Maklumat

Perlu membuat perpustakaan urutan pengekodan mamalia

Perlu membuat perpustakaan urutan pengekodan mamalia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya ingin mengklon ~ 100 urutan pengekodan berbeza daripada manusia atau tetikus ke dalam vektor ekspresi untuk menganalisis fenotip dalam kultur tisu. Saya boleh melakukan semua langkah, tetapi saya tidak pasti apa yang harus saya gunakan sebagai templat untuk reaksi saya. Sebaik-baiknya, saya akan membeli sekumpulan cDNA panjang penuh dari sekumpulan organ, dan memperkuat dari itu. Kurang ideal, saya boleh menjana cDNA sendiri, daripada pelbagai organ dan mengumpulkannya. Adakah sesiapa mempunyai cadangan tentang sumber templat?


  • Sahkan di mana transkrip ini umumnya ada (ini tidak sukar bagi organisma biasa)
  • Jika semuanya dinyatakan dalam tisu tertentu gunakan cDNA daripada tisu tersebut
  • Jika tidak, kumpulkan cDNA daripada tisu yang berbeza supaya semua gen boleh diperkuatkan
  • Perpustakaan cDNA (termasuk keseluruhan organisma) juga tersedia dan anda mungkin memperolehnya dari repositori terdekat (saya rasa NCBI juga menyediakan).

Beberapa perkara lain yang boleh anda lakukan:

  • Minta syarikat sintesis primer menyediakan set primer dalam format 96well.

  • Sintesis DNA juga merupakan pilihan yang baik (ia memerlukan $ 0.5 per pasangan asas), tetapi itu boleh menjadi mahal jika cDNA anda sangat besar.


Kromosom X dan Y babi: struktur, urutan, dan evolusi

Kami telah menghasilkan pemasangan yang lebih baik dan anotasi gen Kromosom X babi, dan pemasangan draf pertama Kromosom Y babi, dengan menjujukan BAC dan klon fosmid daripada haiwan Duroc dan menggabungkan maklumat daripada pemetaan optik dan gentian-FISH. Kromosom X membawa 1033 gen beranotasi, 690 daripadanya adalah pengekodan protein. Susunan gen berpadanan rapat dengan primata (termasuk manusia) dan karnivor (termasuk kucing dan anjing), yang disimpulkan sebagai nenek moyang. Walau bagaimanapun, beberapa gen pengekodan protein yang terdapat pada Kromosom X manusia tidak hadir daripada babi, dan 38 gen kromosom X khusus babi telah diberi penjelasan, 22 daripadanya adalah reseptor penciuman. Urutan kromosom khusus Y babi yang dihasilkan di sini terdiri daripada 30 megabase (Mb). Subset 15-Mb bagi urutan ini telah dipasang, mendedahkan dua kelompok gen nombor salinan rendah khusus lelaki, dipisahkan oleh kawasan ampliconic termasuk keluarga gen HSFY, yang bersama-sama membentuk sebahagian besar lengan pendek. Kedua-dua kelompok mengandungi palindrom dengan identiti jujukan tinggi, mungkin dikekalkan oleh penukaran gen. Sebilangan besar gen berkaitan X leluhur yang sebelumnya dilaporkan dalam sekurang-kurangnya satu Kromosom Y mamalia diwakili sama ada sebagai gen aktif atau urutan separa. Projek penjujukan ini telah membolehkan kami mengenal pasti gen--kedua-dua salinan tunggal dan diperkuatkan--pada Kromosom Y babi, untuk membandingkan Kromosom X dan Y babi untuk jujukan homolog, dan dengan itu mendedahkan mekanisme yang mendasari evolusi Kromosom X dan Y babi.

© 2016 Skinner et al. Diterbitkan oleh Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Angka

Perbandingan peta X dan Y. Kromosom X yang dijujukan daripada sembilan mamalia, ditambah dengan…

Organisasi babi ...

Organisasi babi Y Kromosom. Semua gen salinan tunggal khusus lelaki yang dikenal pasti adalah…

Homologi antara X dan…

Homologi antara X dan Y. Garis besar kawasan homologi X-Y yang dikesan antara…

Babi itu SRY wilayah. yang…

Babi itu SRY wilayah. Blok proksimal Yp gen mengandungi dua bertindih…


RNA-seq terdampar untuk sampel mamalia

RNA-seq boleh digunakan untuk memahami biologi kompleks peraturan gen dan membantu dalam memahami ekspresi gen daripada pelbagai jenis sampel yang berbeza. Dengan kit SMARTer Stranded RNA-seq, anda boleh mengakses data ekspresi gen terkandas yang berharga pada transkrip pengekodan dan bukan pengekodan daripada pelbagai sampel dan input. Teknologi SMART telah dimasukkan ke dalam beberapa kit kami untuk melakukan RNA-seq menggunakan pendekatan pemarkahan rawak. Pendekatan ini boleh membantu dalam membangunkan pemahaman yang lebih baik tentang biologi dalam beberapa aplikasi yang berbeza, termasuk:

  • Menyoal siasat urutan yang tidak poliadenilasi, seperti RNA kawal selia bukan pengekodan atau RNA terdegradasi daripada FFPE atau plasma
  • Memberi maklumat untaian untuk pengukuran RNA yang lebih tepat daripada gen yang bertindih
  • Memberi maklumat tentang variasi splice daripada gen yang berbeza-beza panjang

Perlu membuat perpustakaan urutan pengekodan mamalia - Biologi

Biologi sintetik mendapat faedah daripada standardisasi. Pembangunan bidang bergantung pada kaedah mudah, murah dan tinggi yang meningkatkan kitaran reka bentuk-bina-ujian.

Pembangunan kaedah pengklonan berdaya tinggi telah membuka jalan kepada kemunculan banyak kit alat pengklonan, menyediakan banyak bahagian piawai yang boleh dipasang dengan mudah, sekali gus mempercepatkan kejuruteraan peranti genetik yang kompleks.

Walaupun alat alat pengklonan untuk biologi sintetik mamalia kurang direpresentasikan berbanding dengan bakteria dan ragi, beberapa kini disediakan untuk masyarakat.

Pembinaan program berkod DNA adalah penting kepada biologi sintetik dan kaedah yang dipilih sering menentukan masa yang diperlukan untuk mereka bentuk dan membina binaan untuk ujian. Di sini, kami menghuraikan dan meringkaskan ciri utama kit alat yang tersedia untuk pembinaan DNA untuk sel mamalia. Kami membandingkan strategi pengklonan yang berbeza berdasarkan kerumitannya dan masa yang diperlukan untuk menghasilkan konstruk dengan ukuran yang berbeza, dan kami merenungkan mengapa toolkit Golden Gate kini mendominasi kerana reka bentuk modularnya. Kami menantikan kemajuan masa hadapan, termasuk pek aksesori untuk kit alat pengklonan yang boleh memudahkan pengeditan, ortogonal, peraturan lanjutan dan penyepaduan ke dalam pembinaan kromosom sintetik.


Intron Kumpulan I Penyambung Sendiri Merupakan Contoh Pertama RNA Bermangkin

DNA dalam protozoan Tetrahymena thermophila mengandungi intron perantara di rantau ini yang mengekod molekul pra-rRNA yang besar. Carian berhati-hati gagal untuk mendedahkan walaupun satu gen pra-rRNA tanpa urutan tambahan, menunjukkan bahawa penyambungan diperlukan untuk menghasilkan rRNA matang dalam organisma ini. Kajian selanjutnya menunjukkan bahawa pra-rRNA disambungkan di tempat yang betul ketika diinkubasi dengan sendirinya, tanpa bantuan protein apa pun, memberikan petunjuk pertama bahawa RNA dapat berfungsi sebagai pemangkin, seperti enzim.

Berikutan penemuan penyambungan diri dalam Tetrahymena pra-rRNA, keseluruhan rangkaian urutan penyambungan diri dijumpai pada pra-rRNA dari organisma sel tunggal lain, dalam pra-rRNA mitokondria dan kloroplas, dalam beberapa pra-mRNA dari tertentu E coli bacteriophages, dan dalam beberapa transkrip utama tRNA bakteria. Jujukan penyambungan diri dalam semua prekursor ini, yang dirujuk sebagai intron kumpulan I, menggunakan guanosin sebagai kofaktor dan boleh dilipat dengan berpasangan asas dalaman untuk menyandingkan dua ekson yang mesti dicantumkan. Seperti yang dibincangkan sebelumnya, pra-mRNA dan tRNA mitokondria dan kloroplas tertentu mengandungi jenis intron penyambungan diri kedua, kumpulan II yang ditetapkan. Seperti yang digambarkan dalam Rajah 11-51, mekanisme penyambungan yang digunakan oleh intron kumpulan I, intron kumpulan II, dan spliceosomes secara amnya adalah serupa, melibatkan dua transesterifikasi reaksi, yang tidak memerlukan input tenaga. Jelas sekali, dalam intron penyambung diri, RNA berfungsi sebagai ribozim, urutan RNA dengan keupayaan pemangkin.

Rajah 11-51

Mekanisme penyambungan pada kumpulan I dan kumpulan inton penyambungan diri kumpulan dan penyambungan pra-mRNA yang dikatalisis oleh spliceosome. Intron ditunjukkan dengan warna biru ekson yang akan dicantumkan dengan warna merah. Dalam intron kumpulan I, kofaktor guanosin (G) yang bukan sebahagian daripada rantai RNA (lebih banyak. )

Kumpulan I intron dalam pra-rRNA dari Tetrahymena dan organisma lain yang tertentu tidak berkaitan dengan jujukan spacer yang ditranskripsi yang memisahkan kawasan 18S, 5.8S dan 28S dalam kebanyakan organisma (lihat Rajah 11-50b). Khususnya, mekanisme penyambungan diri yang menghilangkan intron kumpulan I berbeza dengan mekanisme pemisahan yang mana urutan spacer dikeluarkan semasa pemprosesan pra-rRNA yang dibincangkan di bahagian sebelumnya. Struktur tiga dimensi kumpulan I intron daripada Tetrahymena pra-rRNA telah diselesaikan. Eksperimen mutasi dan biokimia sedang dijalankan untuk menentukan sisa yang kritikal dalam memangkinkan dua tindak balas transesterifikasi yang membawa kepada penyambungan.


Chasin

Persoalan utama yang dikemukakan di makmal kami adalah bagaimana mesin penyambungan selular mengenali ekson yang mesti disertainya semasa pematangan mRNA dari transkrip primer panjang. 3 motif jujukan yang hampir selalu dikaitkan dengan ekson -- tapak cawangan, tapak sambatan penerima hulu dan tapak sambatan penderma hiliran -- memberikan maklumat yang tidak mencukupi untuk pengecaman molekul. Ekson "pseudo" yang bersempadan dengan unsur-unsur ini melebihi bilangan ekson sebenar sekurang-kurangnya mengikut urutan magnitud namun diabaikan. Kami berusaha memberikan definisi global mengenai elemen maklumat tambahan yang berperanan dalam menentukan ekson untuk penyambungan konstitutif dan alternatif dan untuk mengetahui cara tindakan mereka. Saya banyak cara masalah maklumat ini serupa dengan di mana dan bila tapak permulaan transkripsi diiktiraf.

Kami telah menggunakan kaedah pengiraan untuk mendapatkan beberapa maklumat ini. Dengan menggunakan teknik pembelajaran mesin, kami mendapati bahawa 50 nt peregangan intronik di kedua-dua sisi ekson, melampaui urutan konsensus laman sambatan itu sendiri, mengandungi maklumat yang diperlukan untuk penyambungan cekap kebanyakan ekson manusia (14, 12). Maklumat pada peringkat ini adalah dalam bentuk 5‑mer yang diwakili secara berlebihan di wilayah ini. Kami kini ingin mengetahui sifat sebenar unsur isyarat ini (penambah penyambungan intronik, ISE), langkah dalam penyambungan di mana ia bertindak, dan protein yang menjadi pengantara kesannya.

Maklumat tambahan terdapat dalam badan ekson dalam bentuk penambah sambatan eksonik (ESE) dan peredam penyambungan eksonik (ESS). Menggunakan analisis statistik genomik, kami menyusun senarai 8-mers sebagai putative ESEs (PESEs) dan putative ESSs (PESSs) dalam setiap kelas dan menunjukkan bahawa kebanyakan motif yang diramalkan boleh berfungsi seperti yang diharapkan (13, 11, 8). Anda boleh melawati utiliti PESX dalam talian kami untuk mencari 8-mer ini dalam urutan anda sendiri dan lihat rujukan 5 untuk pendekatan pengiraan kami.

Kerja ini bersama dengan kejayaan yang serupa dari makmal lain sekarang menjelaskan bahawa ekson dan sayapnya dipenuhi dengan populasi elemen peraturan yang padat. Tugas kami kini terletak pada memikirkan bagaimana maklumat jujukan yang kaya ini disepadukan untuk membuat apa yang biasanya keputusan binari untuk disambungkan. Tetapi ketumpatan yang tinggi menjadikannya sukar untuk membuat perubahan genetik bersendirian, dan membuat tafsiran menjadi samar-samar. Untuk mengatasi masalah ini, kami beralih kepada ekson sintetik yang kami rancang untuk mengandungi modul penambah, peredam dan neutral yang terpencil (6). Kami berharap peraturan yang mengawal penyambungan akan lebih jelas dengan manipulasi tajam "exon pereka" ini.

Genomik perbandingan ialah alat lain yang kami gunakan untuk menguraikan maklumat penyambungan dan untuk melihat tekanan evolusi yang dikenakan ke atas jujukan ini. Semasa eksperimen ini, kami mendapati bahawa ekson mamalia yang paling baru dibuat sebahagian besarnya berasal dari urutan berulang dan disambungkan dengan tidak cekap dan sering pengkodan bukan protein (10). Kami juga mendapati bahawa ESE baru sentiasa dibuat dan ESS dimusnahkan sebagai genom berusaha untuk mengekalkan kecekapan penyambungan dalam menghadapi mutasi berterusan (8).

Penjujukan throughput (dalam) yang tinggi telah menyediakan cara untuk analisis mutasi throughput yang tinggi. Kami telah mengembangkan kaedah (mengukur array fenotipik yang luas dari susunan urutan, atau "QUEPASA") untuk pengujian menyeluruh semua kemungkinan k-mers untuk pengaruh penyambungan positif dan negatif. Keputusan untuk 6-mers eksonik menunjukkan kesan konteks yang ketara dalam banyak kes.

Kajian 2005 kami yang berkaitan dengan definisi motif kawal selia penyambungan boleh didapati dalam rujukan 9.

Usaha kami sekarang merangkumi:

A) Biologi Pengiraan
Pembangunan algoritma untuk meramal tapak splice berdasarkan maklumat yang tersedia untuk sel, termasuk ramalan struktur sekunder, untuk mengenal pasti semua elemen yang perlu dipertimbangkan untuk pemahaman mekanistik splicing. .

B) Exons Pereka
Mempelajari peraturan interaksi ESE, ESS, ISE dan ISS melalui reka bentuk de novo ekson sintetik. Ekson ini terdiri daripada ESE dan ESS yang ditetapkan yang direka bentuk untuk berfungsi secara tunggal apabila digabungkan (iaitu, tidak menimbulkan urutan bertindih yang mengelirukan)

C) Analisis mutasi throughput tinggi
Kami baru-baru ini telah membangunkan alat ini untuk menjalankan skrin tepu jujukan dan perubahan jujukan yang mempengaruhi penyambungan. Kami menggunakan metodologi ini untuk menentukan interaksi kombinatorial yang mengawal definisi exon dan mentakrifkan kesan konteks dalam keputusan penyambungan.

D) Kesan tindakan tahap DNA terhadap penyambungan
Kami secara genetik memanipulasi 25 kb dihydrofolate reductase (dhfr) lokus dalam sel hamster Cina untuk mengkaji kesan struktur kromatin dan tindakan penambah / penambahbaikan terhadap penyambungan dalam konteks kromosom semula jadi gen.

E) Bidang minat kedua terletak pada bidang bioteknologi: Kami mengasingkan derivatif kejuruteraan sel ovari hamster Cina (CHO) yang mampu penguatan gen pantas untuk mempercepatkan pembangunan terapeutik berasaskan protein rekombinan, dan membangunkan vektor yang meningkat penghasilan protein rekombinan melalui pemprosesan pascatranskrip transkrip rekombinan yang lebih cekap.

Profil skor PESE manusia chuk exon 8 (lengkung hitam) dan kesan mutasi pada skor PESE (lengkung merah atau lekukan biru) dan penyambungan (segi empat tepat).


PERBINCANGAN

Paling penting kepada mana-mana evolusi terarah dan strategi kejuruteraan protein ialah keupayaan untuk menjana perpustakaan klon varian bersaiz mencukupi. Oleh kerana kami bergantung di sini pada Cas9 untuk memperkenalkan perpustakaan secara langsung dalam genom sel mamalia, kami mula-mula menyasarkan untuk mengoptimumkan pelbagai parameter yang dikaitkan dengan HDR dengan membangunkan ujian eksperimen yang menggabungkan genotip antibodi kepada fenotip menggunakan sel PnP (Rajah 1A). Ini membolehkan kami menilai serangkaian parameter di mana kami menentukan ekspresi Cas9 konstitutif dalam sel host memainkan peranan paling penting dalam meningkatkan kecekapan HDR (Gambar 1C). Ini mungkin disebabkan oleh ketersediaan dan kelimpahan protein Cas9 yang telah disetempatkan dalam nukleus pada masa penderma ssODN tersedia untuk pembaikan DNA. Kami juga menyelesaikan panjang lengan homologi yang optimum, yang secara tidak dijangka tidak sepadan dengan ssODN terpanjang yang diuji (200 nt), tetapi lebih kepada panjang ssODN pertengahan 120 nt. Sebab yang tepat mengapa penurunan integrasi sedemikian berlaku untuk penderma ssODN yang lebih lama tidak diketahui, tetapi dihipotesiskan bahawa ssODN yang lebih lama kurang dapat diakses, atau mungkin mengganggu protein pembaikan DNA (38) dan juga dapat dikaitkan dengan penurunan transfeksi kecekapan. Kami juga menentukan bahawa pengubahsuaian kimia pada hujung 5' dan 3' ssODN dengan ikatan PS membawa kepada HDR yang lebih tinggi kerana peningkatan kestabilan dan rintangan nuklease (19). Sejak beberapa kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa penghambatan pengatur jalur NHEJ 53BP1 dapat meningkatkan HDR, kami juga mengalahkan 53BP1 dan melihat peningkatan tambahan dalam HDR, mencapai maksimum dalam kajian ini ∼36% (Gambar 1D). Pada masa hadapan, mungkin untuk meningkatkan lagi HDR dengan menggabungkan teknik tambahan seperti penggunaan gRNA yang diubah suai secara kimia (50) dan penindasan molekul NHEJ lain (cth KU70 dan DNA ligase IV) ( 51), atau dengan mengeksploitasi kejuruteraan baru. varian Cas9 atau nuklease boleh atur cara lain (cth Cpf1) ( 52, 53).

Dengan parameter yang dioptimumkan untuk HDR, kami seterusnya membina perpustakaan HDM awal yang menyasarkan CDRH3 melalui penggabungan kodon degenerasi (NNK dan NNB) yang terdapat di antara lengan homologi penderma ssODN. Berikutan analisis HDM dan NGS, kami dapat menjelaskan secara kuantitatif bahawa a.a. frekuensi yang terdapat dalam perpustakaan genomik adalah hampir sama seperti yang telah diramalkan berdasarkan skema kodon yang merosot (Rajah 2A). Ini menunjukkan bahawa urutan ssODN yang mempunyai homologi tambahan melalui kesamaan dengan CDRH3 asli tidak terpadu secara selektif pada frekuensi yang lebih tinggi, menunjukkan bahawa HDM tidak berat sebelah. Analisis NGS walau bagaimanapun mendedahkan bahawa pembaikan patah dua terkandas melalui laluan NHEJ/MMEJ berlaku secara tidak rawak, menghasilkan beberapa varian yang sangat banyak yang hadir secara tidak seimbang di perpustakaan (Rajah 2C). Fenomena bias pembaikan Cas9 ini telah dilaporkan sebelum ini (46). Walaupun kemungkinan menggunakan mekanisme NHEJ yang rawan kesalahan untuk memperkenalkan mutagenesis tambahan di perpustakaan kami dapat dianggap bermanfaat, kerana bahkan telah digunakan untuk menemui varian baru jalur isyarat sel (54) dan membedah kawasan penambah (55) di konteks kejuruteraan antibodi, kehadiran varian yang sangat berlebihan akan memberi kesan buruk pada pengedaran dan pemeriksaan perpustakaan (56). Oleh itu, kami mengurangkan kecenderungan peristiwa ini dengan menggunakan jujukan sasaran gRNA 'frameshift-stop', di mana berikutan belahan Cas9, peristiwa NHEJ/MMEJ yang biasanya akan menghasilkan jujukan antibodi dalam bingkai sebaliknya menghasilkan jujukan antibodi dengan kodon hentian pramatang. (Rajah 2B dan C). Perpustakaan HDM yang dibina menggunakan jujukan gRNA henti-bingkai ini (sel PnP-HEL23.FS) menunjukkan pengedaran yang lebih seragam, sekali gus mengurangkan varian yang diwakili secara berlebihan (Rajah 2D). Walaupun pengoptimuman sasaran gRNA tidak selalu diperlukan, seperti yang dipaparkan semasa membina perpustakaan DMS dalam CDRH1 dan 2, kami menjangkakan bahawa sebarang kajian masa depan yang bertujuan untuk kejuruteraan antibodi (atau protein lain) dalam sel mamalia juga boleh mendapat manfaat daripada reka bentuk yang teliti bagi jujukan gRNA. untuk memastikan bahawa pembaikan bias NHEJ / MMEJ tidak menjejaskan pengedaran perpustakaan.

Walaupun dengan peningkatan kecekapan HDM yang diperhatikan di sini, perpustakaan sel mamalia kami (10 5 ) masih jauh lebih kecil berbanding apa yang boleh dicapai secara rutin dalam faj (>10 10 ) dan yis (>10 7 ) ( 2). Walaupun penskalaan dengan peranti khusus yang mampu melakukan elektroporasi berskala besar (>2.0 × 10 10 sel) boleh mengimbangi sebahagiannya untuk ini (Tambahan Rajah S3), kadar pertumbuhan yang lebih perlahan dan daya pemprosesan yang dikaitkan dengan kultur sel mamalia memerlukan strategi untuk memaksimumkan kualiti perpustakaan yang berfungsi. Untuk tujuan ini, kami mereka bentuk ssODN dengan memilih secara rasional skema kodon yang merosot untuk meniru a.a. frekuensi ruang kepelbagaian tertentu, dalam hal ini himpunan tikus yang naif. Walaupun terdapat pendekatan lain untuk membina kepelbagaian genetik yang sangat merangkum a.a. frekuensi repertoir tertentu (cth. sintesis oligonukleotida berasaskan fosforamidat trinukleotida) ( 57–60), kaedah ini mahal dan memerlukan strategi pemasangan dan pengklonan gen yang canggih. Sebaliknya, HDM bergantung pada skim kodon degenerasi yang boleh disintesis secara komersial dan tidak memerlukan pemasangan atau pengklonan gen, sekali gus mewakili penjimatan yang besar dalam masa, usaha dan kos untuk penjanaan perpustakaan. Selanjutnya, kami telah menunjukkan bahawa jika dibandingkan dengan skema kodon degenerasi NNK dan NNB standard, skema kodon ssODN yang dipilih secara rasional dapat menyerupai a.a. frekuensi repertoir naif tetikus (Rajah 3A dan B). Untuk menjana perpustakaan NRO, kami menggunakan pendekatan yang sangat minima bagi satu kodon ssODN degenerate tunggal (setiap panjang CDRH3) namun dengan kemajuan dalam sintesis berskala besar tatasusunan oligonukleotida (61), kumpulan ssODN bagi jujukan yang ditentukan tersuai boleh disertakan untuk menjana. perpustakaan HDM yang lebih tepat.

Seterusnya, kami membina perpustakaan yang lebih besar, berdasarkan terutamanya pada peningkatan bilangan sel yang ditransfeksi. Berikutan analisis HDM dan NGS, kami mengenal pasti bahawa terdapat sekurang-kurangnya 1.47 × 10 5 varian (jujukan CDRH3 a.a. yang unik). Kerana fakta bahawa sampel disediakan untuk NGS dari DNA genomik dengan bilangan salinan rendah setiap varian, kami percaya ukuran perpustakaan yang dihasilkan sebenarnya berada dalam julat varian 5 × 10 5 mengikut jumlah sel hidup pasca transfeksi dan data sitometri aliran. Menundukkan perpustakaan kepada pemilihan antigen oleh MACS dan FACS menghasilkan penemuan urutan CDRH3 novel (HEL24), yang mempunyai panjang berbeza dan jarak suntingan yang besar daripada urutan asal (HEL23). Walaupun pemeriksaan sel mamalia kami berjaya mengenal pasti satu varian CDRH3 khusus antigen baharu, kami memahami bahawa pendekatan sedemikian tidak dengan sendirinya bersaing dengan perpustakaan antibodi sintetik yang lebih teguh yang disaring oleh paparan phage dan yis, yang sering memulihkan panel klon CDRH3 yang unik. (3, 43, 44, 62). Ini pastinya disebabkan saiz perpustakaan yang lebih rendah dan kepelbagaian dalam sistem mamalia kita. Walaupun, kepelbagaian dan saiz perpustakaan adalah lebih besar daripada apa yang biasa diperhatikan dalam platform berasaskan mamalia, kami tidak membayangkan pendekatan kami akan mempunyai aplikasi utama dalam penemuan klon antibodi novel, tetapi kami menjangkakan aplikasi utama adalah untuk kejuruteraan. dan mengoptimumkan antibodi, bermula dari calon utama yang sesuai (yang boleh berasal dari dalam vivo pemilihan atau saringan paparan phage dan yis). Untuk tujuan ini, kami menunjukkan bahawa dengan menggabungkan ssODN dengan kodon degenerasi yang dijubin di sepanjang CDRH3, HDM boleh digunakan untuk merekayasa pantas antibodi HEL23 dan HEL24 'calon utama' kami untuk pertalian yang lebih tinggi (Rajah 4C dan D Tambahan Rajah S8).

Salah satu aplikasi HDM yang paling menarik adalah kemudahan di mana kita dapat melakukan DMS, teknik baru dalam teknik protein yang mengungkap hubungan urutan-fungsi. DMS bergantung pada pembinaan perpustakaan mutagenesis tepu, yang memerlukan mutagenesis PCR atau gen sintetik dan pengklonan ke dalam vektor ekspresi plasmid, oleh itu kebanyakan kajian DMS telah dilakukan dalam bakteria, phage dan yis (24, 37, 63, 64). Satu contoh sebelumnya melakukan DMS pada klon antibodi menggunakan pemindahan plasmid dalam sel mamalia (65) bagaimanapun, kehadiran sementara dan poliklonal plasmid menjadikan pendekatan ini mencabar. Dalam kes HDM, kami dapat membina perpustakaan mutagenesis ketepuan untuk DMS dengan cara yang sama seperti yang kami lakukan untuk pematangan afinitas, dengan hanya menyatukan ssODN dengan kodon degenerasi tunggal berjubin sepanjang CDRH1, 2, 3. Kerana ukuran perpustakaan diperlukan untuk Skala DMS secara linear dengan bilangan kedudukan sasaran untuk disiasat, jumlah saiz perpustakaan mudah dicapai dalam sel hibridoma kami. Tambahan pula, kerana tiada pengklonan atau pemindahan plasmid diperlukan, perpustakaan DMS boleh dibina dengan cepat dan mudah oleh HDM dan integrasi genomik memastikan monoklonaliti selular. Analisis data NGS yang dihasilkan oleh DMS menunjukkan residu kritikal dan merugikan untuk ekspresi antibodi berfungsi dan kekhususan antigen (Gambar 5). Maklumat ini boleh digunakan untuk memilih kodon yang merosot secara rasional yang meniru landskap jujukan berfungsi, yang seterusnya boleh digunakan untuk menghasilkan perpustakaan HDM gabungan yang boleh disaring untuk antibodi dengan sifat yang dipertingkatkan (iaitu pertalian, kekhususan, kebolehbangunan). Akhirnya, sementara dalam kajian ini kita secara eksklusif menumpukan pada antibodi, HDM menawarkan potensi untuk menyiasat tapak pengawal selia genomik (cth promoter, penambah) atau jurutera terapeutik biologi dan selular berharga lain yang bergantung pada ekspresi mamalia, seperti reseptor antigen chimeric, T reseptor sel, reseptor sitokin dan domain isyarat intraselular (66-69).


Perbincangan

Analisis perbandingan kami terhadap atlas AS perkembangan merentas tujuh spesies mendedahkan bahawa devAS telah jauh lebih terpelihara semasa evolusi daripada AS bukan dinamik yang lebih kerap. DevAS juga memaparkan berbilang ciri yang mencadangkannya secara keseluruhannya diperkaya dengan acara AS berfungsi, seperti yang dicadangkan sebelum ini 16 . Walau bagaimanapun, tahap devAS dan corak pemilihan berbeza di antara organ, tempoh perkembangan, corak penggunaan exon, usia ekson dan jenis ekson kaset.

Kerja kami memberikan pandangan global tentang corak perkembangan AS merentas organ dan spesies vertebrata. Walau bagaimanapun, ia mempunyai satu had penting dalam data RNA-seq tisu pukal secara amnya tidak membenarkan penilaian sumbangan relatif perubahan komposisi selular berbanding perubahan dalam frekuensi AS dalam jenis sel kepada trajektori perkembangan AS yang diperhatikan-dengan dua pengecualian. Pertama, mengetahui bahawa mikroekson sebagian besar spesifik neuron dan terlibat dalam neurogenesis 37,38 memungkinkan kita mengaitkan pemerhatian kita bahawa mikroekson terutama berubah pada perkembangan awal (Gambar 5d) kepada perubahan frekuensi AS pada neuron. Kedua, hakikat bahawa komposisi selular testis secara asasnya berubah apabila kematangan seksual 22,23 , dan pemerhatian kami bahawa peralihan ini secara langsung bertepatan dengan peralihan radikal dalam corak AS (Rajah 1e dan 3a, dan Rajah Tambahan 4 dan 6) , mampu perkaitan langsung kedua-dua proses ini. Walau bagaimanapun, perubahan mendasar dalam komposisi jenis sel tidak berlaku di organ lain. Secara konsisten, semua organ lain menunjukkan perbezaan lancar dan progresif program AS semasa pembangunan, yang mana kedua-dua perubahan dalam kelimpahan jenis sel dan frekuensi AS dalam jenis sel yang sama mungkin menyumbang (Rajah 1e dan 3a, dan Rajah Tambahan 4 dan 6) . Memisahkan sumbangan tepat komposisi sel berbanding perubahan AS intrinsik jenis sel pada corak AS yang diperhatikan dalam kajian kami akan memerlukan set data transkripomik sel tunggal yang membolehkan penilaian kuantitatif AS yang boleh dipercayai - usaha yang kini mencapai 49,50.


Ucapan terima kasih

Penulis memohon maaf kepada rakan sekerja mereka yang karya mereka tidak dapat dipetik kerana keterbatasan ruang. Mereka mengucapkan terima kasih kepada M. Inniss, J. Torella, T. Ford dan J. Chen atas ulasan yang berguna mengenai manuskrip itu. Karya di makmal penulis disokong oleh: Fellowship Organisasi Biologi Molekul Eropah dan Fellowship Program Sains Frontier Manusia kepada F.L. Fellowship Yayasan Sains Kebangsaan Switzerland kepada A.G. dan dana daripada NIH dan Agensi Projek Penyelidikan Lanjutan Pertahanan kepada P.A.S.


Tonton videonya: Cara mengerjakan tugas Pentingnya Perpustakaan (Februari 2023).