui bahawa kromosom homolog bertukar-tukar segmen di meiosis secara berkala dengan memecah dan bergabung semula DNA mereka di lokasi yang tepat.

Pautan ke Pembelajaran

Kaji proses Sturtevant untuk membuat peta genetik berdasarkan frekuensi pengumpulan semula di sini.

Ciri Pemetaan Mendel

Penggabungan semula homolog adalah proses genetik biasa, namun Mendel tidak pernah memerhatikannya. Sekiranya dia menyiasat kedua-dua gen yang berkaitan dan yang tidak berkaitan, akan lebih sukar baginya untuk membuat model data yang disatukan berdasarkan perhitungan probabilistik. Penyelidik yang sejak itu telah memetakan tujuh sifat yang disiasat oleh Mendel pada tujuh kromosom genom tumbuhan kacang telah mengesahkan bahawa semua gen yang dia periksa adalah sama ada pada kromosom yang berasingan atau cukup berjauhan untuk tidak dipautkan secara statistik. Ada yang mencadangkan bahawa Mendel sangat bertuah kerana hanya memilih gen yang tidak dipautkan, manakala yang lain mempersoalkan sama ada Mendel membuang sebarang data yang mencadangkan kaitan. Walau apa pun, Mendel secara konsisten memerhatikan pelbagai bebas kerana dia memeriksa gen yang tidak dipautkan dengan berkesan.

Sebagai Amazon Associate, kami memperoleh hasil daripada pembelian yang layak.

Ingin memetik, berkongsi, atau mengubahsuai buku ini? Buku ini ialah Creative Commons Attribution License 4.0 dan anda mesti mengaitkan OpenStax.

    Sekiranya anda mengedarkan semula seluruh atau sebahagian buku ini dalam format cetakan, maka anda mesti memasukkan pada setiap halaman fizikal atribusi berikut:

  • Gunakan maklumat di bawah untuk menjana petikan. Kami mengesyorkan menggunakan alat petikan seperti ini.
    • Pengarang: Connie Rye, Robert Wise, Vladimir Jurukovski, Jean DeSaix, Jung Choi, Yael Avissar
    • Penerbit/tapak web: OpenStax
    • Tajuk buku: Biologi
    • Tarikh penerbitan: 21 Okt 2016
    • Lokasi: Houston, Texas
    • URL Buku: https://openstax.org/books/biology/pages/1-introduction
    • URL bahagian: https://openstax.org/books/biology/pages/13-1-chromosomal-theory-and-genetic-linkage

    © 15 Sep 2020 OpenStax. Kandungan buku teks yang dihasilkan oleh OpenStax dilesenkan di bawah lesen Creative Commons Attribution License 4.0. Nama OpenStax, logo OpenStax, kulit buku OpenStax, nama OpenStax CNX dan logo OpenStax CNX tidak tertakluk kepada lesen Creative Commons dan tidak boleh diterbitkan semula tanpa kebenaran bertulis terlebih dahulu dan nyata daripada Rice University.


    Bagaimana Pembahagian Sel Menyebabkan Telomer Dipendekkan

    Akibat Banyak Pembahagian Sel dan Telomer yang Dipendekkan

    Telomer “dipangkas” daripada kromosom untuk setiap pembahagian sel sel somatik.Akhirnya, telomer dipangkas sehingga genom kromosom menjadi rentan.

    Apabila kromosom ditiru oleh enzim tertentu, enzim ini tidak menggandakan hingga akhir kromosom. Hasilnya ialah hujung kromosom dipendekkan. Oleh itu, apabila sel anda terus mereplikasi untuk menggantikan yang mati & lama, telomer kromosom anda menjadi lebih kecil dan lebih kecil, dan menjadi lebih terdedah kepada kecacatan, gabungan dan mutasi genetik. Setiap kali sel membahagi, sebanyak 25 hingga 200 pasangan asas mungkin hilang dari hujungnya.

    Setelah terlalu banyak pembelahan sel, telomer sel & kromosom 8217 memendek ke titik di mana sel berubah menjadi sel barah, atau sel menjadi & # 8220senescent & # 8221- yang bermaksud bahawa sel berhenti membahagi sepenuhnya.


    Struktur Kromosom

    Kesinambungan hidup dari satu sel ke sel lain mempunyai asasnya dalam pembiakan sel melalui kitaran sel. The kitaran sel adalah urutan peristiwa yang teratur yang menerangkan tahap kehidupan sel & rsquos dari pembahagian sel induk tunggal hingga penghasilan dua sel anak baru. Mekanisme yang terlibat dalam kitaran sel sangat terkawal. Sebahagian daripada peraturan itu melibatkan bentuk fizikal dan struktur yang DNA ada semasa fasa berbeza kitaran sel.

    Struktur dan Pemadatan Kromosom Eukariotik

    Sekiranya DNA dari semua 46 kromosom dalam nukleus sel manusia dibentangkan dari ujung ke ujung, ia akan mengukur kira-kira dua meter namun diameternya hanya 2 nm. Memandangkan bahawa ukuran sel manusia biasa kira-kira 10 & mikrom (100,000 sel berjajar sama satu meter), DNA mesti dikemas rapat untuk masuk ke dalam nukleus sel & rsquos. Pada masa yang sama, gen ini juga mesti mudah diakses untuk diungkapkan gen. Semasa beberapa peringkat kitaran sel, untaian panjang DNA dipekatkan menjadi kromosom padat. Terdapat beberapa cara kromosom dipadatkan.

    Pada tahap pemadatan pertama, regangan pendek heliks berganda DNA membalut teras lapan histon protein pada selang masa yang tetap sepanjang keseluruhan kromosom (Rajah 3). Kompleks DNA-histone dipanggil kromatin. Kompleks DNA histon seperti manik dipanggil a nukleosom, dan DNA yang menghubungkan nukleosom disebut DNA penghubung. Molekul DNA dalam bentuk ini kira-kira tujuh kali lebih pendek daripada heliks berganda tanpa histon, dan manik-maniknya berdiameter sekitar 10 nm, berbeza dengan diameter 2-nm heliks ganda DNA. Tahap pemadatan seterusnya berlaku kerana nukleosom dan DNA penghubung di antara mereka digulung menjadi serat kromatin 30-nm. Lingkaran ini memendekkan lagi kromosom sehingga kini kira-kira 50 kali lebih pendek daripada bentuk lanjutan. Dalam pembungkusan peringkat ketiga, pelbagai protein berserabut digunakan untuk membungkus kromatin. Protein berserabut ini juga memastikan bahawa setiap kromosom dalam sel tidak membahagikan menduduki kawasan tertentu nukleus yang tidak bertindih dengan mana-mana kromosom lain.

    Rajah 3. DNA untai dua membungkus protein histon untuk membentuk nukleosom yang mempunyai rupa & ldquobeads pada tali. & Rdquo Nukleosom dililit menjadi serat kromatin 30-nm. Apabila sel mengalami mitosis, kromosom semakin mengembun.

    DNA mereplikasi dalam fasa S interphase. Selepas replikasi, kromosom terdiri daripada dua berangkai kromatid kakak. Hubungan antara kromatid kakak adalah paling rapat di rantau yang dipanggil sentromer. Kromatid saudari yang bersambung, dapat dilihat di bawah mikroskop cahaya. Kawasan centromeric sangat padat dan dengan itu akan muncul sebagai kawasan yang terhad.

    Animasi ini menggambarkan tahap pembungkusan kromosom yang berbeza:

    Elemen YouTube telah dikecualikan daripada versi teks ini. Anda boleh melihatnya dalam talian di sini: pb.libretexts.org/biowm/?p=142

    DNA dalam eukariota sangat berstruktur dan teratur dalam semua peringkat kehidupan organisma. Organisme diploid mengandungi sepasang setiap kromosom manusia mempunyai 23 pasang untuk jumlah 46 kromosom. Pasangan kromosom, juga dikenali sebagai kromosom homolog, mengandungi gen yang sama walaupun mungkin terdapat perbezaan antara versi gen pada setiap ahli pasangan itu. DNA biasanya dimasukkan ke dalam nukleus sel eukariotik, melalui kompleks protein-DNA yang membentuk ciri bentuk lsquochromosome & rsquo yang pekat. DNA dipadatkan lebih jauh sebagai persediaan untuk pembahagian sel.


    Perbincangan

    Reka bentuk eksperimen untuk penyiasatan semasa adalah berdasarkan kajian terdahulu kami yang menunjukkan bahawa replikasi memintas DNA untai tunggal yang mengandungi AFB khusus tapak.1-Fapy-dG sangat terdedah kepada ralat dan bahawa in vitro TLS melepasi penambahan ini telah dilakukan oleh pol ζ (tetapi bukan oleh mana-mana polimerase lain yang diperiksa) dengan hasil mutagen yang merumuskan semula dalam vivo (15). Data ini membawa kepada hipotesis bahawa sel kekurangan pol ζ akan menjadi lebih sensitif kepada AFB1 dedahan. Hasil yang ditunjukkan dalam Rajah 1 AC menunjukkan pergantungan yang kuat terhadap kehadiran pol ζ untuk perlindungan terhadap AFB1sitotoksisiti yang disebabkan. Adalah penting bahawa, jika tiada pol ζ, kematian sel bukanlah akibat serta-merta AFB1 pendedahan, tetapi memerlukan kejadian berikutnya untuk dinyatakan dalam kematian sel. Peranan yang dicadangkan untuk pol ζ sebagai penyumbang TLS melepasi AFB1Kerosakan yang disebabkan telah dibuktikan di sini dengan membandingkan kecekapan replikasi AFB helai tunggal1-Fapy-dG–mengandungi vektor dalam sel yang sama ada mahir atau dirobohkan untuk Rev3L. Malah kejatuhan subunit pemangkin pol ζ yang tidak lengkap mengakibatkan pengurangan ketara dalam DNA keturunan yang berasal daripada vektor yang mengandungi tambahan. Data ini mencadangkan bahawa pol ζ adalah penting untuk TLS lepas AFB1-Fapy-dG dan bersetuju dengan AFB1sitotoksisiti pertengahan di Rev3L-MEF yang kurang.

    Setelah menetapkan peranan penting untuk pol ζ dalam pintasan replikasi AFB1-disebabkan kerosakan DNA, siasatan kami beralih ke pemahaman apakah pol ζ berfungsi pada garpu replikasi terhenti semasa fasa S atau adakah ia direkrut semasa titik pemeriksaan S / G2 untuk membenarkan peralihan ke G2. Sehubungan itu, AFB1 pendedahan tidak menyebabkan blok replikasi segera tanpa mengira status pol ζ. Dijangkakan bahawa pol ζ adalah penting untuk penyelesaian perantaraan replikasi yang tidak lengkap (mungkin dengan memangkin TLS melepasi AFB1- kerosakan yang disebabkan) yang terbentuk dalam fasa S dan perlu diperbaiki untuk memulihkan kitaran sel yang normal. Spekulasi ini didasarkan pada pengamatan bahawa, dalam sel yang mahir pol ζ, peningkatan sel positif-γ2AX hanya sementara dan dipulihkan ke tahap awal dalam 48 jam selepas rawatan, sedangkan sel kekurangan pol ζ tidak pernah pulih. Selain itu, dalam sel kekurangan pol, blok replikasi berterusan dalam G2 boleh mengaktifkan pusat pemeriksaan G2/M. Penemuan ini adalah sama dengan pemerhatian kecacatan dalam pembaikan pascareplikasi mengisi jurang dalam Rev3L −/− MEF selepas pendedahan UVC (30). Akibatnya, DNA yang tidak ditiru secara lengkap mungkin rentan terhadap kerosakan DNA pada G2 yang dapat memicu kematian sel atau, sebagai gantinya, mengakibatkan ketidakstabilan genom.

    Laporan semasa menunjukkan bahawa pol ζ memainkan peranan penting dalam tindak balas selular terhadap AFB1 pendedahan dan terlibat dalam TLS melepasi AFB yang paling berterusan dan sangat mutagenik1-tambahan teraruh, AFB1-Fapy-dG, dalam sel manusia. Analisis kajian replikasi in vitro sebelumnya menunjukkan bahawa pol ζ meniru AFB yang lalu1-Fapy-dG dengan cara yang sangat mudah ralat (15). Oleh itu, dijangkakan bahawa pengumpulan AFB1Mutasi titik bergantung pol ζ yang disebabkan oleh Fapy-dG akan membawa kepada mutagenesis yang dipertingkatkan. Selaras dengan penemuan ini, TP53 R249S tandatangan mutasi bersama dengan jangkitan HBV kronik adalah ciri biasa dalam AFB1-HCC yang berkaitan yang boleh menyebabkan tindak balas kerosakan DNA yang rosak dan percambahan yang tidak terkawal. Ia boleh difikirkan bahawa, di bawah AFB kronik1 pendedahan, hepatosit dapat mengumpulkan mutasi titik dengan tindakan pol ζ untuk meningkatkan kelangsungan hidup sel. Mutagenesis yang didorong oleh pol ζ ini mungkin lebih tinggi pada individu yang membawa Rev3L Varian 460 T ke C, yang telah terbukti menghasilkan ekspresi tinggi dari Rev3L (31). Sebaliknya, sel dengan tahap pol ζ yang berkurang atau mengalami kecacatan dalam pengambilannya ke laman DNA yang rosak mungkin terdedah kepada ketidakstabilan genom kerana pemprosesan AFB yang tidak mencukupi1-lesi DNA yang disebabkan. Dalam kedua-dua senario, sel akhirnya boleh memperoleh kombinasi kritikal perubahan genetik untuk mendorong transformasi dan perkembangan tumor.


    Penjanaan data penjujukan

    Data penjujukan bacaan terpaut pukal bagi sel RPE-1

    Data baca-baca RPE-1 dihasilkan di Pusat Analisis Genom Yale. Berat molekul tinggi DNA dari sel RPE-1 diekstrak menggunakan kit RevoluGen PuriSpin Fire Monkey mengikuti protokol yang diberikan oleh vendor dengan pengubahsuaian berikut: Sel-sel dilancarkan pada suhu 56 ∘ C selama 2 jam, diikuti dengan penambahan N 100 ng RNase A dan inkubasi tambahan selama 15 minit pada suhu 56 ∘ C. Sebuah perpustakaan baca-baca tunggal dibina menggunakan Kit Perpustakaan Chromium Genome v2 dari Genomik 10X mengikut protokol standard. Perpustakaan kemudian diurutkan di platform Illumina NovaSeq untuk menghasilkan 941,518,426 pasangan baca dengan jarak liputan rata-rata 60 ×. Lihat Jadual 1 untuk metrik tambahan data penjujukan.

    Data Penjujukan Konsensus Pekeliling PacBio bagi sel RPE-1

    Data Penjujukan Konsensus Pekeliling PacBio bagi populasi keturunan yang diperoleh daripada satu sel telah dijana di Institut Luas. Sebanyak 4.607.047 bacaan Kesetiaan Tinggi (Hi-Fi) dihasilkan selepas pembetulan konsensus pekeliling dengan panjang bacaan N50 7.3kb. Purata liputan jujukan ialah ~ 11×. Data penjujukan akan dikeluarkan di Arkib Bacaan Pendek NCBI sebagai SRR13579109.

    Urutan data sel RPE-1 monosom

    Sel RPE-1 monosom dihasilkan dengan menggunakan tiga strategi yang berbeza: (1) Blok dan pelepasan nokodazol [24] (2) Induksi jambatan kromosom dikentrik [48] dan (3) Rawatan dengan Paclitaxel, toksin gelendong yang mendorong tetraploidisasi dengan mencegah mikrotubulin pembongkaran. Ketiga-tiga strategi meningkatkan secara signifikan frekuensi pengasingan kromosom dan penjanaan sel anak monosom. Sel monosomik pertama kali dipilih berdasarkan nombor salinan DNA tahap lengan yang dianggarkan dari jujukan keseluruhan-genom lulus rendah (0,1 ×) dan kemudian diuruskan menjadi 5-30 × pada platform Illumina HiSeq 2500 atau Illumina NovaSeq di Broad Institute daripada MIT dan Harvard. Kami kemudian mengenal pasti dan mengesahkan kromosom monosom sepenuhnya berdasarkan "heterozigositas dinormalisasi" [24] dalam data penjujukan mendalam yang ditakrifkan sebagai

    The heterozigositas diperhatikan hlmhet ditakrifkan sebagai pecahan laman web heterozigot ibu bapa yang menunjukkan liputan heterozigot dalam genom sel tunggal liputan alel yang diperhatikan ditakrifkan sebagai median bagi pecahan tapak heterozigot yang menunjukkan liputan rujukan hlmrujukan dan pecahan tapak heterozigot yang menunjukkan liputan alternatif hlmalt, yang kira-kira sama dengan liputan rata-rata setiap kromosom ibu bapa di kawasan disom dalam genom sel tunggal [24]. Varian heterozigot pada genom induk dikesan menggunakan data penjujukan pukal seperti yang dijelaskan di bawah di bahagian "Panggilan dan penyaringan varian". Untuk menghapuskan heterozigositi palsu akibat ralat penjujukan atau penguatan dalam data sel tunggal, kami menganggap tapak varian untuk menunjukkan rujukan atau liputan ganti hanya apabila bilangan bacaan penjujukan yang menunjukkan sama ada genotip melebihi ambang yang ditetapkan sebagai d ∗ = maks(2,1+0.1×min kedalaman penjujukan kromosom): d ∗ = 2 jika kedalaman penjujukan purata ≤10 × (kebanyakan sampel) dan d ∗ =4 jika min kedalaman jujukan ialah 30 ×. Ambang minimum 2 bacaan digunakan untuk menghilangkan ralat penjujukan rawak ambang 0,1 × kedalaman penjujukan rata-rata yang disajikan untuk mengecualikan kesalahan penguatan frekuensi rendah (& lt10%). Monosom lengkap dipilih berdasarkan kriteria bahawa heterozigositas dinormalisasi kurang dari 0.1 × median dari semua sel diploid (≈ 1). Untuk kajian semasa, kami memilih 39 sel dengan satu atau beberapa kromosom monosom (32 dari pelepasan nocodazole, 5 dari induksi jambatan, dan 2 dari perlakuan Paclitaxel), yang mengandung 98 kromosom monosom. Nama sampel, kedalaman penjujukan min, dan heterozigositi normal kromosom monosomik disenaraikan dalam Fail Tambahan 6.

    Pemprosesan data urutan

    Semua data penjujukan yang disenaraikan dalam Jadual 1 dan S1 telah diproses semula bermula daripada bacaan penjujukan yang tidak dipetakan. Untuk data bacaan terpaut, kami menggunakan perisian LongRanger daripada 10X Genomics untuk mengekstrak kod bar molekul setiap serpihan penjujukan yang disimpan dalam teg "BX" dalam rekod BAM. Maklumat kod bar molekul hanya digunakan sebagai bukti hubungan molekul tetapi tidak untuk penjajaran urutan. Pemrosesan penjajaran dan pasca penyelarasan semua data penjujukan kecuali data pembacaan terpaut K-562 diselesaikan menggunakan saluran paip yang sama seperti yang dijelaskan di bawah. Untuk data bacaan terpaut K-562, kami menggunakan output daripada LongRanger untuk analisis hiliran.

    Penjajaran data urutan

    Kami menyelaraskan semua data penjujukan (kedua-dua bacaan yang dihubungkan dan Hi-C) menggunakan penjajaran bacaan pendek standard (https://github.com/lh3/bwa) dengan parameter lalai ("bwa mem"). Menggunakan penjajaran agnostik kod bar memastikan kekhususan maklumat pautan yang lebih baik (dan oleh itu ketepatan fasa yang lebih baik) daripada menggunakan penjajaran sedar kod bar seperti Lariat (https://github.com/10XGenomics/lariat) dalam saluran paip LongRanger. Rasionalnya dijelaskan di bawah dalam Fail tambahan 1: Bukti penghubung dari pengenal molekul dan penjajaran urutan bacaan yang dihubungkan.

    Data PacBio CCS sel RPE-1 diselaraskan menggunakan minimap2 (https://github.com/lh3/minimap2) dengan perintah berikut: minimap2 -ax map-pb.

    Pemprosesan pasca penjajaran

    Apabila memilih kedudukan penjajaran utama bacaan penjujukan dengan berbilang kedudukan penjajaran (penjajaran tambahan atau sekunder), kami memberi keutamaan kepada kedudukan penjajaran yang konsisten dengan konfigurasi pasangan yang betul, iaitu, meletakkan dua pasangan pada orientasi hadapan-balik dengan saiz sisipan yang disimpulkan. dalam peratus 0.1% dan 99.9% dari histogram ukuran sisipan. Histogram ukuran sisipan dihasilkan untuk setiap perpustakaan penjujukan dari 2.000.000 secara unik (kedua pasangan mempunyai kualiti pemetaan 60) dan dengan betul (dua pasangan ditempatkan pada orientasi maju-mundur dengan pemisahan & lt2000 bp) pasangan baca sejajar berdasarkan kedudukan penjajaran pasangan pasangan. Kami menggunakan program MarkDuplicates dalam Picard (https://broadinstitute.github.io/picard/) untuk membuat kesimpulan bacaan penjujukan yang sepadan dengan pendua PCR berdasarkan kedudukan penjajaran utama dan melaraskan teg penduaan bagi penjajaran utama dan tambahan dengan sewajarnya.

    Varian panggilan dan penapisan

    Kami menjalankan program HaplotypeCaller dari GATK (v4.0.12.0-6-gfef36e3-SNAPSHOT) dalam mod penemuan (“--GENOTyping-mode DISCOVERY”) untuk mengesan varian genetik. Kami mengenakan penapis baca berikut sebagai tambahan kepada parameter standard dan penapis baca yang digunakan oleh HaplotypeCaller untuk mengecualikan pembacaan dengan pemetaan yang tidak betul, tidak tepat, atau rendah keyakinan:

    Untuk genom RPE-1, penemuan varian dilakukan secara bersama pada data bacaan terpaut baharu (60×) dan data genom keseluruhan standard yang diterbitkan sebelum ini (13×) [53]. Untuk genom NA12878, penemuan varian dilakukan pada kedua-dua data bacaan yang dipautkan (35 × setiap satu) [54].

    Kami memilih laman varian nukleotida dwi-allelic (satu rujukan ditambah satu alternatif) sebagai input untuk inferens haplotype, tidak termasuk laman web di kawasan pericentric, acrocentric, dan centromeric berdasarkan anotasi pita kromosom standard ("acen," "gvar," “ tangkai ”) disediakan oleh pelayar genom UCSC. Tidak ada penapis lain (misalnya, penilaian semula skor kualiti varian) yang digunakan.

    Kesimpulan Haplotype dari bukti hubungan

    Kami mula-mula memperkenalkan perwakilan berangka binari genotip pada varian heterozigot sebagai +1 untuk asas rujukan dan -1 untuk asas ganti. Blok haplotaip yang terdiri daripada N laman web varian dilambangkan sebagai vektor

    Begitu juga, pautan molekul dengan maklumat genotip di beberapa laman web varian ditunjukkan sebagai

    Dengan menggunakan perwakilan genotip binari, kita dapat mempermudah empat jenis perkaitan antara genotip (sama ada σi atau si)

    menjadi dua jenis hubungan haplotaip

    Selain itu, pautan molekul (σi,σj) antara tapak i dan j selaras dengan hubungan haplotype (si,sj) jika dan hanya jika

    Sekiranya kebarangkalian kesalahan pautan molekul diberikan oleh εij, kemudian

    Dengan andaian kebarangkalian seragam sebelumnya hlm(sisj=1)=hlm(sisj= −1) = 1/2, kita dapat menulis semula persamaan di atas sebagai

    Melanjutkan ini kepada koleksi pautan (left ^ <(k)> sigma _^ <(k)>, 1 leq k leq n kanan > ), kita ada

    yang membawa kepada fungsi log-kemungkinan berikut

    Sekiranya kita menganggap kadar kesalahan tetap untuk semua pautan, ( epsilon _ <> ^ <(k)> = epsilon ), Persamaan. (5) dipermudahkan untuk

    Hubungan haplotype yang disimpulkan dari semua pautan molekul diberikan oleh

    Kita dapat menyamaratakan Persamaan. (5) kepada N varian sebagai

    dan selesaikan penyelesaian haplotaip yang optimum Ŝ dengan memaksimumkan Persamaan. (8). Kami selanjutnya menganggap kekerapan hubungan molekul yang tidak betul

    Dengan penghampiran ini, kita dapat mempermudah Persamaan. (8) sebagai

    sebagai bilangan pautan yang sesuai dengan kedua-dua jenis hubungan haplotype antara laman web i dan j.

    Rasional untuk penghampiran dalam Pers. (9) adalah bahawa kita menjangkakan hubungan yang salah disebabkan oleh ralat rawak (yang dihasilkan dalam pembinaan perpustakaan atau penjujukan) atau penjajaran urutan yang salah untuk mempengaruhi setiap molekul dengan kebarangkalian yang sama. Walau bagaimanapun, penjajaran yang salah dapat diperkaya secara signifikan dekat varian yang dikesan di kawasan dengan kerumitan rendah. Oleh itu kami menganggarkan εij daripada bukti kaitan yang diperhatikan sebagai

    Di sini ( min (n_ <> ^ <+>, n_ <>^^<->)/(n_<> ^ <+> + n_ <> ^ <->) ) adalah pecahan hubungan haplotaip kecil antara dua laman varian i dan j (min (n_<>^^<+>,n_<> ^ <->) = 0 ) jika tidak ada kaitan haplotaip yang tidak sesuai. ε0 mencerminkan ralat rawak dan boleh dianggarkan menggunakan pecahan purata kaitan sumbang yang diperhatikan

    Formalisme inferens haplotaip yang ditakrifkan dalam Pers. (8) dan (10) mempunyai beberapa kelebihan. Pertama, perwakilan binari fasa haplotaip dan hubungan molekul mengekalkan simetri antara haplotip ibu bapa (S dan −Satau pautan molekul yang berasal dari kromosom ibu bapa (σ dan −σ). Ini adalah mudah untuk melakukan inferens haplotype dalam genom aneuploid di mana satu homolog boleh menyumbang bukti kaitan dominan (cth., di kawasan hemizygous atau trisomik).

    Kedua, formalisme berkenaan secara langsung untuk fasa blok haplotype. Sebagai contoh, kita boleh mewakili haplotaip ibu bapa menggunakan blok tempatan Bi dan fasa haplotaip mereka bi=±1 sebagai

    (gariskan _>=-mathbf _) adalah fasa pelengkap bagi Bk. Kita boleh mengira hubungan molekul antara blok (serupa dengan Persamaan (11)) sebagai

    dan selesaikan fasa haplotaip (b1,b2, ⋯ bm) dengan memaksimumkan fungsi log-kemungkinan yang serupa dengan Persamaan. (10).

    Akhirnya, memaksimumkan Persamaan. (10) adalah bersamaan dengan meminimumkan tenaga model Ising (kaca putaran) 1D

    dengan interaksi julat terhingga (M_<> = (n_ <>^^<+>-n_<>^<->)ln (1-epsilon _<>/epsilon _<>) ), yang mana terdapat banyak pendekatan yang ada. Di sini kami menyelesaikan masalah ini dengan memperkenalkan dua jenis gangguan:

    Perubahan kepada E(S) kerana gangguan ini diberikan oleh


    PERBINCANGAN

    Kami memanipulasi nombor kinetochore untuk menguji model mudah untuk peraturan panjang gelendong. Mengeluarkan dan menambah kinetochores memanjang dan memendekkan gelendong, masing-masing, menunjukkan bahawa kinetochores menjana daya masuk dan sekurang-kurangnya satu daya gelendong bergantung kepada panjang. Menambah kinetochore tambahan pada gelendong jenis liar menunjukkan bahawa nombor kinetochore mengawal nombor mikrotubule gelendong.

    Imbangan daya mengatur panjang gelendong

    Kami menguji hubungan antara nombor kinetochore dan panjang gelendong. Memusnahkan semua kinetochores (ndc10-1atau membuang kohesin menyebabkan pemanjangan gelendong serupa (Rajah 2C Stephens et al., 2011). Pemanjangan gelendong kekurangan kinetochore telah ditindas apabila Kip1 (motor kinesin-5) telah dipadamkan (Rajah 2C). Menambah kinetokor dipendekkan gelendong kinetokor sintetik dipendekkan ndc10-1 gelendong (Rajah 4C), dan kinetokor tambahan memendekkan gelendong jenis liar (Rajah 5, C dan D), menunjukkan bahawa kinetokor kakak berpasangan memberikan daya masuk yang menghalang pemanjangan gelendong. Kerja kami memanjangkan kajian dalam yis pembelahan (Goshima et al., 1999) dan sel manusia (DeLuca et al., 2002) yang menunjukkan bahawa menghalang kinetokores atau kohesin memanjangkan gelendong.

    Kajian lain mengenai yis tunas mencapai kesimpulan yang sama. Bouck dan Bloom (2007) mencadangkan keseimbangan antara daya keluar yang dihasilkan oleh motor dan daya masuk daripada kromatin perisentrik seperti spring. Kedua-dua kohesin dan kondensin dilaporkan mengawal kekakuan (Stephens et al., 2011) musim bunga tidak linear (Stephens et al., 2013). Menunjukkan bahawa panjang gelendong berbeza dengan nombor kinetochore memberikan bukti lanjut untuk kewujudan daya bergantung panjang dan peranannya dalam menetapkan panjang gelendong.

    Kajian sitologi awal pada sel meiotik menyokong peranan kinetochores dan lampiran kromosom dalam mengawal selia pemasangan dan panjang gelendong. Dalam spermatosit serangga, kromosom memicu pemasangan gelendong (Zhang dan Nicklas, 1995), mengawal bilangan mikrotubulus (Zhang dan Nicklas, 1995), dan mempengaruhi panjang gelendong (LaFountain, 1972), walaupun gelendong yang dipasang dapat bertahan tanpa kromosom (Zhang dan Nicklas, 1996). Kajian mengenai kedudukan kromosom mencadangkan kewujudan daya bergantung kepada panjang (Hays et al., 1982) yang saiznya bergantung kepada nombor mikrotubulus (Hays dan Salmon, 1990).

    Model keseimbangan kekuatan sebelumnya mencadangkan antagonisme antara motor mikrotubulus terarah plus dan minus sebagai sumber daya lawan (Saunders et al., 1997 Troxell et al., 2001 Civelekoglu-Scholey et al., 2010). Keputusan kami menunjukkan bahawa mengurangkan dan meningkatkan nombor kinetochore memanjangkan dan memendekkan gelendong, mendedahkan bahawa model yang hanya bergantung pada kelas lawan motor yang bertindak pada mikrotubul interpolar adalah terlalu mudah dan daya yang dikenakan oleh mikrotubul kinetochore juga mesti dipertimbangkan.

    Hasil kajian kami tidak menunjukkan daya yang bergantung pada panjang atau mekanisme molekul yang menghasilkan ketergantungan panjang. Daya tolakan yang dihasilkan oleh tindakan tambah motor terarah akhir, seperti Cin8 dan Kip1, harus bergantung pada panjang zon tumpang tindih antara mikrotubul antiselari dalam gelendong pusat, tetapi peranan juga telah dicadangkan untuk molekul lain, termasuk Kip3, motor terarah hujung tambah (Varga et al., 2006, 2009 Syrovatkina et al., 2013), dan Ase1, protein pengikat mikrotubule (Braun et al., 2011 Syrovatkina et al., 2013).

    Kongresi kromosom ke kedudukan yang sama jauh dari mana-mana kutub menunjukkan bahawa daya yang bergantung kepada panjang atau kedudukan juga mesti bertindak pada kromosom jika tidak, sepasang kromatid kakak akan menunjukkan jalan rawak di sepanjang paksi antara kutub gelendong. Depolimerisasi mikrotubulus bergantung panjang oleh Kip3 adalah salah satu model untuk kekuatan poleward yang bergantung pada panjang pada kinetochores, tetapi kemungkinan lain juga ada (Gardner et al., 2005, 2008).

    Model daya yang berbeza mungkin digunakan pada gelendong yang berbeza. Dalam yis tunas, mikrotubulus kinetochore adalah lima kali lebih biasa daripada mikrotubul interpolar, tetapi dalam kebanyakan sel haiwan, kebanyakan mikrotubulus tidak menghubungi kinetokor, membayangkan bahawa interaksi lain mengawal panjang gelendong. Keseimbangan antara dynein, motor terarah hujung tolak dan Eg5, motor arah akhir tambah, membantu menetapkan panjang Xenopus (Uteng et al., 2008) dan manusia (Tanenbaum et al., 2008) gelendong, manakala embrio Drosophila gelendong diatur oleh keseimbangan antara dua kinesin antagonis yang bertindak pada mikrotubulus antiparallel (Sharp et al., 2000).

    Model lain peraturan panjang gelendong

    Kami mengesahkan ramalan model berdasarkan daya bergantung kepada panjang (Rajah 1). Walaupun kami tidak cuba mengetepikan model secara eksplisit berdasarkan pembaris molekul, kecerunan atau komponen pengehad, keputusan kami menentang bentuk mudah model ini. Satu gegelung homodimerik yang mencapai dari tiang gelendong ke titik tengah gelendong sejauh 1 μm perlu panjang ∼7000 asid amino, sedangkan protein ragi terbesar, Rea1, hanya 4910 asid amino panjang (Garbarino dan Gibbons, 2002) tiada satu protein yis yang cukup lama untuk berfungsi sebagai pembaris. Matriks gelendong, yang telah digambarkan sebagai pembaris (Johansen et al., 2011), ialah struktur polimer yang kurang difahami. Tidak ada cadangan untuk apa yang memberikannya ukuran yang ditentukan, dan tidak ada matriks yang dijumpai dalam ragi. Keupayaan gelendong untuk memanjang apabila pemusnahan kinetochore (Rajah 2C dan Rajah Tambahan S1C) dan meneruskan sintesis sampul nuklear dalam mitosis (Witkin et al., 2012) berhujah menentang sekatan fizikal oleh matriks atau sampul nuklear.

    Pelbagai kecerunan dicadangkan untuk mengatur panjang gelendong. Dalam C. elegans, kecerunan protein TPXL-1 terpancar daripada sentrosom (Greenan et al., 2010) mengurangkan saiz centrosom mengubah kecerunan dan memendekkan gelendong. Dalam kajian kami, bagaimanapun, sel-sel dengan badan kutub gelendong yang lebih besar mempunyai gelendong yang lebih pendek (Rajah 6D). Hasil kami juga menunjukkan bahawa kecerunan yang dibentuk oleh kromatin, seperti kecerunan Ran-GTP (Carazo-Salas et al., 2001 Wilde et al., 2001 Bastiaens et al., 2006), tidak mungkin memainkan peranan penting dalam yis tunas, kerana panjang gelendong berbeza secara meluas dalam sel yang mengandungi jumlah kromatin yang sama. Kinetochores yang tidak aktif memanjangkan gelendong, walaupun jumlah kromatin dan bilangan kromosom tidak berubah (Gambar 2C dan 4C), dan menambah 20 plasmid sentromerik meningkatkan jumlah DNA nuklear hanya 2.5% tetapi memendekkan gelendong sebanyak 31% (Gambar 5C) . Kita tidak boleh menolak kecerunan yang terpancar daripada kinetochore, kerana kita memanipulasi nombor kinetochore. Menghilangkan kemungkinan ini memerlukan manipulasi setiap molekul yang mungkin menghasilkan kecerunan seperti itu. Satu laluan isyarat berasaskan kinetochore yang diketahui, pusat pemeriksaan gelendong, telah dipecahkan dalam eksperimen dengan kinetochore tambahan, dengan alasan bahawa output akhir pusat pemeriksaan tidak mengawal panjang gelendong atau nombor mikrotubule.

    Panjang gelendong telah ditunjukkan berskala dengan saiz sel dalam organisma yang sedang membangun (Wühr et al., 2008 Hara dan Kimura, 2009), dan ini dipercayai disebabkan oleh pengehadan jumlah komponen gelendong. Skala gelendong in vitro yang dipasang dengan isipadu sitoplasma, dengan gelendong yang lebih pendek dibina dalam isipadu yang lebih kecil (Bagus et al., 2013 Hazel et al., 2013). Manakala mengehadkan jumlah bahan gelendong, seperti tubulin, mungkin menentukan berapa besar gelendong boleh dipasang dalam Xenopus, di mana >50% daripada tubulin sitoplasma dipolimerkan menjadi gelendong (Baik et al., 2013), ini nampaknya tidak berlaku untuk pemula ragi. Mengurangkan jumlah tahap tubulin sebanyak separuh tidak menjejaskan S. cerevisiae’kemampuan tumbuh, membentuk gelendong, atau memisahkan kromosom, dan sel-sel ini tidak mengatur ekspresi tubulin sebagai tindak balas terhadap penipisan tubulin (Katz et al., 1990). Mengurangkan tubulin selular sebanyak 80% diperlukan untuk menghasilkan pengurangan panjang gelendong anafasa (Lacefield et al., 2006). Di samping itu, kajian dengan Kip3 juga menunjukkan bahawa tubulin tidak mengehadkan apabila Kip3 dipadamkan, gelendong anafasa lewat memanjang secara dramatik berbanding dengan sel jenis liar (Rizk et al., 2014). Jumlah tubulin yang terhad tidak diagihkan semula daripada mikrotubulus astral ke gelendong, kerana mikrotubul astral juga bertambah empat kali ganda panjangnya dalam kip3Δ sel (Cottingham dan Hoyt, 1997 Miller et al., 1998 Rizk et al., 2014). Dalam eksperimen kami, jumlah jisim tubulin yang dipolimerkan menjadi mikrotubul meningkat dalam sel yang mengandungi banyak kromosom mini: sel dengan 23 plasmid mengandungi 40% lebih polimer tubulin daripada jenis liar (hlm = 0.05, Pelajar t ujian), menunjukkan bahawa tubulin tambahan tersedia untuk dimasukkan ke dalam mikrotubulus gelendong. Di samping itu, sel kami dengan kinetokor tambahan menunjukkan kemajuan kitaran sel normal tanpa jeda yang dapat dikesan untuk mengumpul protein tambahan (Rajah Tambahan S5B). Tidak diketahui berapa peratus tubulin yang ada dipolimerisasi ke dalam spindle yis pemula, tetapi berdasarkan hasil dan kajian kami sebelumnya mengenai penipisan tubulin (Katz et al., 1990) dan Kip3 (Rizk et al., 2014), tidak mungkin mengehadkan tahap tubulin menetapkan panjang gelendong dalam organisma ini. Di samping itu, kerana gelendong kami tidak menunjukkan pemuliharaan jisim gelendong dengan kehadiran kinetokor tambahan, tidak mungkin model panjang gelendong berdasarkan keseimbangan jisim dan kehabisan komponen pengehad lain (Reber). et al., 2013) mengatur panjang gelendong yis pemula.

    Kami mengukur kesan nombor kinetochore pada panjang gelendong tanpa mengubah ploidi. Kerja terdahulu menunjukkan bahawa sel haploid, diploid, triploid, dan tetraploid semuanya mempunyai panjang gelendong yang sama walaupun bilangan lampiran kromosom berbeza (Lin et al., 2001 Storchová et al., 2006). Mungkin jumlah mikrotubulus kinetochore dan interpolar meningkat dengan ploidy, mengekalkan keseimbangan antara daya masuk dan luar pada gelendong tanpa mengubah panjangnya. Dengan memanipulasi bilangan lampiran dalam sel haploid, kami mengelakkan sebarang kemungkinan pembolehubah yang mengelirukan yang dihasilkan dengan menukar ploidi.

    Kinetochores meningkatkan bilangan mikrotubulus

    Kami menghasilkan sel ragi dengan hingga 30 plasmid sentromerik tambahan setiap sel. Walaupun kajian awal membawa kepada idea bahawa sentromer tambahan mentitrasi sejumlah terhad protein kinetochore atau microtubules (Futcher dan Carbon, 1986 Runge et al., 1991), Wells dan Murray (1996) menunjukkan bahawa pemadaman pusat pemeriksaan gelendong menghapuskan kelewatan kitaran sel dan kematian yang disebabkan oleh sentromer tambahan. Kami menunjukkan bahawa sel dengan >30 plasmid centromeric tambahan masih boleh biorientasikan kromosomnya (Rajah 5, G dan H), melalui anafasa (Rajah 5E), plasmid asing (Rajah Tambahan S5A), membesar pada kadar normal dan menghasilkan anak perempuan yang berdaya maju (Tambahan). Rajah S5B), menunjukkan bahawa komponen badan kinetochore dan spindle pole tidak membatasi bilangan kinetokores berfungsi yang dapat dipisahkan oleh sel yis. Tomografi elektron resolusi tinggi menunjukkan badan kutub gelendong yis haploid boleh meningkat dalam saiz dan menghasilkan lebih banyak mikrotubul untuk memenuhi permintaan yang lebih tinggi ini (Rajah 6C). Fenomena ini berbeza dengan peningkatan saiz badan kutub gelendong dan nombor mikrotubulus yang dilihat pada penahanan berpanjangan cdc20 mutan pada suhu 37 ° C (O'Toole et al., 1997), memandangkan peningkatan yang kita lihat adalah berkaitan dengan bilangan kinetokor yang terkandung dalam sel dan bukannya konstitutif.

    Telah dicadangkan bahawa pusat pemeriksaan gelendong mengawal bilangan mikrotubul dalam gelendong yis yang sedang tumbuh kerana pusat pemeriksaan merasakan kinetokor yang tidak disambungkan, ia boleh mendorong nukleasi mikrotubule tambahan untuk meningkatkan peluang penangkapan kinetochore (Winey dan Bloom, 2012). Sel kita kekurangan Mad2, protein titik pemeriksaan, tetapi meningkatkan bilangan mikrotubulus kinetochore sehingga hampir sama dengan bilangan kinetochore. Kita boleh bayangkan tiga cara untuk menerangkan korelasi antara kinetochore dan nombor mikrotubule: badan kutub gelendong nukleus lebih mikrotubul daripada yang dilihat dalam gelendong jenis liar, tetapi hanya mereka yang melekat pada kinetochore yang stabil dan dilihat oleh kinetochore mikroskopi elektron berkomunikasi dengan badan kutub gelendong. melalui mekanisme bebas pusat pemeriksaan yang mengawal nukleasi mikrotubule atau terdapat pemilihan pada variasi yang diwarisi secara epigenetik dalam kapasiti nukleasi. Kami tidak boleh mengecualikan kemungkinan terakhir, kerana kami secara beransur-ansur meningkatkan nombor salinan plasmid centromeric dan mungkin telah memilih pecahan kecil sel yang boleh mengembangkan badan kutub gelendong mereka dan menghantar saiz yang lebih besar ini semasa pembahagian sel.

    Kerja kami menyokong model sederhana untuk pengatur panjang gelendong dengan keseimbangan daya yang bergantung pada panjang dan menunjukkan bahawa kinetochores mengatur bilangan mikrotubulus dalam gelendong ragi pemula. Spindle yis tunas adalah kecil dan mempunyai bilangan mikrotubul minimum yang diperlukan untuk mengasingkan kromosom sel, manakala haiwan dan tumbuhan mempunyai gelendong yang lebih besar dengan lebih banyak mikrotubul. Mengimbangi daya bergantung panjang yang menarik kinetokor ke arah kutub gelendong dan yang menolak kutub dari satu sama lain mungkin merupakan penyelesaian nenek moyang untuk mengawal panjang gelendong, dan eukariota yang lebih tinggi mungkin telah mengembangkan peraturan tambahan untuk mengatur gelendong mereka yang lebih besar dan lebih kompleks.


    Keputusan

    Dinamik Telomere Kromosom Individu dalam mTER − /− Embrio kekurangan Telomerase daripada Generasi Berbeza

    Sel primer (petikan 1 fibroblas embrio tikus, MEF) yang berasal dari embrio wt dan dari embrio mTER - / - dari generasi 1 (G1) hingga ke-6 (G6) diperoleh mengikut skema yang telah dijelaskan sebelumnya (Blasco et al., 1997) . Panjang telomere kromosom individu (kromosom 2 dan 11) diukur menggunakan Q-FISH dan lukisan kromosom. Kromosom 2 dipilih kerana secara konsisten mempunyai telomer yang agak pendek dalam beberapa jenis tetikus (Hande, M.P., dan P. Lansdorp, hasil kajian ini tidak diterbitkan). Kromosom 11 ialah homolog tetikus bagi kromosom manusia 17, yang didapati mempunyai telomer yang agak pendek dalam semua individu yang dianalisis sehingga kini (Martens et al., 1998).

    Rajah 1 menunjukkan ralat min dan piawai bagi keamatan pendarfluor telomere bagi semua telomer bersama-sama (purata q- dan p-lengan), dan juga q- dan p-lengan secara berasingan daripada MEF primer kedua-dua embrio wt dan mTER −/− daripada generasi ke-2 (KO2-G2), ke-4 (KO7-G4), dan ke-6 (embrio sampah KO9-G6 dan KO11-G6 KO1-G6 hingga KO4-G6 dan embrio KO5-G6). Walaupun terdapat banyak variasi antara nilai pendarfluor telomere individu (lihat misalnya Gambar 2 D), sebilangan besar titik data (& gt1,000) menghasilkan nilai ralat piawai yang tidak signifikan dalam nilai telomere dari semua kromosom. Ralat piawai juga kecil untuk telomer individu pada kromosom 2 dan 11, dengan bilangan titik data yang lebih kecil (50–100 lihat Rajah 1 A dan 2, B dan C). Ralat piawai dan bukannya sisihan piawai ditunjukkan untuk kejelasan dan tujuan pembentangan sahaja. Purata pendarfluor telomere bagi semua kromosom menurun secara linear semasa generasi berturut-turut mTER -/− tikus. Pemendekan telomere rata-rata adalah 3.9 kb per generasi (dihitung seperti yang dijelaskan dalam Rajah 1 B). Pemendekan ini memberi kesan kepada kedua-dua q-telomeres (telomeres bagi lengan-q) yang menunjukkan pemendekan 4.17 kb setiap generasi, dan p-telomeres (telomeres bagi lengan-p) yang menunjukkan pemendekan 3.7 kb setiap generasi. Akibatnya, perbezaan panjang telomer antara telomer p- dan q-arm dikekalkan sepanjang enam generasi tetikus (Rajah 1 B). Kehilangan berulang telomere pada tikus mTER - / - menghasilkan panjang purata 14.5 dan 22.4 kb untuk p- dan q-telomeres, masing-masing, dalam sel yang berasal dari generasi ke-6. Apabila kita mengukur min pendarfluor telomere kromosom 2, anggaran kadar pemendekan telomere setiap generasi ialah 3.4 kb untuk kedua-dua 2q- dan 2p-telomeres (Rajah 1, A dan B). Pemendekan telomer ini menghasilkan 2p- dan 2q-telomere generasi ke-6 dengan panjang purata 7.6 kb dan 16.2 kb, masing-masing (embrio KO9-G6 mempunyai anggaran panjang 2p-telomere hanya 0.15 ± 0.1 kb), lebih pendek daripada purata semua kromosom. Dalam kes kromosom 11, pendarfluor telomere rata-rata 11q dan 11p-telomer menurun pada kadar purata 5.2 dan 5.6 kb setiap generasi, masing-masing, hingga ke generasi ke-4 (Gambar 1, A dan B). Menariknya, dari generasi ke-4 (embrio KO-G4) hingga generasi ke-6 (purata tujuh embrio berbeza) kami tidak mengesan pemendekan telomer yang dijangkakan dalam mana-mana telomer kromosom 11 (Rajah 1 B). Sebaliknya, terdapat peningkatan 6-kb dalam panjang telomere pada generasi ke-6 (Rajah 1, A dan B). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa jika tiada aktiviti telomerase, pemendekan telomere berlaku pada kadar yang sama dalam semua hujung kromosom. Namun, nampaknya mekanisme yang menghalang pemendekan telomere dengan ketiadaan telomerase bertindak secara berbeza pada telomer yang berlainan. Dalam kajian kami, telomer kromosom 11 tidak menunjukkan pemendekan yang diramalkan dengan peningkatan generasi dalam tujuh embrio yang berbeza, manakala telomer kromosom 2 terus memendekkan sepanjang enam generasi tikus mTER -/- (lihat Perbincangan). Dalam kajian ini, kita tidak boleh menolak bahawa mekanisme bebas telomerase bagi penyelenggaraan telomere juga beroperasi pada tikus generasi awal mTER -/- atau berat.

    Menariknya, dalam sel-sel mTER - / - yang berbeza yang berasal dari embrio generasi ke-6, kita melihat heterogen yang ketara pada pendarfluor telomere rata-rata. Heterogenitas ini mempengaruhi kedua-dua telomer kromosom 2 dan 11 dan juga diperhatikan pada sel yang berasal dari embrio littermate. Variasi dalam panjang telomere ini boleh menjadi asas kepada penembusan berubah bagi fenotip yang diterangkan dalam tikus generasi ke-6 mTER -/- (Lee et al., 1998 Herrera et al., 1999).

    Dinamik Telomere Kromosom Individu dalam mTER − /− Sel yang Diabadikan Secara Spontan

    Laluan bersiri fibroblas embrio tetikus membolehkan pemilihan populasi oligoklonal dengan kapasiti untuk membiak secara stabil dalam budaya. Kami sebelum ini telah menerangkan bahawa laluan bersiri mTER -/− MEFs mengikut protokol 3T3 menghasilkan pemilihan garisan sel abadi dengan cara yang serupa dengan mTER +/+ MEFs, menunjukkan bahawa aktiviti telomerase tidak penting untuk mengabadikan sel tetikus (Blasco et al., 1997). Walaupun beberapa perbezaan diperhatikan dalam kadar pertumbuhan antara garis sel wt dan mTER - / -, semua kultur menunjukkan pertumbuhan berterusan yang melebihi 500 PD untuk G1 MEF dan 250 PD untuk G6 MEF (tidak ditunjukkan). Untuk memahami asas pertumbuhan berterusan sel negatif telomerase ini, kami telah menganalisis dinamik telomer mereka. Rajah 2 A menunjukkan min pendarfluor telomere bagi q- (bar hitam) dan p-telomeres (bar kelabu), secara berasingan, semasa peningkatan PD bagi sel wt dan mTER -/−. Kami mengira bahawa telomer sel berat, Wt14, mengalami pemendekan sederhana pada kadar anggaran 24.8 bp setiap PD (Rajah 2 A). Kejadian pemendekan telomere dalam MEF dapat menunjukkan bahawa tahap aktiviti telomerase yang terdapat dalam sel-sel ini tidak mencukupi untuk mencegah hakisan telomere seperti yang telah diajukan sebelumnya untuk jenis sel lain (Counter et al., 1994 Chiu et al., 1996) atau, sebagai alternatif, bahawa panjang telomer di sel kultur ini tidak diatur dengan ketat di sekitar panjang tetap.

    Berbeza dengan sel wt, garis sel mTER - / - berasal dari embrio 1st (KO16-G1 dan KO19-G1), 2nd (KO2-G2), dan generasi ke-4 (KO7-G4), menunjukkan penurunan ketara pada pendarfluor telomere. kedua-dua p- dan q-telomeres (Rajah 2 A). Purata kerugian telomere dalam garis sel yang berbeza berkisar antara 65 dan 108 bp per PD, sama dengan kadar pemendekan yang dijelaskan untuk sel manusia yang tidak mengekspresikan telomerase. Ini menunjukkan bahawa dalam sel mTER - / - ini yang telah lolos dari penuaan dan tidak kekal, panjang telomere rata-rata terus memendek dengan bertambahnya bilangan laluan. Menariknya, kadar pemendekan telomere pada kedua-dua p- dan q-telomeres menurun pada laluan kemudian (PDs 215 dan 322) barisan sel KO16-G1, mencadangkan pengaktifan mekanisme penyelenggaraan telomere apabila telomer memendekkan ke panjang kritikal (Rajah 1). 2 A). Dalam kes dua garis sel mTER - / - yang berbeza, KO9-G6 dan KO11-G6, yang berasal dari embrio generasi ke-6, pendarfluor telomere pada kedua-dua p- dan q-telomeres dipertahankan atau meningkat selama PD yang berbeza dianalisis (Gambar. 2 A). Dalam sel KO9-G6, p- dan q-telomeres dikekalkan pada panjang purata 10.8 dan 24.8 kb, masing-masing, dan dalam sel KO11-G6 pada panjang purata 16.3 dan 25.7 kb. Pemerhatian ini menunjukkan mekanisme bebas telomerase untuk pemeliharaan telomer di sel abadi yang berasal dari MTER generasi ke-6 - / - MEF.

    Imej IKAN perwakilan metafasa merebak dari garis sel wt dan mTER −/− pada laluan awal dan lewat ditunjukkan dalam Rajah 3. Seperti yang diterangkan sebelum ini untuk budaya MEF abadi (Zindy et al., 1997), kebanyakan garisan sel yang dikaji di sini adalah aneuploid pada laluan lewat (Rajah 3, A, C, dan D). Rajah 3 A menunjukkan dua metafasa sel Wt14 sebelumnya, PD 2, dan setelah diabadikan, PD 243. Pada PD 243, semua hujung kromosom mempunyai pengulangan TTAGGG dan sel tidak menunjukkan peningkatan peleburan ujung ke hujung kecuali kromosom yang sangat panjang yang bersifat klonal (ditunjukkan oleh anak panah dalam Rajah 3 A). Metafasa garis sel KO16-G1 dan KO7-G4 mTER - / - (Gambar 3, B dan C, masing-masing) menunjukkan penurunan pendarfluor telomere ketika PD awal dan akhir dibandingkan. Sebaliknya, sel KO9-G6 menunjukkan isyarat pendarfluor telomere yang serupa pada awal, PD 2, dan akhir, PD 88, PD, sesuai dengan pemerhatian bahawa panjang telomere rata-rata dipertahankan dalam sel-sel ini (Gbr. 3 D, lihat di atas). Akhirnya, semua garis sel mTER - / - mengandungi banyak kromosom yang tidak mempunyai isyarat telomere yang dapat dikesan pada PD akhir, dan juga peningkatan peleburan ujung ke hujung yang ketara (Gambar 3 anak panah lihat di bawah).

    Kami juga telah mengkaji pendarfluor telomere kromosom 2 dan 11 sebagai fungsi dari jumlah penggandaan sel yang terkumpul (Rajah 2, B dan C). Ketika pendarfluor telomere kedua kromosom 2 dan 11 diukur dalam garis sel Wt14, kami melihat penurunan sedikit dengan peningkatan PD, (Gambar 2, B dan C). Kadar purata pemendekan telomere yang dikira untuk kromosom 2 dan 11 dalam sel Wt14 ialah 10 dan 11 bp setiap PD. Menariknya, ketika kita mengkaji dinamika telomere kromosom 2 dan 11 pada generasi yang berbeza dari garis sel mTER - / -, kita tidak dapat mengesan pola ramalan pemendekan telomere dengan peningkatan PD (Gambar 2, B dan C). Panjang p- dan q-telomeres pada kromosom 2 dan 11 dengan peningkatan PD mencadangkan pengaktifan mekanisme penyelenggaraan telomere pada titik yang berbeza semasa pertumbuhan garisan sel. Dalam hal ini, adalah menarik untuk diperhatikan bahawa dalam sel KO16-G1, 11q-telomer tidak memendek dari PD 19 ke PD 81 atau dari PD 215 ke PD 322. Walau bagaimanapun, 11p-telomeres terus memendek menjadi panjang rata-rata hanya 5.6 kb pada PD 215 dan kemudian stabil. Penglibatan telomere 11p dalam ketidakstabilan kromosom garis sel ini akan dibincangkan kemudian dalam makalah ini. Penyelenggaraan panjang telomere amat jelas dalam PD kumulatif bagi dua garisan sel yang diperoleh daripada embrio mTER −/− generasi ke-6 (Rajah 2, B dan C). Menariknya, dalam sel-sel ini telomeres dari kromosom yang berlainan dikekalkan pada panjang yang berbeza dan, secara umum, telomer kromosom 2 stabil pada panjang yang lebih pendek daripada telomer kromosom 11 (Gambar 2, B dan C).

    Rajah 2 D menunjukkan taburan nilai intensiti pendarfluor untuk telomer 2q, 2p, 11q, dan 11p dengan peningkatan PD dalam wt (Wt14) dan dalam garis sel mTER - / - dari yang pertama (KO16-G1) dan dari ke-6 ( generasi KO9-G6 dan KO11-G6). Pendarfluor telomere dalam sel berat pada telomer 2p, 2q, 11p, dan 11q dengan peningkatan PD kekal sama, selaras dengan fakta bahawa, secara keseluruhan, telomer dikekalkan dalam barisan sel ini. Sebaliknya, bilangan telomer dengan nilai pendarfluor rendah (0-10 TFU) meningkat dengan bilangan laluan di garis sel mTER - / -. Menariknya, dalam garis sel mTER - / heterogenitas dalam nilai intensiti pendarfluor meningkat dengan peningkatan PD untuk beberapa telomer (iaitu, 11q telomer di garis sel KO9-G6), sekali lagi menunjukkan adanya mekanisme penyelenggaraan telomere alternatif dalam sel-sel ini.

    Analisis Gabungan Hujung-ke-Hujung

    Untuk menganalisis sifat gabungan kromosom yang dipromosikan oleh ketiadaan telomerase, kami melakukan FISH pada metafasa wt dan mTER -/- menggunakan probe telomerik dan centromeric, serta probe lukisan kromosom 2 dan 11 (Bahan dan Kaedah). Rajah 4 menunjukkan gambar rajah gabungan yang berlainan dalam kajian ini berserta gambar perwakilan. Gabungan hujung-ke-hujung dikelaskan kepada jenis yang berbeza mengikut strukturnya seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4. Jenis I, II, dan III melibatkan gabungan senjata p-to-p. Gabungan Jenis I mengandungi pengulangan telomerik pada titik peleburan (Gambar 4 a) dan dua salinan urutan ulangan sentromer satelit kecil (b). Peleburan Jenis II tidak mengandungi urutan telomerik yang dapat dikesan pada titik peleburan (Gambar 4 a) dan menghasilkan dua isyarat sentromer (b). Peleburan Jenis III kekurangan isyarat telomerik pada titik peleburan (Gamb. 4 a) dan hanya mempunyai satu isyarat sentromer (b). Jenis fusi IV dan V melibatkan peleburan lengan q-ke-q, dan mempunyai atau tidak mempunyai isyarat telomerik yang dapat dikesan pada titik peleburan, masing-masing. Akhirnya, jenis VI melibatkan peleburan lengan p-ke-q. Dalam sesetengah kes, kami melakukan pengecatan kromosom untuk menentukan sama ada gabungan itu homolog (contohnya, kromosom 2-ke-kromosom 2 dalam panel c gabungan jenis II) atau tidak homolog (contohnya, kromosom 11 kepada kromosom yang tidak ditentukan dalam panel c jenis VI gabungan).

    Ketidakstabilan Kromosom dalam mTER Utama − /− Sel

    Tidak ada fusi yang dikesan dalam metafasa yang dianalisis dari sel-sel primer saluran awal (Jadual I). Dalam kes sel primer mTER -, frekuensi peleburan meningkat dengan ketara dari 0,07 peleburan per metafasa dalam sel mTER - / - dari generasi 1 (KO19-G1) hingga rata-rata 1.04 peleburan (berkisar antara 0.5 hingga 1.72) setiap metafasa dalam tujuh sel mTER - / - yang diturunkan secara bebas dari embrio generasi ke-6 (KO9-G6, KO11-G6, dan KO1-G6 hingga KO5-G6 Jadual I). Menariknya, analisis sitogenetik sel yang diperoleh daripada tujuh embrio generasi ke-6 bebas mendedahkan bahawa purata 41% daripada gabungan adalah gabungan jenis II. Lukisan kromosom menunjukkan bahawa 70% peleburan jenis II ini adalah peleburan homolog yang melibatkan 2p (peleburan 2p-ke-2p lihat Rajah 4 misalnya) dan hanya 2% yang melibatkan kromosom 11. Peningkatan dramatis kromosom 2 tetapi bukan kromosom 11p-arm peleburan dalam sel mTER - / - generasi ke-6, mungkin akibat pemendekan 2p-telomer dari 26.0 ± 2.8 kb dalam sel wt, kepada purata 7 kb, lebih pendek daripada purata semua telomer dalam sel dari generasi ke-6. Dalam hal ini, dalam sel generasi ke-6 yang diperoleh daripada embrio KO9-G6, 2p-telomeres hanya dianggarkan 0.15 kb panjang dan 100% daripada gabungan jenis II adalah gabungan 2p-ke-2p. Sifat homolog gabungan ini menunjukkan bahawa ia berkemungkinan disebabkan oleh kegagalan memisahkan kromatid kakak semasa mitosis (lihat model dalam Rajah 5). Menariknya, gabungan yang melibatkan kromosom 2 dikekalkan secara stabil dalam dua garisan sel G6 berbeza yang dikaji, KO9-G6 dan KO11-G6, sekurang-kurangnya untuk >80 PD (Jadual II, lihat Perbincangan). Gabungan lain yang terdapat dalam sel KO9-G6 primer termasuk gabungan jenis I (35%), dan kurang kerap, gabungan jenis III (8%) dan jenis V (18.4%) (lihat Rajah 4 untuk contoh dan Jadual I untuk data). Diambil bersama, kromosom 2 nampaknya lebih kerap terlibat dalam gabungan kromosom daripada kromosom lain dalam mTER -/- MEFs, walaupun kita tidak boleh menolak bahawa kromosom lain kadang-kadang mungkin terlibat dalam gabungan dalam sel mTER -/- (Lee et al. ., 1998).

    Ketidakstabilan kromosom dalam talian MTER - / - Sel

    Untuk mengkaji akibat percambahan berterusan tanpa adanya aktiviti telomerase terhadap kestabilan kromosom, kami juga menganalisis penyimpangan kromosom pada garis sel wt dan mTER - / - sebagai fungsi dari jumlah PD yang terkumpul (Jadual II). Garis sel wt, Wt14, tidak menunjukkan sebarang gabungan kromosom hujung ke hujung dalam 20 PD pertama, kecuali kromosom yang sangat panjang yang bersifat klonal. Kami menentukan bahawa kromosom panjang ini adalah hasil dari translokasi terminal antara kromosom 11 dan kromosom lain (lihat kepala panah pada Gambar. 3 A), dan disebarkan secara stabil ke seluruh PD yang dianalisis. Pada bahagian kemudian dari garis sel Wt14 (PD 350), peratusan peleburan p-arm yang rendah, 0.2 per metafase, juga dikesan. Peleburan ini boleh menjadi akibat pemendekan telomere sederhana yang dikesan dalam sel-sel ini (lihat di atas).

    Peningkatan dramatis dalam peleburan ujung ke ujung diperhatikan dengan peningkatan PD di semua garis sel mTER - / - yang dikaji (lihat juga Rajah 3, B-D untuk contoh metafasa). Ketidakstabilan kromosom ini semakin meningkat dengan bilangan penjanaan (Jadual II). Kekerapan tinggi gabungan p-arm (89%) berbanding gabungan q-arm (11%) dalam garisan sel mungkin disebabkan oleh fakta bahawa p-telomeres tetikus lebih pendek daripada q-telomeres. Manakala gabungan I dan jenis II adalah gabungan yang paling biasa pada sel primer (Jadual I), gabungan jenis III (dengan hanya satu pasang isyarat sentromer) adalah gabungan yang paling banyak pada garis sel (65% lihat juga Jadual II). Menariknya, 80% daripada gabungan jenis II yang dikesan dalam dua garisan sel G6 yang berbeza, KO9-G6 dan KO11-G6 melibatkan kromosom 2, selaras dengan pemerhatian bahawa telomer kromosom 2 adalah lebih pendek daripada purata semua telomer dalam generasi ke-6. MEF dan / atau terdapat peningkatan kestabilan peleburan yang melibatkan kromosom 2 berbanding pelakuran yang melibatkan kromosom lain. Dengan lukisan kromosom, kami menentukan bahawa gabungan jenis III hadir dalam garisan sel mTER −/−, biasanya melibatkan kromosom bukan homolog. Menariknya, 20% peleburan ini melibatkan kromosom 11p yang menyatu dengan kromosom lain. Dalam barisan sel KO16-G1 PD 81, & gt75% dari semua peleburan jenis III melibatkan kromosom 11, sesuai dengan fakta bahawa 11p-telomeres pendek pada garis sel tertentu ini (contohnya, Gambar. 2 A dan 4). Fusi jenis VI, yang digambarkan sebagai cincin kromosom, juga terdapat dalam garis sel mTER - / - (untuk contoh lihat Gambar 4, B1 dan B2). Penyusunan semula kromosom lain muncul pada laluan lewat dalam sel mTER −/−. Sebagai contoh, dalam kes sel KO16-G1 (PD 215), penyusunan semula ini termasuk translokasi timbal balik dan terminal yang melibatkan kromosom 2 atau 11. Kekerapan pertukaran kromosom tersebut masing-masing ialah 0.06 dan 0.1 setiap metafasa (tidak ditunjukkan).

    Gabungan antara kromosom bukan homolog boleh berpunca daripada kewujudan serentak dua kromosom berbeza dengan telomer yang sangat pendek. Untuk menganggarkan panjang minimum telomer yang mencetuskan gabungan kromosom, kami telah mengira purata panjang telomere bagi ulangan telomer intrachromosomal dalam semua gabungan yang melibatkan lengan-p satu kromosom dan lengan-q bagi kromosom yang berbeza (gabungan Jenis VI lihat Rajah 4) dan dalam translokasi terminal yang dikesan pada PD 215 dan pada PD 322 barisan sel KO16-G1 (Penyatuan Jenis I dikecualikan daripada analisis). Purata panjang ulangan telomere intrachromosomal (tidak mengambil kira gabungan jenis I) ialah 2.3 kb (julat antara 0.1 dan 5.7 kb), menunjukkan bahawa panjang ini tidak mencukupi untuk menghalang gabungan kromosom dalam sel tikus. Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa gabungan hujung ke hujung dan penyimpangan kromosom lain yang dikesan dalam garisan sel mTER -/− adalah hasil daripada pemendekan telomere kepada panjang kritikal, dan kromosom 2 dan 11 biasanya terlibat dalam gabungan ini.


    Genom Manusia

    Julia E. Richards, R. Scott Hawley, dalam The Human Genome (Edisi Ketiga), 2011

    Bagaimana Gen diagihkan?

    Jika kita melihat taburan gen di sepanjang kromosom, kita dapati nisbah gen setiap saiz kromosom adalah tidak sama. Kami juga mendapati bahawa bahagian mRNA ke RNA bukan pengekodan tidak sama dari satu kromosom ke kromosom yang lain. Sekiranya kita melihat taburan gen di sepanjang kromosom 1 kita melihat bahawa gen juga tidak sama diagihkan dalam kromosom. Sebagai contoh, kromosom 11, yang merupakan kromosom kesebelas terbesar, mempunyai bilangan gen keenam terbesar dalam genom manusia (Gambar 12.7). Lebih-lebih lagi untuk kromosom tertentu, kita melihat bahawa sesetengah kawasan kaya dengan gen dan yang lain secara relatifnya miskin gen (Rajah 12.8).

    Rajah 12.7. Bilangan gen yang ditranskripsikan setiap kromosom manusia, termasuk gen pengekodan dan bukan kod.

    Rajah 12.8 . Gen tidak dibahagikan sama rata sepanjang kromosom.

    Kita juga dapat melihat bahawa kedua-dua helai setiap kromosom akhirnya mempunyai banyak gen berbeza yang ditranskripsikan. Untuk satu gen yang kami pilih, satu helai digunakan sebagai helai templat untuk membuat RNA, tetapi untuk gen jiran, helai lain mungkin digunakan sebagai templat. Oleh kerana kekutuban kedua-dua helai (ia menghala ke arah yang bertentangan), gen yang dibaca dari satu helai dibaca dalam arah yang bertentangan daripada gen dibaca dari helai yang lain. Oleh itu, kawasan kromosom yang mengandungi enam gen mungkin menunjukkan corak transkripsi yang serupa dengan yang ditunjukkan dalam Rajah 12.9.

    Rajah 12.9. Transkripsi beberapa gen dari satu kawasan kromosom. Anak panah menandakan gen, dengan gen 1, 3, 4, dan 6 semuanya disalin dari satu untaian DNA menuju ke satu arah, dan gen 2 dan 5 disalin dari untaian DNA yang lain menuju ke arah yang lain. Perhatikan bahawa sesetengah gen lebih panjang daripada yang lain dan jumlah ruang antara gen tidak selalu sama.

    Kadang-kadang keadaan boleh menjadi lebih rumit. Ambil kes yang sangat besar NF1 gen yang bertanggungjawab untuk penyakit yang disebut neurofibromatosis. Gen NF1 meliputi kira-kira 350,000 pasangan asas pada kromosom 17. Ia mempunyai 59 ekson yang menjadi sebahagian daripada mRNA 13,000 asas yang dihasilkan oleh gen. Di salah satu intron, jika kita melihat helai yang berlawanan, kita dapati tiga gen kecil, OMGP, EVI2B, dan EVI2A, yang menghasilkan protein yang tidak terlibat dalam menyebabkan neurofibromatosis. Dengan kata lain, sebilangan gen terletak dalam intron gen lain!


    Bahan dan kaedah

    Pengekstrakan nukleus dan penyediaan sampel 4C

    Anak benih daripada Arabidopis thaliana (L.) Heynh, aksesi Columbia (Col-0), ditanam selama 14 hari pada plat MS (4.3 g / l Murashige dan garam Skoog (Carolina Biological Supply Company, Burlington, North Carolina, USA), 10 g / l sukrosa (Applichem GmbH, Darmstadt, Jerman), 7 g / l PHYTAGAR (Life Technologies Europe, Zug, Switzerland), pH5.6). Tisu udara anak benih dikumpulkan (kira-kira 10 g setiap sampel), dan diedarkan secara merata antara empat tiub 50 ml berbentuk kerucut. Di bawah vakum, anak benih diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dalam 15 ml penyangga pengasingan nukleus yang baru disiapkan (NIB: 20 ​​mmol / l Hepes (pH8), 250 mmol / l sukrosa, 1 mmol / l MgCl2, 5 mmol / l KCl, 40% (v / v) gliserol, 0.25% (v / v) Triton X-100, 0.1 mmol / l phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 0.1% (v / v) 2-mercaptoethanol) dan 15 ml larutan formaldehid 4%, kemudian 1,9 ml 2 mol / l glisin ditambahkan untuk memadamkan formaldehid, dan campuran diinkubasi selama 5 minit lagi dalam keadaan vakum. Anak benih dibekukan dalam nitrogen cair, dan digiling ke serbuk halus. Serbuk dari dua tabung awal dikumpulkan dan digantung dalam 10 ml NIB, dengan penambahan protease inhibitor (Complete Protease Inhibitor Tablets Roche, Basel, Switzerland dua tablet dalam 150 ml NIB). Suspensi ditapis dua kali melalui Miracloth (Calbiochem / EMD Milipore, Darmstadt, Jerman) dengan menambah 10 ml NIB tambahan. Suspensi inti yang ditapis diputar selama 15 minit pada suhu 4 ° C dan 3000 ×g. Supernatan dibuang, dan pelet disusukan kembali dalam 4 ml NIB dan dipindahkan ke dua tabung reaksi 1.5 ml.Selepas tiub dipusing selama 5 minit pada suhu 4°C dan 1900×g, supernatan dikeluarkan, dan pelet digantung semula dalam 1 ml NIB, diikuti dengan sentrifugasi di bawah keadaan di atas. Langkah ini diulang dua kali. Kemudian, nukleus telah dibasuh dua kali dengan 1.2 × NEB buffer 4 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) (10 × NEB buffer 4: 50 mmol/l kalium asetat, 20 mmol/l Tris asetat, 10 mmol/l magnesium asetat, 1 mmol/l dithiothreitol (DTT)), menggunakan keadaan sentrifugasi yang diterangkan di atas. Nukleus akhirnya digantung semula dalam 500 ml 1.2 × NEB penimbal 4, dengan 5 μl 20% SDS ditambah. Sampel diinkubasi selama 40 minit pada suhu 65°C, diikuti dengan 20 minit pada suhu 37°C di bawah goncangan berterusan, kemudian 50 μl 20% Triton X-100 ditambah. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C di bawah goncangan berterusan, kemudian 60 μl sampel dikeluarkan sebagai kawalan pra-pencernaan.

    Untuk pencernaan 15 μl 10 × NEB penimbal 4 dan 115 μl H20 telah ditambah kepada sampel, dan pencernaan dimulakan menggunakan 100 U daripada HindEnzim sekatan III (New England Biolabs). Selepas 3 jam pengeraman pada 37°C, 200 U daripada HindIII ditambah, diikuti dengan pengeraman semalaman pada 37°C. Pagi berikutnya 100 U daripada HindIII telah ditambah, dan sampel diinkubasi selama 2 jam terakhir. Aliquot (80 μl) sampel dipindahkan ke tiub segar, dan diketepikan sebagai kawalan selepas penghadaman. Untuk menyahaktifkan HindIII, 20 μl 20% SDS ditambah, dan sampel diinkubasi pada suhu 65°C selama 25 minit di bawah goncangan berterusan. Sampel telah dipindahkan ke 15 ml tiub kon, dan 700 μl 10 × penampan ligation (0.5 mol/l Tris-Cl, 0.1 mol/l MgCl2, 0.1 mol/l DTT, pH 7.5), 375 μl 20% Triton X-100 dan H2O kepada isipadu akhir 7 ml telah ditambah, diikuti dengan 1 jam pengeraman pada 37°C di bawah goncangan berterusan.

    Ligasi dilakukan dengan menambah 70 μl 100 mmol/l ATP (Roche) dan 50 Unit Weiss (WU) DNA Ligase (Fermentas/ThermoFisher, Waltham, Amerika Syarikat). Sampel diinkubasi selama 5 jam pada suhu 16°C. Semasa pengeraman, tambahan 10 WU DNA ligase telah ditambah. Selepas ligation, 30 μl 10 mg / ml proteinase K (Qbiogene MP Biomedicals, Santa Ana, CA, Amerika Syarikat) telah ditambah, dan sampel diinkubasi semalaman pada 65 ° C. Pagi berikutnya, 30 μl 10 mg/ml RNase A (Roche) telah ditambah, dan sampel diinkubasi selama 30 minit pada suhu 37°C.

    DNA telah ditulenkan oleh dua kloroform: pengekstrakan fenol, diikuti oleh pemendakan etanol menggunakan 1 ml 3 mol/l natrium asetat, 7 ml H2O dan 25 μl glikogen, diambil sehingga isipadu akhir 50 ml dengan etanol sejuk ais. Campuran disimpan semalaman pada suhu -80°C. Pelet akhirnya digantung semula dalam 150 μl H2O.

    Kawalan pra-pencernaan, kawalan selepas penghadaman, dan sampel 3C akhir (120 ng DNA setiap satu) dianalisis pada 1.5% gel agarose. Sampel dengan penghadaman yang memuaskan kemudian dikumpulkan untuk meneruskan.

    Sampel 3C telah dicerna dengan kuantiti akhir 0.2 U/μl enzim sekatan sekunder DpnII atau NlaIII, masing-masing (New England Biolabs). Sampel tercerna 4C dianalisis pada gel agarose. Untuk ligation 4C, 700 μl T4 Ligase Buffer (Fermentas/ThermoFisher), 70 μl 100 mmol/l ATP, dan 50 WU DNA Ligase (Fermentas/ThermoFisher), telah diambil sehingga 7 ml dengan H2O campuran ini telah ditambah kepada sampel, dan tindak balas pengikatan diinkubasi selama 5 jam pada suhu 16°C. Akhirnya, sampel telah disucikan oleh fenol: pengekstrakan kloroform, diikuti oleh pemendakan etanol, dan disimpan pada -20°C.

    Untuk setiap sudut pandangan, 16 PCR (untuk keadaan PCR terperinci dan urutan primer, lihat Fail tambahan 17: Jadual S1) telah disediakan, menggunakan 30 ng templat 4C untuk setiap tindak balas. Untuk memudahkan penyediaan perpustakaan Illumina kemudiannya, primer subset sampel telah direka bentuk dengan ekor penyesuai jujukan Illumina (kelompok 1: MEA F6, MEA F8, PHE, FIS2, CKI1, FWA, AG, FLC). Untuk semua sampel lain (kelompok 2: AT1G51860, AT3G44380, SWN, hk4s, YAO), Penyesuai penjujukan Illumina telah diikat kemudian dalam proses penyediaan perpustakaan.

    Aliquot setiap produk PCR dianalisis pada gel agarose, dan produk PCR yang selebihnya telah disucikan menggunakan Kit Pemurnian PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Belanda), mengikut protokol pengeluar.

    Persediaan perpustakaan

    Selepas ini, penyediaan perpustakaan diterangkan untuk sampel yang tidak mempunyai penyesuai Illumina (Illumina, San Diego, CA, Amerika Syarikat) yang dilampirkan pada primer 4C. Sampel setiap replika dikumpulkan dalam jumlah ekuimolar, dan dinilai pada Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA USA). Akhirnya, setiap volum sampel diselaraskan kepada 100 μl menggunakan H2O. Replika kemudiannya dipecahkan kepada dua aliquot sebanyak 50 μl setiap satu, dan 10 μl Penampan Resuspensi (RSB Illumina) dan 40 μl Campuran Pembaikan Akhir (ERP) (Illumina) telah ditambah. Campuran diinkubasi selama 30 minit pada suhu 30°C. Kemudian, 100 μl manik Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ditambah, dan campuran itu diinkubasi selama 15 minit pada suhu bilik. Tiub tindak balas kemudiannya diletakkan pada dirian magnet. Supernatan dikeluarkan tanpa mengganggu manik, dan 400 μl etanol 80% yang baru disediakan telah ditambah. Selepas 30 saat, etanol digantikan dengan 400 μl lagi etanol 80%. Supernatan dikeluarkan, dan tiub dibiarkan terbuka hingga kering. Manik-manik yang mengikat produk PCR 4C telah digantung semula dalam 17.5 μl RSB, dan diinkubasi selama 2 minit sebelum diletakkan pada dirian magnet selama 15 minit. Akhirnya, 15 μl sampel dipindahkan ke tiub tindak balas 0.2 ml yang baru. Untuk setiap sampel, 2.5 μl RSB dan 12.5 μl A-tailing Mix (ATL) (Illumina) ditambah dan dicampur dengan teliti, diikuti dengan pengeraman pada 37°C selama 30 minit. Berikutan itu, 2.5 μl RSB, 2.5 μl DNA Ligase Mix (LIG) (Illumina) dan 2.5 μl penyesuai DNA diindeks (Illumina) telah ditambah, dan dicampur perlahan-lahan dengan mepipet campuran ke atas dan ke bawah. Selepas itu, campuran itu diinkubasi selama 10 minit pada suhu 30°C. Untuk menyahaktifkan tindak balas 5 μl Stop Ligase Mix (STL) (Illumina) telah ditambah, dan sampel dipindahkan ke tiub tindak balas 1.5 ml yang baru. Kemudian 42.5 μl manik Agencourt AMPure (Beckman Coulter) dimasukkan ke dalam setiap tiub, dan campuran itu diinkubasi selama 15 minit pada suhu bilik. Tiub tersebut kemudiannya diletakkan pada dirian magnet selama 2 minit, kemudian 80 μl supernatan dikeluarkan dan digantikan dengan 200 μl etanol 80% yang baru disediakan. Selepas pengeraman selama 30 saat, supernatan dikeluarkan, dan tiub dibiarkan terbuka untuk kering. Langkah mencuci etanol sebelumnya yang diterangkan di atas diulang sekali, kemudian, pelet digantung semula dalam 52.5 μl RSB. Selepas 2 minit pengeraman pada suhu bilik, tiub diletakkan pada dirian magnet selama 2 minit, kemudian 50 μl supernatan dipindahkan ke tiub tindak balas 1.5 ml yang baru. Pembersihan Agencourt AMPure (Beckman Coulter) diulang sekali namun, pada langkah terakhir, bukannya digantung dalam 52.5 μl RSB, pelet itu digantung semula dalam 22.5 μl RSB, di mana 20 μl dipindahkan ke tiub tindak balas 0.2 ml yang baru. Sampel dengan penyesuai yang telah dipasang pada primer PCR 4C telah dirawat dengan cara yang sama dari masa ini. Untuk melakukan penguatan perpustakaan akhir, 5 μl PCR Primer Cocktail (PPC) dan 25 μl PCR Master Mix (PMM) (kedua-dua Illumina) telah ditambah pada setiap tiub. PCR dilakukan di bawah keadaan berikut: 98°C selama 30 saat kemudian 12 kitaran 98°C selama 10 saat, 60°C selama 30 saat, dan 72°C selama 30 saat diikuti dengan pemanjangan terakhir pada 72°C selama 5 minit. Sampel kemudian dipindahkan ke tiub tindak balas 1.5 ml, dan 50 ml manik Agencourt AMPure (Beckman Coulter) telah ditambah. Selepas 15 minit pengeraman pada suhu bilik, tiub diletakkan pada dirian magnet selama 2 minit. Selepas ini, 95 μl supernatan telah dikeluarkan, dan manik telah dibasuh dua kali dengan 200 μl etanol 80% yang baru disediakan. Selepas supernatan dikeluarkan, tiub dibiarkan terbuka untuk kering. Pelet kemudiannya digantung semula dalam 32.5 μl RSB dan diinkubasi selama 2 minit pada suhu bilik. Tiub diletakkan pada pendirian magnet, dan 30 μl perpustakaan yang telah disucikan dipindahkan ke tiub tindak balas 1.5 ml yang baru. Daripada setiap perpustakaan stok 10 nmol/l dalam Tris-Cl (pH 8.5) dengan 0.1% (v/v) Tween 20 telah disediakan. Semua replika dalam perpustakaan kemudiannya dikumpulkan, dan digunakan untuk penjujukan hujung tunggal Illumina HiSeq 100 bp. Untuk setiap kumpulan replika, satu lorong setiap replika telah dimuatkan (jumlah empat lorong). Batch 1 replika A mempunyai jumlah hasil sebanyak 92,063,669 bacaan mentah, dengan min skor kualiti 35.35. Kumpulan 1 replika B mempunyai jumlah hasil sebanyak 80,777,012 bacaan mentah dengan min skor kualiti 35.31 kelompok 2 replika A mempunyai jumlah hasil sebanyak 43,296,252 bacaan mentah dengan min skor kualiti 36.85 dan kumpulan 2 replika 59,6 replika B mentah sebanyak 59,6 replika B dibaca dengan min skor kualiti 36.76.

    Pra-pemprosesan data penjujukan 4C

    Dua fail fastq (satu setiap replika) dibahagikan kepada sudut pandangan berasingan mengikut urutan primer 4C dan HindIII corak sekatan dalam bacaan. Tiada ketidakpadanan dibenarkan dan baki bacaan telah dibuang. Selepas penyingkiran urutan tapak primer dan sekatan, bacaan dipotong kepada 30 bp dan diselaraskan dengan Arabidopsis genom rujukan [48] menggunakan bowtie (versi 0.12.7) [49] dengan argumen baris arahan -a -v 0 -m 25. Untuk statistik penjajaran, lihat Fail tambahan 17: Jadual S2.

    Bacaan dengan pelbagai penjajaran telah diproses seperti yang diterangkan sebelum ini [50]. Oleh kerana kami menganggarkan panjang unit interaksi tunggal sebagai 100 kb, kami menggunakan jarak peruntukan ±50 kb. Untuk menentukan serpihan 4C yang berpotensi, kami menghasilkan satu dalam silico HindIII penghadaman daripada Arabidopsis Genom Col-0. Bacaan pemetaan ke hujung serpihan yang terhasil telah dipertimbangkan untuk analisis selanjutnya. Untuk ukuran interaksi yang lebih mantap, serpihan kemudiannya digunakan untuk menjana tingkap yang merangkumi kawasan genom yang lebih besar (iaitu, 100 serpihan, bersamaan dengan 180 kb secara purata). Semasa proses ini, serpihan yang lebih dekat daripada 1 kb ke sudut pandangan telah dibuang, memandangkan sebahagian besar bacaannya mungkin berpunca daripada penghadaman yang tidak lengkap dan/atau pekeliling sendiri. Tambahan pula, kami membuang semua serpihan yang lebih dekat daripada 100 kb kepada sentromer, kerana kualiti penjajaran kepada sentromer adalah rendah. Akhir sekali, serpihan yang jaraknya dari tapak sekatan utama ke tapak sekatan sekunder yang pertama berlaku ialah 1000 bp atau lebih berkenaan dengan kedua-dua hujung serpihan juga telah dialih keluar. Sebagai ukuran interaksi tetingkap tertentu (nilai interaksi), kiraan serpihan telah diubah log untuk mengelakkan kesan tinggi serpihan terpencil, dan kemudian dijumlahkan. Bergantung pada analisis hiliran, tetingkap merentangi sama ada 100 serpihan daripada setiap serpihan pada (bertindih) atau 25 serpihan bermula dari setiap serpihan ke-25 (tidak bertindih).

    Fail data 4C yang diproses (dipisahkan mengikut urutan primer) dan fail penjujukan data mentah tersedia secara umum pada Gene Expression Omnibus (GEO), nombor akses GSE50181.

    Pemprosesan data pengubahsuaian histon, transkripsi, metilasi DNA, dan penjujukan genomik

    Untuk menambah maklumat tambahan, seperti corak pengubahsuaian histon dan kadar transkripsi, kami memperoleh data yang tersedia secara terbuka daripada GEO [51], khususnya data penjujukan ChIP (ChIP-seq) GSM701923, GSM701924, GSM701925, GSM701926, GSM701926, GSM701927, GSM7019, GSM701927, GSM701927, GSM701927, GSM701927, GSM701927, GSM701924 GSM701931 [30] dan data RNA-seq GSM701934 [30]. Data metilasi DNA pra-diproses diperoleh daripada [32].

    Bacaan ChIP-seq dan RNA (RNA-seq) (jujukan SOLiD, 50 bp (Applied Biosystems/Life Technologies) telah diselaraskan dengan Arabidopsis genom rujukan (Col-0, TAIR10 [52]) menggunakan bowtie (versi 0.12.7) dengan hujah baris arahan berikut: –a –v 2 –m 25. Bacaan dengan berbilang penjajaran telah diproses seperti yang diterangkan sebelum ini [50]. Jarak peruntukan ditetapkan kepada ± 5 kb dan ± 50 bp untuk data ChIP-seq dan RNA-seq, masing-masing. Ketumpatan pengubahsuaian histon dan ketumpatan metilasi DNA dikira dengan jumlah nukleotida yang diliputi oleh sekurang-kurangnya satu jujukan pendek yang boleh diselaraskan secara unik, dibahagikan dengan jumlah bilangan nukleotida untuk setiap serpihan sekatan 4C individu.

    Untuk menganggarkan potensi bias yang berkaitan dengan komposisi jujukan (seperti jujukan berulang), kami memperoleh data penjujukan DNA genomik (Illumina, 100 bp) set data GSM567816, dan memprosesnya secara identik dengan data penjujukan 4C.

    Menugaskan P-nilai kepada tingkap individu

    Untuk menganggarkan kepentingan interaksi, kami mengira untuk setiap tetingkap kebarangkalian (iaitu, P-nilai) untuk melihat nilai interaksinya secara kebetulan. Memandangkan interaksi dua serpihan akan membawa kepada kiraan bacaan yang lebih tinggi dalam serpihan jiran juga (oleh itu dalam tetingkap), shuffling rawak kedudukan serpihan dan pengiraan semula nilai interaksi tetingkap menyediakan data interaksi rawak dengan nilai mengikut taburan normal. Menggunakan parameter taburan ini, permulaan P-nilai kemudiannya dikira untuk setiap tetingkap. Kami mengulangi proses ini 1,000 kali, dan purata untuk setiap tetingkap P-nilai daripada semua ulangan individu untuk mendapatkan final P-nilai. Untuk mengambil kira perbezaan antara lengan kromosom (contohnya, jumlah DNA yang berbeza antara lengan pendek dan lengan panjang kromosom 2), P-nilai dikira untuk setiap lengan kromosom secara berasingan.

    P-ambang nilai dipilih untuk memenuhi keperluan sama ada plot atau analisis data. Secara amnya, kami menetapkan ambang untuk kawasan mangsa kepada 10 -3 . Dalam plot Circos Rajah 5A yang kami pilih P ≤ 10 -4 untuk keterlihatan yang lebih baik. Kerana untuk pelbagai sudut pandangan, ambang 10 -3 tidak menghasilkan bilangan kawasan mangsa yang mencukupi untuk analisis data yang mantap, kami memilih ambang P ≤ 0.05 untuk melaksanakan PCA.

    Pereputan jarak

    Kami menganggarkan pereputan bergantung jarak genom kebarangkalian interaksi pada jarak 1 kb hingga 10 Mb dari sudut pandangan. Regangan ini telah diubah suai log, dan berpecah kepada 41 selang dengan panjang 0.1 (pada skala log). Bagi setiap sampel, bacaan serpihan yang sepadan dengan selang telah disimpulkan dan diberikan kepada selang. Memandangkan sentromer bertindak sebagai sempadan interaksi, hanya serpihan pada lengan sudut pandangan dipertimbangkan. Kiraan bacaan setiap selang kemudian dibahagikan dengan jumlah bilangan bacaan merentas semua selang yang mewakili kebarangkalian sentuhan, yang merentasi jarak penuh berjumlah 1. Memandangkan beberapa selang hanya mengandungi beberapa serpihan dan, dalam kes tertentu, hanya serpihan daripada subset daripada sudut pandangan, kami menggunakan peramal pelicinan serakan berwajaran tempatan (LOESS) yang dipasang pada data asal untuk mengira satu nilai kebarangkalian sentuhan bagi setiap selang. Untuk mendapatkan cerun, dan oleh itu pekali pereputan jarak, kami kemudiannya menganggarkan data dengan model linear. Cerun dan P-nilai diperoleh daripada kesesuaian model linear kepada nilai yang diramalkan oleh kesesuaian LOESS. Walau bagaimanapun, pemasangan langsung model linear kepada data asal menghasilkan keputusan yang hampir sama dengan kecerunan -0.72 dan bukannya -0.73, dan sangat rendah. P nilai (<10 -100 ).

    Jarak sentromer

    Untuk menganalisis kesan jarak sudut pandang ke sentromer pada taburan frekuensi interaksi yang diperhatikan sepanjang lengan kromosom, kami mengira untuk setiap lengan kromosom (kecuali lengan sudut pandang) jarak ke sentromer di mana 50% daripada semua bacaan diselaraskan, dan kemudian dipasang model linear. Prosedur ini dilakukan dua kali, pertama menggunakan nilai mutlak, dan kemudian jarak relatif, ditakrifkan sebagai jarak mutlak dibahagikan dengan panjang lengan kromosom (diubah dengan mengambil arcsine punca kuasa dua).

    Analisis komponen utama

    Semua PCA adalah berdasarkan tetingkap tidak bertindih yang merangkumi 25 serpihan. Bagi setiap sudut pandangan, min mangsa dan kawalan ketumpatan histon untuk setiap pengubahsuaian histon (iaitu, EMD) telah dikira. Selepas itu, PCA telah dilakukan pada set data termasuk nilai purata EMD bagi kawasan kawalan dan mangsa bagi setiap sudut pandangan dan EMD. PCA dilakukan menggunakan fungsi R princom() terbina dalam.

    Ujian permutasi

    Untuk menganalisis perbezaan dalam landskap epigenetik mangsa dan kawasan kawalan, kami secara rawak memilih 50 mangsa dan 50 kawasan kawalan (disampel) untuk setiap sudut pandangan, dan memperoleh set ujian rawak yang sepadan dengan mengumpulkan EMD mereka dan mengubah suai mereka (mengocoknya kepada dua kumpulan rawak daripada 50 nilai setiap satu). Kami kemudian mengira perbezaan mutlak dalam purata EMD antara sampel (RealDiffij), dan diubah suai (RandDiffij) kawasan mangsa dan kawalan, masing-masing.

    Mengulangi langkah ini i kali bagi setiap satu j sudut pandangan menghasilkan taburan empirikal untuk RandDiff untuk setiap pengubahsuaian epigenetik dengan 13,000 nilai (j = 13 sudut pandangan, dan i = 1,000 ulangan). Membandingkan purata RealDiffm (min merentasi semua ulangan dan sudut pandangan) dengan pengedaran ini kemudian memberikan empirikal P-nilai (p = ∑(RandDiffij > RealDiffm)/(i*j)), yang kemudiannya diselaraskan untuk ujian berbilang pengiraan kadar penemuan palsu (FDR Benjamini-Hochberg).

    Analisis tanda epigenetik individu menggunakan analisis seperti GSEA

    Untuk menguji sama ada kawasan mangsa mempunyai landskap epigenetik yang berbeza daripada kawasan yang dipilih secara rawak merentas genom, kami membangunkan prosedur yang serupa dengan GSEA yang diterangkan sebelum ini [33]. Ia memerlukan ketumpatan EMD (contohnya, ketumpatan metilasi CG atau H3K9me2) yang diberikan kepada semua (n) kawasan dalam genom (iaitu, tingkap tidak bertindih yang merangkumi 25 serpihan sekatan), dan subset (m) kawasan sebagai set ujian (iaitu, kawasan mangsa dengan a P < 0.01 dalam kedua-dua replika). Semasa prosedur, kawasan diisih terlebih dahulu mengikut EMD mereka. Kami kemudiannya memberikan nilai -1 kepada kawasan yang bukan dalam set ujian, dan nilai (n-m)/m kepada kawasan dalam set ujian (untuk memastikan bahawa jumlah nilai ini merentas semua wilayah adalah sifar). Dalam langkah ketiga, jumlah kumulatif nilai ini dikira dan skor pengayaan (ES) ditakrifkan sebagai sisihan maksimum (mutlak) daripada sifar. Jika kawasan dalam set ujian diedarkan secara rawak merentasi senarai diisih semua wilayah, jumlah kumulatif akan turun naik sekitar sifar dengan ES yang agak kecil.Sebaliknya, pengedaran tidak rawak bagi set ujian (contohnya, pengumpulan di satu hujung senarai yang disusun) akan membawa kepada ES yang tinggi. A P-Nilai kemudian dapat diberikan dengan membandingkan ES yang diperhatikan dengan pengedaran ES yang diperoleh dengan memilih secara rawak m wilayah 10,000 kali. Untuk mendapatkannya P-nilai per ciri epigenetik, ES rata-rata di semua sudut pandangan. Memandangkan kami memfokuskan pada interaksi jarak jauh, kami mengecualikan semua interaksi dalam lengan sudut pandangan. Kerana ujian statistik untuk semua ciri epigenetik digunakan, menggunakan data 4C yang sama, P-valu disesuaikan untuk pelbagai ujian, mengira FDR (Benjamini-Hochberg).

    Memplot

    Semua plot data 4C, ciri genom, dan data pengubahsuaian histone dilakukan menggunakan plot sama ada Circos [23] atau fungsi R [53] terbina dalam. Kod tersedia atas permintaan.

    Ketersediaan data

    Semua data penjujukan dan fail 4C yang diproses tersedia pada nombor akses Gene Expression Omnibus (GEO) GSE50181.


    Tonton videonya: Pembuatan Kariotipe Kromosom (Februari 2023).