Maklumat

Mengapa tidak menggunakan SDS-PAGE sebagai kaedah untuk mengesan virus?

Mengapa tidak menggunakan SDS-PAGE sebagai kaedah untuk mengesan virus?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Baru-baru ini, saya telah meneliti tentang DNA dan saya tahu kaedah paling popular untuk mengesan virus adalah berdasarkan DNA. Selepas belajar tentang protein, saya tertanya-tanya mengapa kita tidak mengesan virus berdasarkan protein virus?

Jika benar kita boleh menjimatkan banyak wang, daripada melakukan tindak balas PCR, kita boleh mengesan lebih daripada satu penyakit dalam satu tindak balas.

Sebagai contoh, apabila saya mempunyai urutan virus daripada NCBI Genebank, saya boleh mengetahui berapa banyak protein yang dihasilkan oleh organisma sasaran dan saya boleh mengira berat molekul setiap protein. Kemudian jalankannya dalam gel SDS-PAGE untuk melihat bagaimana rupa jalur, mungkin saya boleh tahu organisma sasaran ada atau tidak?

Sebagai contoh, HIV menghasilkan 9 protein dan berat molekul setiap protein adalah berbeza. Jadi selepas melakukan elektroforesis, saya mempunyai 9 jalur. Berdasarkan jarak antara setiap jalur dan berdasarkan berat molekul, adakah mungkin untuk mengetahui HIV ada atau tidak?


Secara ringkasnya, jawapannya ialah anda boleh berusaha untuk mengesan protein virus, tetapi kerana protein ini merupakan komponen yang sangat kecil dalam sampel anda, anda perlu menggunakan teknik immunoblotting untuk mengesan protein virus tertentu. Walaupun immunoblotting adalah teknik yang agak sensitif, saya rasa wajar untuk mengatakan bahawa ia boleh menuntut secara teknikal. Sebaliknya tindak balas PCR adalah sangat sensitif dan agak teguh. PCR juga secara teknikalnya lebih tegas kerana DNA secara amnya lebih mudah untuk digunakan berbanding protein.

Sebelum kemunculan PCR, immunoblotting akan menjadi kaedah pilihan.


Kaedah Molekul untuk Pengesanan Virus

Prosedur diagnostik molekul telah diterangkan dalam beberapa buku dan artikel terkini. Walau bagaimanapun, penerbitan ini tidak memfokuskan pada pengesanan virus, dan juga tidak menyediakan protokol praktikal untuk kaedah molekul yang lebih baru.

Ditulis oleh pencipta atau pembangun utama teknologi ini, Kaedah Molekul untuk Pengesanan Virus menyediakan kedua-dua ulasan kaedah individu dan arahan untuk mengesan urutan asid nukleik virus dalam spesimen klinikal. Setiap prosedur termasuk protokol jaminan kualiti yang sering diabaikan oleh buku metodologi lain. Kaedah Molekul untuk Pengesanan Virus menyediakan prosedur klinikal yang berkaitan untuk kebanyakan metodologi diagnostik yang lebih baru.

Prosedur diagnostik molekul telah diterangkan dalam beberapa buku dan artikel terkini. Walau bagaimanapun, penerbitan ini tidak memfokuskan pada pengesanan virus, dan juga tidak menyediakan protokol praktikal untuk kaedah molekul yang lebih baru.

Ditulis oleh pencipta atau pembangun utama teknologi ini, Kaedah Molekul untuk Pengesanan Virus menyediakan kedua-dua ulasan kaedah individu dan arahan untuk mengesan jujukan asid nukleik virus dalam spesimen klinikal. Setiap prosedur termasuk protokol jaminan kualiti yang sering diabaikan oleh buku metodologi lain. Kaedah Molekul untuk Pengesanan Virus menyediakan prosedur yang berkaitan secara klinikal untuk kebanyakan metodologi diagnostik yang lebih baru.


5.1. Jaminan kualiti makmal

Untuk membina kapasiti makmal, program HIV/AIDS kebangsaan harus melabur dalam program QA untuk semua makmal yang menjalankan ujian diagnostik, dan harus menggunakan perkhidmatan sedia ada yang disediakan oleh WHO dan lain-lain termasuk Pusat Kawalan dan Pencegahan Penyakit (CDC) untuk menyokong luaran skim penilaian kualiti (EQAS).

Mempunyai ujian yang sangat tepat tidak semestinya menjamin keputusan makmal yang boleh dipercayai. Banyak proses yang terlibat dari masa spesimen dikumpul dan diangkut ke makmal, diuji dan sehingga keputusan dilaporkan, semasa ralat boleh berlaku. Oleh itu, QA berterusan dalam konteks sistem kualiti makmal, secara dalaman dan luaran, adalah penting. Pakar klinik dan kakitangan yang menyediakan perkhidmatan makmal memerlukan komunikasi tetap tentang prestasi ujian untuk menambah baik dan memastikan prestasi yang sesuai. Prosedur operasi standard (SOP) yang ditakrifkan dengan baik, mengikut algoritma ujian yang ditakrifkan dan disahkan secara nasional, adalah penting untuk penggunaan optimum semua ujian berasaskan makmal.


Gel penyusun tidak berguna untuk analisis dan ia boleh dikeluarkan. Bahagian atas gel merujuk kepada bahagian atas gel pemisah, iaitu titik di mana polipeptida yang berbeza mula berpisah. Campuran piawaian protein biasanya terdiri daripada lima hingga lapan polipeptida individu yang menghasilkan "ladder yang menonjol." Standard dikenal pasti dari atas ke bawah. Bergantung pada %T satu atau lebih piawai jisim terendah mungkin tidak dapat diselesaikan.

Untuk menyediakan lengkung piawai bagi jisim molekul seseorang menganggarkan mobiliti relatif bagi setiap piawai dan memplotkan lengkung piawai jisim molekul berbanding mobiliti relatif pada kertas separa log atau jisim molekul log berbanding mobiltiy relatif pada kertas graf konvensional. Mobiliti relatif ditentukan dengan mengukur jarak dari bahagian atas gel ke tengah bahagian depan pewarna atau titik rujukan sewenang-wenangnya, mengukur jarak dari bahagian atas gel ke tengah jalur, dan membahagikan ukuran kedua dengan yang pertama. . Ini ialah Rf, yang sentiasa antara 0 dan 1.

Ambil perhatian bahawa mobiliti relatif protein tertentu bergantung pada kepekatan gel. Mana-mana gel tunggal mempunyai had atas dan bawah untuk julat berguna untuk menganggar jisim molekul.


3. Kultur Sel (Kultur Tisu)

Terdapat tiga jenis kultur organ kultur tisu, kultur eksplan dan kultur sel.

Budaya organ terutamanya dilakukan untuk parasit yang sangat khusus bagi organ tertentu cth. kultur cincin trakea dilakukan untuk pengasingan coronavirus.

Budaya eksplan jarang dilakukan.

Kultur sel kebanyakannya digunakan untuk mengenal pasti dan penanaman virus.

  • Kultur sel ialah proses di mana sel-sel tumbuh di bawah keadaan terkawal.
  • Sel ditanam secara in vitro pada kaca atau permukaan plastik yang dirawat dalam medium pertumbuhan yang sesuai.
  • Pada medium pertumbuhan pertama, biasanya larutan garam seimbang yang mengandungi 13 asid amino, gula, protein, garam, serum anak lembu, penimbal, antibiotik dan fenol merah diambil dan tisu perumah atau sel diinokulasi.
  • Semasa pengeraman, sel membahagi dan merebak pada permukaan kaca untuk membentuk satu lapisan tunggal.

Kaedah Yang Mengesan Seluruh Zarah Faj

Mikroskopi elektron penghantaran (TEM) menggunakan pancaran elektron untuk menghasilkan resolusi 1000x lebih tinggi berbanding mikroskop cahaya tradisional. Peningkatan peleraian (turun hingga 0.2 nm) sudah cukup untuk menggambarkan walaupun virus. Teknologi ini boleh digunakan untuk mengukur zarah virus, walaupun sampel perlu sangat pekat (� 6 zarah/mL) untuk menghasilkan keputusan yang boleh dipercayai (Mann, 2005 Goldsmith dan Miller, 2009). Kuantifikasi virus menggunakan TEM adalah sangat tepat dalam menentukan morfotaip dan jumlah bilangan, tetapi ia dianggap memakan masa, mahal dan tidak praktikal untuk menjalankan banyak sampel dan tidak boleh digunakan untuk sampel yang kompleks. Selain itu, penyediaan sampel adalah membosankan dan teknik tersebut memerlukan pengendali yang mahir di atas instrumen yang canggih (Ackermann, 2012).

Teknik lain untuk mengira keseluruhan zarah ialah sitometri aliran. Di sini, zarah virus ditandakan dengan pewarna pendarfluor dan diarahkan melalui kapilari. Diameter kecil kapilari memaksa zarah mengalir dalam satu baris, membolehkan pengesanan serakan cahaya yang disebabkan oleh setiap zarah. Kaedah ini pantas dan ketat, oleh itu digunakan secara meluas (Picot et al., 2012). Kajian mani menunjukkan bahawa isyarat pendarfluor tidak berkorelasi dengan saiz genom, tetapi virus yang berbeza dalam sampel campuran boleh didiskriminasi berdasarkan pendarfluor dan taburan serakan sisi (Brussaard et al., 2000). Baru-baru ini, ditunjukkan bahawa isyarat pendarfluor boleh digunakan untuk mengaitkan bilangan molekul asid nukleik sasaran dengan bilangan zarah virus hanya jika sampel dikendalikan dengan lembut, penggunaan surfaktan dielakkan, kawalan negatif disertakan untuk menentukan pendarfluor auto. medium dan sensitiviti instrumen dan ujian dianggarkan terlebih dahulu, menggunakan panel bakteriofaj pelbagai saiz genom (Dlusskaya et al., 2019).

Akhir sekali, kaedah berasaskan laser yang dibangunkan oleh NanoSight Limited membolehkan visualisasi masa nyata dan menghitung zarah virus dalam beberapa minit berdasarkan penyerakan cahaya dinamik oleh mikroskop optik bercahaya laser. Kelemahan ialah keperluan kepekatan sampel yang relatif tinggi (10 7 � 9 PFU/ml) dan cecair jernih (Anderson et al., 2011) yang sukar diperoleh daripada sampel kompleks seperti tanah dan bahan najis.


Blotting

Selepas pemisahan campuran protein, jalur polipeptida dipindahkan ke pembawa membran. Untuk tujuan ini membran dilekatkan pada gel dan sandwic yang dipanggil ini dipindahkan ke ruang elektroforesis. Ada kemungkinan bahawa beberapa SDS telah dibasuh, dan protein sebahagiannya semula semula jadi semula, iaitu memperoleh semula struktur 2D dan 3Dnya. Walau bagaimanapun, cas elektrik yang dikenakan menyebabkan protein bergerak keluar dari gel secara menegak ke arah yang dilaluinya pada gel, ke membran. Jalur protein dengan itu terikat pada membran. Jalur "dihapuskan" kini tersedia untuk dirawat lebih lanjut (cth. untuk pengesanan protein khusus dengan antibodi khusus).


Kuantiti Asid Nukleik

Menganggarkan Kepekatan DNA pada Gel Berwarna Etidium Bromida

Elektroforesis gel agarose biasanya digunakan untuk memisahkan serpihan DNA berikutan penghadaman endonuklease sekatan atau amplifikasi PCR. Serpihan dikesan dengan mengotorkan gel dengan pewarna interkalasi, etidium bromida, diikuti dengan visualisasi/fotografi di bawah cahaya ultraungu. Etidium bromida mengotorkan DNA dengan cara yang bergantung kepada kepekatan supaya lebih banyak DNA yang terdapat dalam jalur pada gel, lebih kuat ia akan mengotorkan. Hubungan ini memungkinkan untuk menganggarkan kuantiti DNA yang terdapat dalam jalur melalui perbandingan dengan jalur lain yang diketahui jumlah DNA. Jika keamatan dua jalur adalah serupa, maka ia mengandungi jumlah DNA yang sama. Etidium bromida mengotorkan DNA dan RNA untai tunggal dengan sangat buruk. Bentuk asid nukleik ini tidak akan memberikan kuantiti yang boleh dipercayai oleh elektroforesis gel.


Denaturasi sampel

Pelbagai penimbal sampel telah digunakan untuk SDS-PAGE tetapi semuanya menggunakan prinsip yang sama untuk menyahtukarkan sampel. Kami memperoleh denaturasi yang baik dengan menyediakan sampel kepada kepekatan akhir 2 mg/ml protein dengan 1% SDS, 10% gliserol, 10 mM Tris-Cl, pH 6.8, 1 mM etilena diamine tetraacetic acid (EDTA), agen pengurangan seperti sebagai dithiothreitol (DTT) atau 2-mercaptoethanol, dan secubit bromophenol blue untuk berfungsi sebagai pewarna pengesan (

Kami menyediakan 2x pekat penimbal sampel yang terdiri daripada 2% SDS, 20% gliserol, 20 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2 mM etilena diamine tetraacetic acid (EDTA), 160 mM dithiothreitol (DTT), dan 0.1 mg/ml bromphenol pewarna biru. Saya lebih suka DTT daripada 2-mercaptoethanol kerana yang kedua mempunyai bau yang lebih kuat dan tidak menyenangkan pecahan darah kita dengan baik. Sebahagian daripada masalah ialah mandian air kami tidak mencapai takat didih, dan mendidih mungkin diperlukan dengan 2-mercaptoethanol. Kami menyediakan semua yang tidak diketahui kami kepada kepekatan yang sama kemudian campurkan 1 volum sampel yang disediakan kepada 1 volum 2x penimbal.

Jadi, apakah yang dilakukan oleh pelbagai komponen? EDTA ialah pengawet yang mengelat kation divalen, yang mengurangkan aktiviti enzim proteolitik yang memerlukan ion kalsium dan magnesium sebagai kofaktor. Tris bertindak sebagai penampan, yang sangat penting kerana proses penyusunan dalam elektroforesis terputus memerlukan pH tertentu. Gliserol menjadikan sampel lebih tumpat daripada penimbal sampel, jadi sampel akan kekal di bahagian bawah telaga dan bukannya terapung keluar. Pewarna membolehkan penyiasat mengesan kemajuan elektroforesis.

SDS, DTT, dan haba bertanggungjawab untuk denaturasi sebenar sampel. SDS memecahkan struktur dua dan tiga dimensi protein dengan menambahkan cas negatif kepada asid amino. Oleh kerana cas seperti menolak, protein lebih kurang diluruskan, serta-merta menjadikannya tidak berfungsi. Sesetengah struktur kuaterna mungkin kekal disebabkan oleh ikatan disulfida (kovalen) dan disebabkan oleh kaitan kovalen dan bukan kovalen kepada molekul jenis lain. By the way, nama lain untuk SDS ialah lauril sulfat. Syampu anda mungkin mengandungi lauril sulfat - bukankah itu membangkitkan keyakinan terhadap produk?

Banyak protein mempunyai sifat hidrofobik yang ketara dan mungkin berkait rapat dengan molekul lain, seperti lipid, melalui interaksi hidrofobik. Memanaskan sampel kepada sekurang-kurangnya 60 darjah C menggegarkan molekul, membolehkan SDS mengikat di kawasan hidrofobik dan menyelesaikan denaturasi.

Sistein asid amino mengandungi kumpulan sulfhidril (-SH) yang secara spontan membentuk ikatan disulfida (-S-S-) dengan kumpulan sulfhidril yang lain di bawah keadaan intrasel yang normal. Ikatan disulfida adalah kovalen dan tidak terganggu oleh SDS. DTT adalah agen pengurangan yang kuat. Peranan khususnya dalam denaturasi sampel adalah untuk mengeluarkan bit terakhir struktur tertiari dan kuaterna dengan mengurangkan ikatan disulfida.

Kebanyakan penimbal sampel tidak mengeluarkan kumpulan karbohidrat atau fosfat yang terikat secara kovalen, dan beberapa perkaitan dengan jenis makromolekul lain sukar untuk diganggu. Polipeptida mengandungi jumlah asid amino asas dan berasid yang berbeza-beza yang menambah cas pada molekul, dan asid amino individu berbeza dalam berat molekul walaupun ia mungkin mengikat SDS dengan pertalian yang sama. Oleh itu, nisbah caj kepada jisim dan mobiliti relatif banyak protein dipengaruhi oleh faktor selain berat molekul. SDS-PAGE sangat berkesan dalam memberikan hasil yang boleh dihasilkan semula, tetapi tidak bergantung pada nilai yang tepat untuk penentuan MW.


Pengesanan sensitiviti tinggi coronavirus SARS-CoV-2 menggunakan PCR multipleks dan kaedah metagenomik berasaskan multiplex-PCR

Banyak kaedah pengesanan telah digunakan atau dilaporkan untuk diagnosis dan/atau pengawasan SARS-CoV-2. Antaranya, tindak balas rantai polimerase transkripsi terbalik (RT-PCR) adalah yang paling sensitif, mendakwa pengesanan kira-kira 5 salinan virus. Walau bagaimanapun, telah dilaporkan bahawa hanya 47-59% daripada kes positif yang dikenal pasti oleh RT-PCR, mungkin disebabkan oleh kehilangan atau kemerosotan RNA virus dalam proses pensampelan, atau mutasi genom virus. Oleh itu, membangunkan kaedah yang sangat sensitif adalah penting untuk memastikan keupayaan pengesanan yang mantap. Dengan matlamat untuk meningkatkan sensitiviti dan menampung pelbagai tetapan aplikasi, kami membangunkan kaedah berasaskan multipleks-PCR yang terdiri daripada 172 pasang primer khusus, dan menunjukkan kecekapannya untuk mengesan SARS-CoV-2 pada nombor salinan yang rendah. Ujian menghasilkan puncak sasaran ciri bersih dengan saiz yang ditentukan, yang membolehkan pengecaman langsung positif melalui elektroforesis. Selain itu, penjujukan pilihan boleh memberikan pengesahan lanjut serta maklumat filogenetik virus yang dikenal pasti untuk diskriminasi strain tertentu, yang akan menjadi sangat penting untuk tujuan pengawasan yang mewakili keperluan kesihatan global. Akhir sekali, kami juga membangunkan secara selari kaedah metagenomik berasaskan multipleks-PCR yang boleh mengesan SARS-CoV-2, dengan faedah tambahan potensinya untuk mendedahkan kepelbagaian mutasi dan patogen baru pada kedalaman penjujukan yang rendah.


Tonton videonya: ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA DAN SDS-PAGE (Disember 2022).