Maklumat

Bagaimanakah SDS-PAGE dipisahkan berdasarkan jisim?

Bagaimanakah SDS-PAGE dipisahkan berdasarkan jisim?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dalam SDS-PAGE, medan elektrik dan nisbah jisim kepada cas dianggarkan tetap untuk semua protein. Juga, jika $F=qE =ma$, kemudian $frac{m}{q}a=E$.

Oleh itu, semua protein mesti berhijrah dengan pecutan yang berterusan.

Jadi apakah daya penggerak dalam SDS-PAGE yang menyelesaikan protein jisim yang berbeza? Adakah protein yang lebih besar mempunyai saiz yang lebih besar dan dengan itu mengalami daya geseran yang lebih besar daripada ayak gel? Tetapi walaupun itu benar, protein yang lebih besar merasakan daya rintangan yang lebih besar harus dilawan oleh daya penghijrahannya yang lebih besar daripada peningkatan jumlah cas.

Saya akan menghargai jika seseorang dapat menyelesaikan kekeliruan ini. Terima kasih.


Anda betul bahawa mobiliti molekul bergantung pada nisbah jisim kepada cas, dan ini bermakna molekul bersaiz berbeza dengan $frac{m}{q}$ akan mempunyai yang sama pecutan. Walau bagaimanapun halaju molekul yang bergerak melalui matriks gel bergantung pada titik di mana daya yang dikenakan oleh medan elektrik berada dalam keseimbangan dengan daya geseran yang bertindak ke atas molekul. Memodelkan molekul bersaiz berbeza sebagai sfera dengan saiz yang berbeza, kita boleh menggunakan Hukum Stokes

$F = 6pi mu Rv$

di mana $mu$ ialah kelikatan matriks (malar), $R$ ialah jejari molekul kita, dan $v$ ialah halaju aliran.

Menulis semula persamaan anda, kami melihatnya

$F = qE = ma = 6pi mu Rv$

dan

$v = frac {ma}{6pi mu R}$

Untuk tetap $a$ dan $mu$, kita melihat bahawa halaju berbeza dengan nisbah jisim kepada jejari

$v sim frac{m}{R}$

Untuk sfera model kami, dengan mengandaikan ketumpatan seragam, skala jejari secara kubik dengan jisim, bermakna itu $frac{m}{R}$ berkurang apabila saiz molekul bertambah.

($d = frac{m}{V}$ dan $V = frac{4}{3}pi R^3$ di mana $d$ ialah ketumpatan dan $V$ ialah isipadu)

Jadi, molekul yang lebih besar akan mencapai keseimbangan daya dengan rintangan geseran lawan pada halaju yang lebih rendah berbanding dengan molekul yang lebih kecil, sekali gus menerangkan bagaimana molekul bersaiz yang berbeza dengan yang sama. $frac{m}{q}$ akan berpisah pada gel. Satu kaveat untuk penjelasan ini ialah polipeptida dan asid nukleik tidak dimodelkan oleh sfera, dan jisim molekul tersebut berskala linear dengan panjang.


Bagaimana SDS-PAGE Berfungsi?

Elektroforesis ialah teknik utama untuk mengasingkan protein dan bahan lain seperti asid nukleik, purin, pirimidin, beberapa sebatian organik dan juga ion bukan organik. Kebanyakan elektroforesis semasa adalah untuk memisahkan sampel ke dalam fasa bergerak dalam medium tidak bergerak. Gel poliakrilamida adalah salah satu media utama. Ia adalah gel berliang yang saiz liangnya hampir dengan saiz molekul protein, yang meningkatkan resolusi protein. Selain itu, gel poliakrilamida mempunyai kestabilan kimia yang baik, kebolehulangan yang kuat, kestabilan kepada perubahan pH dan suhu, dan pemerhatian warna yang mudah. Elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS-PAGE) mempunyai kelebihan operasi mudah dan kebolehulangan yang baik dalam penentuan berat molekul protein, pengesanan protein tertentu, dan pengenalpastian spesies terikan.

Gel poliakrilamida terdiri daripada akrilamida dan agen penghubung silang N, N'-methylenebisacrylamide di bawah tindakan pemangkin ammonium persulfate (AP) dan N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED). Ia adalah gel dengan struktur rangkaian tiga dimensi. PAGE boleh memisahkan protein kepada beberapa jalur mengikut mobiliti berbeza yang disebabkan oleh cas dan berat molekul molekul protein yang berbeza. SDS ialah surfaktan anionik, yang boleh memecahkan ikatan hidrogen dan hidrofobik protein dengan kehadiran agen pengurangan (β-mercaptoethanol atau dithiothreitol, DTT), dan bergabung dengan molekul protein dalam nisbah tertentu untuk membentuk komposit berbentuk batang pendek. ketumpatan yang sama. Berkorelasi positif dengan berat molekul protein, panjang kompleks yang dibentuk oleh protein dengan berat molekul yang berbeza adalah berbeza. SDS menjadikan jumlah protein bercas negatif jauh melebihi cas asalnya, menutup perbezaan cas semula jadi antara pelbagai molekul protein. Oleh itu, mobiliti pelbagai kompleks protein-SDS semasa elektroforesis tidak lagi dipengaruhi oleh cas asal dan bentuk molekul, tetapi hanya bergantung kepada jisim molekul relatif.

Gel poliakrilamida biasanya terdiri daripada gel susun di lapisan atas dan gel pemisah di lapisan bawah. Perbezaan antara gel atas dan bawah ialah kepekatan akrilamida dan pH Tris-HCl. Semasa elektroforesis, medan elektrik digunakan pada gel, dan protein bercas negatif berhijrah merentasi gel dari elektrod negatif ke elektrod positif. Penampan elektroforesis yang paling biasa terdiri daripada Tris dan glisin. pH dalam gel penyusun ialah 6.8, dan hanya beberapa molekul glisin yang tercerai. Oleh itu, molekul protein yang dirawat SDS bergerak antara molekul glisin atas dan ion Cl- yang lebih rendah. Proses ini memampatkan sampel protein dalam gel ke dalam jalur yang jauh lebih kecil daripada isipadu yang dimuatkan pada mulanya. Apabila elektroforesis berlangsung, protein bergerak ke gel pemisah (pH 8.8), di mana molekul glisin tercerai. Kelajuan pergerakan meningkat dan melebihi protein. Dalam gel pemisah, kelajuan pergerakan setiap protein bergantung kepada berat molekulnya. Protein dengan berat molekul yang kecil boleh melalui liang-liang dalam gel dengan mudah, manakala mereka yang mempunyai berat molekul yang besar mempunyai lebih banyak kesukaran melaluinya. Selepas satu tempoh masa, protein mencapai jarak yang berbeza mengikut saiz, mencapai tujuan pemisahan protein.

Rajah 1. Gambarajah skematik elektroforesis gel poliakrilamida (Gülay, et al, 2018).

Bagaimana untuk Menentukan Berat Molekul Protein oleh SDS-PAGE?

SDS-PAGE ialah kaedah utama untuk menentukan berat molekul protein yang tidak diketahui. Protein dengan berat molekul yang diketahui dan sampel yang tidak diketahui dielektroforesis pada masa yang sama. Selepas pewarnaan, mengikut mobiliti relatif protein standard dan logaritma berat molekul, garis boleh diperoleh dan menentukan berat molekul sampel yang tidak diketahui menggunakan mobiliti relatifnya. Di dalam makmal, protein berat molekul standard yang digabungkan secara kovalen kepada pewarna digunakan sebagai protein rujukan untuk menunjukkan saiz protein yang tidak diketahui secara kasar. Penanda protein pra-warna ini boleh diperhatikan secara langsung semasa elektroforesis atau semasa memindahkan membran.

Bagaimana untuk Membaca Keputusan SDS-PAGE?

Selepas elektroforesis, pemisahan protein tidak dapat diperhatikan secara langsung oleh mata kasar, dan teknik pewarnaan seterusnya diperlukan. Pewarnaan biru cemerlang Coomassie dan pewarnaan perak adalah kaedah biasa untuk pengesanan rutin dan kuantifikasi protein yang dipisahkan oleh elektroforesis. Selepas pemprosesan mudah seperti penetapan-pewarnaan-penyahwarnaan, pengagihan protein dapat diperhatikan dengan jelas. Dengan penambahbaikan kaedah analisis protein kepekaan tinggi dan teknologi pengenalan protein, kaedah pewarnaan baharu seperti pelabelan pendarfluor dan teknologi pelabelan isotop telah meningkatkan sensitiviti dengan banyak, dan juga serasi dengan teknologi pemotongan gel platform proteome automatik. Lebih sensitiviti tinggi dan teknologi pencelupan automatik telah dibangunkan.

Bagaimana untuk Menyimpan Gel SDS-PAGE?

Gel SDS-PAGE yang baru biasanya disediakan sebelum setiap percubaan. Walau bagaimanapun, gel juga boleh disimpan dalam air bersih pada suhu 4°C selama kira-kira seminggu. Jika gel tidak boleh diambil gambar dalam masa selepas pencelupan, ia perlu diletakkan di dalam air untuk mengelakkan pengeringan dan pengecutan gel. Adalah dinasihatkan untuk mengambil gambar hasil pewarnaan secepat mungkin. Band akan tersebar jika gel direndam dalam air untuk masa yang lama.

Rujukan
1. Smith B J. SDS Polyacrylamide Gel Elektroforesis Protein. Kaedah dalam Biologi Molekul, 1984, 1(4):41-55.
2. Duffy M F, Noormohammadi A H, Baseggio N, et al. Pengasingan gel-elektroforesis poliakrilamida bagi protein seluruh sel. Kaedah dalam Biologi Molekul, 1998, 104:267.

Sila serahkan penerangan terperinci projek anda. Kami akan memberikan anda pelan projek tersuai untuk memenuhi permintaan penyelidikan anda. Anda juga boleh menghantar e-mel terus kepada untuk pertanyaan.


Jisim molekul berbanding berat molekul

Jisim molekul (simbol m) dinyatakan dalam Daltons (Da). Satu Dalton ditakrifkan sebagai 1/12 jisim karbon 12. Kebanyakan makromolekul cukup besar untuk menggunakan kiloDalton (kDa) untuk menggambarkan jisim molekul. Berat molekul tidak sama dengan jisim molekul. Ia juga dikenali sebagai jisim molekul relatif (simbol Mr, dengan r ialah subskrip). Berat molekul ditakrifkan sebagai nisbah jisim makromolekul kepada 1/12 jisim atom karbon 12. Ia adalah kuantiti tanpa dimensi.

Apabila kesusasteraan memberikan jisim dalam Da atau kDa ia merujuk kepada jisim molekul. Adalah tidak betul untuk menyatakan berat molekul (jisim molekul relatif) dalam Daltons. Namun begitu, anda akan menemui istilah berat molekul yang digunakan dengan Dalton atau kiloDalton dalam beberapa literatur, selalunya menggunakan singkatan MW untuk berat molekul.


Bagaimanakah SDS-PAGE dipisahkan berdasarkan jisim? - Biologi

BISC411
BIOLOGI MOLEKUL EKSPERIMEN SEL

Prinsip Elektroforesis Gel Poliakrilamida (PAGE)

Teknik elektroforesis yang berkuasa telah dibangunkan untuk memisahkan makromolekul berdasarkan berat molekul. Mobiliti molekul dalam medan elektrik adalah berkadar songsang dengan geseran molekul yang merupakan hasil saiz dan bentuk molekulnya, dan berkadar terus dengan voltan dan cas molekul. Protein boleh diselesaikan secara elektroforesis dalam matriks separa pepejal dengan ketat berdasarkan berat molekul jika, pada voltan yang ditetapkan, cara boleh didapati untuk mengecas molekul ini pada tahap yang sama dan pada tanda yang sama. Di bawah keadaan ini, mobiliti molekul akan berkadar songsang dengan saiznya.

Idea inilah yang dieksploitasi dalam PAGE untuk memisahkan polipeptida mengikut berat molekulnya. Dalam PAGE, protein dicas secara negatif oleh pengikatan detergen anionik SDS (sodium dodecyl sulfate) diasingkan dalam matriks gel poliakrilamida dalam medan elektrik mengikut berat molekulnya.
Poliakrilamida terbentuk melalui pempolimeran molekul monomer-akrilamida yang disambung silang oleh N,N'-methylene-bis-acrylamide (disingkat BIS). Radikal bebas yang dihasilkan oleh ammonium persulfate (APS) dan mangkin yang bertindak sebagai penyerap oksigen (-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine [TEMED]) diperlukan untuk memulakan pempolimeran kerana akrilamida dan BIS tidak reaktif dengan sendirinya atau apabila dicampur bersama.

Kelebihan tersendiri sistem gel akrilamida ialah kepekatan awal akrilamida dan BIS mengawal kekerasan dan tahap penghubung silang gel. Kekerasan gel pula mengawal geseran yang dialami oleh makromolekul semasa ia bergerak melalui gel dalam medan elektrik, dan oleh itu mempengaruhi resolusi komponen yang akan diasingkan. Gel keras (12-20% akrilamida) melambatkan penghijrahan molekul besar lebih banyak daripada molekul kecil. Dalam kes tertentu, gel akrilamida berkepekatan tinggi sangat ketat sehingga ia mengecualikan molekul besar daripada memasuki gel tetapi membenarkan penghijrahan dan resolusi komponen berat molekul rendah bagi campuran kompleks. Sebagai alternatif, dalam gel longgar (4-8% akrilamida), molekul berat molekul tinggi berhijrah lebih jauh ke bawah gel dan, dalam beberapa keadaan, boleh bergerak terus keluar dari matriks.

SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Sodium dodecyl sulfate (SDS atau sodium lauryl sulfate) ialah detergen anionik yang menyahturasi molekul protein tanpa memecahkan ikatan peptida. Ia mengikat kuat kepada semua protein dan mencipta nisbah cas:jisim yang sangat tinggi dan malar untuk semua protein yang didenaturasi. Selepas rawatan dengan SDS, tanpa mengira caj asalnya, semua protein memperoleh cas negatif yang tinggi.

Denaturasi protein dilakukan dengan memanaskannya dalam penimbal yang mengandungi agen penurun tiol larut (cth. 2-mercaptoethanol dithiothreitol) dan SDS. Mercaptoethanol mengurangkan semua ikatan disulfida sisa sistein kepada kumpulan sulfhidril yang membebaskan, dan pemanasan dalam SDS mengganggu semua interaksi protein intra dan antara molekul. Rawatan ini menghasilkan rantai polipeptida individu yang membawa lebihan cas negatif yang disebabkan oleh pengikatan detergen, dan nisbah cas:jisim yang sama. Selepas itu, protein yang didenaturasi boleh diselesaikan secara elektroforesis dengan ketat berdasarkan saiz dalam gel poliakrilamida buffer yang mengandungi SDS dan agen pengurangan tiol.

Sistem gel SDS-PAGE amat berguna dalam menganalisis dan menyelesaikan campuran protein kompleks. Banyak aplikasi dan pengubahsuaian teknik ini berkaitan dengan ahli biologi eksperimen moden. Ada yang disebut di bawah. Mereka digunakan untuk memantau penulenan enzim, untuk menentukan komposisi subunit protein oligomerik, untuk mencirikan komponen protein organel dan membran subselular, dan untuk memberikan protein khusus kepada gen tertentu dengan membandingkan ekstrak protein organisma jenis liar dan mutan yang boleh ditindas. Di samping itu, mobiliti polipeptida dalam sistem gel SDS-PAGE adalah berkadar dengan songsangan log berat molekulnya. Sifat ini memungkinkan untuk mengukur berat molekul protein yang tidak diketahui dengan ketepatan +/- 5%, dengan cepat, murah dan boleh dihasilkan semula.

Elektroforesis Gel Poliakrilamida SDS tidak berterusan

Gel cakera dibina dengan dua gel akrilamida yang berbeza, satu di atas yang lain. Gel bahagian atas atau tindanan mengandungi 4-5% akrilamida (gel yang sangat longgar) yang ditimbal dengan lemah pada pH 9.0. Gel peleraian yang lebih rendah (sering dipanggil gel lari), mengandungi kepekatan akrilamida yang lebih tinggi, atau kecerunan akrilamida, terbuffer kuat pada pH 9.0. Kedua-dua gel boleh dituang sebagai tiub dalam kaca atau silinder plastik (gel tiub), atau sebagai papak nipis dalam plat kaca, susunan yang meningkatkan resolusi dengan ketara, dan yang memungkinkan untuk menganalisis dan membandingkan banyak sampel protein sekaligus, dan pada gel yang sama (gel papak). Hari ini, anda akan membina dan menjalankan gel papak.

Ketakselanjaran kekuatan ionik antara gel susun longgar dan gel larian keras membawa kepada ketakselanjaran voltan apabila arus dikenakan. Matlamat gel ini adalah untuk memaksimumkan resolusi molekul protein dengan mengurangkan dan menumpukan sampel ke zon ultranipis (1-100 nm) pada gel tindanan: sempadan gel berjalan. Sampel protein digunakan dalam perigi dalam gel susun sebagai lajur cecair yang agak panjang (0.2-0.5 cm) bergantung pada jumlah dan ketebalan gel atau tiub. Sampel protein mengandungi gliserol atau sukrosa supaya ia boleh ditindih dengan penimbal berjalan. Penampan ini dipanggil penampan berjalan, dan susunannya sedemikian rupa sehingga bahagian atas dan bawah gel berada dalam penampan berjalan untuk membuat litar.

Apabila arus digunakan, protein mula berhijrah ke bawah melalui gel penyusun ke arah kutub positif, kerana ia dicas negatif oleh SDS terikat. Oleh kerana gel penyusun sangat longgar, protein berat molekul yang rendah dan sederhana tidak terhalang dalam penghijrahannya dan bergerak lebih cepat daripada dalam gel yang sedang berjalan. Di samping itu, kekuatan ion yang lebih rendah daripada gel penyusun (penampan lemah) mencipta rintangan elektrik yang tinggi, (iaitu, medan elektrik yang tinggi V/cm) untuk membuat protein bergerak lebih cepat daripada dalam gel yang sedang berjalan (kekuatan ionik yang tinggi, rintangan yang lebih rendah, maka medan elektrik yang lebih rendah, V/cm). Ingat bahawa voltan yang digunakan menghasilkan aliran arus dalam gel melalui penghijrahan ion. Oleh itu kekuatan ion yang rendah bermakna rintangan yang tinggi kerana lebih sedikit ion hadir untuk melesapkan voltan dan medan elektrik (V/cm) meningkat menyebabkan protein yang sangat polianionik berhijrah dengan cepat.

Penghijrahan pesat protein melalui gel tindanan menyebabkan mereka terkumpul dan bertindan sebagai zon yang sangat nipis pada sempadan gel susun/gel berjalan, dan yang paling penting, kerana gel tindanan 4-5% menjejaskan mobiliti komponen besar hanya sedikit. , timbunan disusun mengikut urutan mobiliti protein dalam campuran. Kesan susun ini menghasilkan resolusi yang lebih baik dalam gel berjalan, di mana polipeptida masuk dan berhijrah dengan lebih perlahan, mengikut saiz dan bentuknya.

Dalam semua sistem gel, pewarna pengesanan (biasanya biru Bromophenol) diperkenalkan bersama sampel protein untuk menentukan masa di mana operasi harus dihentikan. Bromophenol blue ialah molekul kecil yang bergerak secara asasnya tanpa halangan hanya di belakang hadapan ion yang bergerak ke bawah ke arah bahagian bawah gel. Beberapa molekul protein bergerak mendahului pewarna pengesan ini. Apabila bahagian hadapan pewarna mencapai bahagian bawah gel yang sedang berjalan, arus dimatikan untuk memastikan bahawa protein tidak elektroforesis keluar dari gel ke dalam tangki penimbal.

Menggambarkan Protein

Gel dikeluarkan dari tiub atau dari plat kaca dan diwarnai dengan pewarna, Coomassie Brilliant Blue. Coomassie blue mengikat kuat kepada semua protein. Pewarna yang tidak terikat dikeluarkan dengan membasuh gel secara meluas. Jalur protein biru selepas itu boleh dikesan dan dikira kerana jumlah pewarna terikat adalah berkadar dengan kandungan protein. Gel berwarna boleh dikeringkan dan dipelihara, difoto atau diimbas dengan densitometer rakaman untuk mengukur keamatan warna dalam setiap jalur protein. Sebagai alternatif, jika protein adalah radioaktif, jalur protein boleh dikesan oleh autoradiografi, teknik yang digunakan secara meluas dalam biologi sel dan molekul moden. Apabila gel disediakan sebagai papak nipis untuk memaksimumkan resolusi seperti yang anda lakukan hari ini, papak akrilamida dikeluarkan daripada plat kaca sokongan dan dikeringkan di atas kertas penapis. Sekeping filem X-ray diletakkan dan diapit ketat di atas papak kering dalam kotak kalis cahaya. Filem sinar-X terdedah oleh radioaktiviti dalam jalur protein dan, selepas berkembang, bintik atau jalur gelap boleh dilihat pada filem. Jalur gelap ini seterusnya boleh dikira kerana keamatannya adalah berkadar dengan jumlah radioaktiviti dan oleh itu dengan kandungan protein.


Bagaimanakah SDS-PAGE dipisahkan berdasarkan jisim? - Biologi

SDS-HALAMAN, natrium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforesis, adalah teknik yang digunakan secara meluas dalam biokimia, forensik, genetik dan biologi molekul untuk memisahkan protein mengikut mobiliti elektroforetik mereka .The.
Artikel penuh >>>

SDS elektroforesis gel poliakrilamida ( ¦es¦dē¦es ′pälēə¦kriləmīd ′jel i′lektrōfə′rēsəs ) . 3 Mengurangkan SDS-HALAMAN. 4 Elektroforesis dan pewarnaan. 5 Perak .
Artikel penuh >>>

Tujuan SDS-HALAMAN adalah untuk mengasingkan protein mengikut saiznya, dan tidak. SDS-HALAMAN mengasingkan protein berdasarkan struktur atau saiz utamanya tetapi tidak .
Artikel penuh >>>

Apabila menjalankan sebuah SDS-HALAMAN, kami tidak pernah membiarkan protein elektroforesis (berjalan) begitu lama. SDS-HALAMAN mengasingkan protein berdasarkan saiz struktur utamanya tetapi tidak .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN bermaksud elektroforesis gel sodium dodecyl (lauryl) sulfate-polyacrylamide. . begini caranya SDS-HALAMAN memisahkan molekul protein yang berbeza .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN Elektroforesis Gel. Bagaimana untuk menjalankan gel untuk protein. . SDS-HALAMAN, natrium dodesil sulfat poliakrilamida elektroforesis gel, adalah .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN, secara rasmi natrium dodesil sulfat poliakrilamida elektroforesis gel, . Untuk protokol terperinci lihat SDS-HALAMAN protokol .
Artikel penuh >>>

SDS-Elektroforesis Gel Poliakrilamida (SDS-HALAMAN) mungkin adalah yang paling banyak di dunia. Selepas kertas-kertas ini muncul SDS-HALAMAN gel menjadi sangat popular, pertama dalam tiub, .
Artikel penuh >>>

SDS HALAMAN Rujukan "Elektroforesis gel papak" 2000 F. W. Kajian Trend Biochem. . © 2001, 2006, 2008 T.G. Chasteen. SDS HALAMAN .
Artikel penuh >>>

Pemisahan protein oleh SDS-HALAMAN boleh digunakan untuk menganggar jisim molekul relatif, . SDS-HALAMAN boleh dijalankan pada gel pra-tuang, menjimatkan masalah dan bahaya .
Artikel penuh >>>

Nature Protocols ialah sumber dalam talian interaktif untuk semua protokol makmal. Rajah 2: Tricine–SDS-HALAMAN protein penanda menggunakan pelbagai jenis gel. .
Artikel penuh >>>

Dalam SDS-elektroforesis gel poliakrilamida (SDS-HALAMAN), protein diasingkan . SDS walau bagaimanapun menyalahkan protein, jadi kesan aktiviti tidak boleh digunakan untuk .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN. Elektroforesis gel dua dimensi. Elektroforesis gel kecerunan suhu . SDS-HALAMAN autoradiografi - Protein yang ditunjukkan terdapat dalam .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN. oleh Michael Koelle. 20% SDS (ada orang tapis) . Ini mengendap SDS, jadi kumpulan itu kelihatan putih dengan latar belakang hitam. .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN ialah protokol biologi molekul yang biasa digunakan yang membolehkan . c. Isi ruang dalam (antara dua gel) dengan SDS-HALAMAN Penampan. .
Artikel penuh >>>

Untuk memahami bagaimana SDS-HALAMAN boleh digunakan untuk menentukan jisim molekul protein . Dalam SDS-HALAMAN, matriks gel ialah papak berliang nipis yang dibentuk oleh pempolimeran.
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN. SDS-HALAMAN: elektroforesis gel protein . 20% SDS 3 ml. Gliserol (100%) 3 ml. B-mercaptoethanol 1.6 ml . SDS 10 g. jadikan kepada 1L dengan dH2O .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN (elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida) ialah . Bagaimana SDS-HALAMAN berfungsi. Bar Ralat dalam Biologi. Hiburan Makmal Lewat Malam .
Artikel penuh >>>

Bagaimanakah rupa pecahan selular pada SDS-HALAMAN gel? . Mengira SDS-HALAMAN masa berjalan - (balas: 4) Saya SDS-HALAMAN pemuatan menjadi oren semasa .
Artikel penuh >>>

SDS-HALAMAN - Definisi. Gambar sebuah SDS-HALAMAN. Penanda molekul berada di lorong kiri. SDS-HALAMAN bermaksud Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel .
Artikel penuh >>>


SDS-PAGE – Pemisahan Protein Berasaskan Gel

SDS-PAGE ialah kaedah mengasingkan protein berdasarkan jisim molekulnya. SDS (sodium dodecyl sulfate) ialah detergen yang mengikat protein dan menutupnya dengan cas negatif. Secara umum, satu molekul SDS mengikat dua asid amino. Selepas pendedahan kepada SDS protein yang berbeza akan mempunyai cas yang hampir sama dengan nisbah jisim kerana SDS menyaluti protein dalam cas negatif mengatasi apa-apa cas intrinsik yang terdapat pada asalnya. Akronim PAGE bermaksud elektroforesis gel poliakrilamida. Campuran protein didenaturasi dengan menambahkan SDS dan beta-mercaptoethanol (digunakan untuk memecahkan ikatan disulfida) dan kemudian dipanaskan. Campuran protein yang didenaturasi ditambah kepada gel poliakrilamida di mana medan elektrik digunakan dan protein, yang kini disalut dengan cas negatif, bergerak ke arah elektrod positif (anod).

Protein bergerak melalui gel berdasarkan saiznya. Gel poliakrilamida boleh dianggap sebagai satu siri jaring yang disusun di atas satu sama lain. Semakin tinggi peratusan poliakrilamida semakin banyak jaring yang ada dan saiz lubang antara rantai poliakrilamida menjadi lebih kecil menjadikannya lebih sukar untuk protein bergerak melaluinya. Jika anda ingin mengasingkan protein yang agak kecil, peratusan poliakrilamida yang lebih tinggi harus digunakan. Jika seseorang perlu mengasingkan protein yang lebih besar peratusan poliakrilamida yang lebih kecil akan digunakan. Oleh kerana penimbal sampel mengandungi pewarna biru yang mengikat protein, protein yang dipisahkan oleh SDS-PAGE membentuk jalur biru yang mudah dilihat.

SDS-PAGE sering digunakan sebagai langkah kawalan kualiti untuk biofarmaseutikal. Produk protein tulen dengan rantai tunggal harus menunjukkan hanya satu jalur menggunakan SDS-PAGE. Sebarang jalur tambahan akan menjadi bahan cemar atau produk degradasi. SDS-PAGE juga merupakan langkah pertama dalam mencipta western blot yang boleh digunakan untuk mengenal pasti protein tertentu dalam campuran.


Varian

SDS-PAGE ialah kaedah yang paling banyak digunakan untuk pengasingan elektroforetik gel bagi protein. Elektroforesis gel dua dimensi secara berurutan menggabungkan pemfokusan isoelektrik atau BAC-PAGE dengan SDS-PAGE. Native PAGE digunakan jika lipatan protein asli ingin dikekalkan. Untuk pengasingan protein membran, BAC-PAGE atau CTAB-PAGE boleh digunakan sebagai alternatif kepada SDS-PAGE. Untuk pemisahan elektroforesis kompleks protein yang lebih besar, elektroforesis gel agarose boleh digunakan, cth. SDD-AGE. Sesetengah enzim boleh dikesan melalui aktiviti enzim mereka dengan zymography.


Apabila protein dipisahkan oleh elektroforesis melalui matriks gel, protein yang lebih kecil berhijrah lebih cepat kerana rintangan yang kurang daripada matriks gel. Pengaruh lain pada kadar migrasi melalui matriks gel termasuk struktur dan caj protein.

Dalam SDS-PAGE, penggunaan natrium dodesil sulfat (SDS, juga dikenali sebagai natrium lauril sulfat) dan gel poliakrilamida sebahagian besarnya menghapuskan pengaruh struktur dan cas, dan protein dipisahkan semata-mata berdasarkan panjang rantai polipeptida.

SDS ialah detergen dengan kesan pendenaturan protein yang kuat dan mengikat pada tulang belakang protein pada nisbah molar yang tetap. Dengan adanya SDS dan agen pengurangan yang memecahkan ikatan disulfida yang penting untuk lipatan yang betul, protein terbentang menjadi rantai linear dengan cas negatif berkadar dengan panjang rantai polipeptida.

Akrilamida berpolimer (polyacrylamide) membentuk matriks seperti mesh yang sesuai untuk pemisahan protein saiz biasa. Kekuatan gel membolehkan pengendalian mudah. Elektroforesis gel poliakrilamida bagi protein yang dirawat SDS membolehkan penyelidik mengasingkan protein berdasarkan panjangnya dengan cara yang mudah, murah dan agak tepat.


Bagaimana kepekatan gel mempengaruhi mobiliti relatif

Jadi apa yang berlaku jika anda ingin mencirikan semua protein dalam sampel? . menjalankan lebih daripada satu gel, sudah tentu! Gel dengan ketumpatan rendah akan menyelesaikan polipeptida yang lebih besar sambil memotong yang lebih ringan, dan satu ketumpatan yang lebih tinggi akan mendedahkan polipeptida yang lebih kecil, sambil memampatkan dan mungkin memesongkan yang lebih besar.

Berikut adalah beberapa contoh kesan kepekatan akrilamida pada mobiliti relatif. Piawaian berat molekul dikenal pasti dengan nombor. Sampel protein membran eritrosit biasa juga dibentangkan, dengan protein jalur 3 dilabelkan sebagai rujukan.

Standard 1 = myosin (205,000) std. 2 = beta-galactosidase (116,000) std. 3 = fosforilase B (92,000) std. 4 = albumin serum lembu (66,000) std. 5 = albumin telur (45,000) std. 6 = karbonik anhidrase (29,000).

Pada gel dari 6 hingga 10% terdapat doublet gelap yang berbeza di bahagian atas lorong membran. Perhatikan dalam gel 12%, doublet tersekat bersama dan muncul sebagai satu jalur. Seseorang boleh menganggarkan MW jalur 3 daripada lima gel pertama walaupun anggaran terbaik datang daripada 6%, yang menghasilkan pemisahan terbesar antara piawai pada kedua-dua belah jalur 3. Gel 12% tidak menyelesaikan jalur dengan baik sama sekali di atas standard keempat (albumin serum, 66,000). Analisis hendaklah terhad kepada bahagian gel di bawah 66,000 atau lebih rendah jika sampel yang sama dijalankan pada gel berketumpatan lebih rendah.

Selalunya, pelajar menganalisis bahagian atas gel akrilamida berketumpatan tinggi yang bertindih sebahagian daripada gel berketumpatan rendah. Amalan itu menunjukkan bahawa pelajar terlepas titik anasis dan/atau tidak memahami batasan kaedah. Tafsir hanya bahagian gel yang lebih padat yang tidak bertindih dengan yang lain. Dengan kata lain, gunakan gel berketumpatan tinggi untuk mengkaji protein (atau bahagian protein) dengan berat molekul yang agak rendah, dan gel berketumpatan lebih rendah untuk menyelesaikan protein dengan berat molekul yang lebih tinggi.

Jangan lupa bahawa polipeptida yang berbeza boleh mempunyai jisim molekul yang serupa atau sama. Oleh itu, satu jalur pada gel boleh terdiri daripada satu atau lebih polipeptida. Ini berkemungkinan besar berlaku pada bahagian atas gel, dan terutamanya dalam gel berketumpatan lebih tinggi.


Penyediaan lysate

Lisis sel adalah langkah pertama dalam pengekstrakan protein, pecahan dan penulenan. Banyak teknik telah dibangunkan untuk mendapatkan hasil dan ketulenan yang terbaik untuk organisma yang berbeza, jenis sampel (sel atau tisu), struktur subselular atau protein tertentu. Kedua-dua kaedah fizikal dan berasaskan reagen mungkin diperlukan untuk mengekstrak protein selular kerana kepelbagaian jenis sel dan komposisi membran sel (atau dinding sel).

Lysis

Lisis fizikal ialah kaedah biasa bagi gangguan sel dan pengekstrakan kandungan selular. Walau bagaimanapun, ia memerlukan peralatan dan protokol khusus yang sukar untuk diulang kerana kebolehubahan dalam radas (cth., alu dounce yang berbeza atau tetapan sonikasi). Selain itu, kaedah gangguan fizikal tradisional lazimnya tidak kondusif kepada volum sampel yang kecil dan pengendalian sampel berkemampuan tinggi. Akhirnya, kaedah lisis fizikal sahaja tidak dapat melarutkan protein yang berkaitan dengan membran. Sebaliknya, kaedah lisis berasaskan reagen menggunakan detergen bukan sahaja melisiskan sel tetapi juga melarutkan protein. Dengan menggunakan penimbal, detergen, garam dan agen pengurangan yang berbeza, lisis sel boleh dioptimumkan untuk memberikan hasil yang terbaik untuk jenis sel atau pecahan protein tertentu.

Kestabilan protein

Lisis sel mengganggu petak selular, yang boleh mengaktifkan protease endogen dan fosfatase. Untuk melindungi protein yang diekstrak daripada degradasi atau pengubahsuaian artifak oleh aktiviti enzim ini, adalah perlu untuk menambah perencat protease dan/atau fosfatase kepada reagen lisis.

Apabila matlamat lisis sel adalah untuk membersihkan atau menguji fungsi protein tertentu, perhatian khusus mesti diberikan kepada kesan reagen lisis terhadap kestabilan dan fungsi protein sasaran. Detergen tertentu akan menyahaktifkan fungsi enzim tertentu atau mengganggu kompleks protein. Analisis hiliran protein yang diekstrak/dimurnikan juga mungkin memerlukan penyingkiran detergen untuk mengkaji protein yang diminati atau mengekalkan kestabilan jangka panjang protein yang diekstrak.

Penipisan dan pengayaan

Kerumitan sampel memberi kesan negatif terhadap keupayaan untuk mengesan, mengenal pasti dan mengira protein kelimpahan rendah oleh MS, kerana peptida daripada protein kelimpahan tinggi boleh menutup pengesanan protein yang mengandungi kelimpahan rendah. Oleh itu, semakin banyak sampel boleh dipermudahkan dan semakin besar julat dinamik kepekatan protein dapat dikurangkan, semakin besar keupayaan untuk mengesan protein pada kepekatan yang sangat rendah.

Strategi penyusutan dan pengayaan telah dibangunkan untuk mengeluarkan protein yang banyak tinggi atau mengasingkan protein sasaran dalam sampel, masing-masing. Penyusutan lebih kerap digunakan untuk mengurangkan kerumitan sampel biologi seperti darah atau serum, yang mengandungi kepekatan tinggi albumin dan imunoglobulin. Strategi penyusutan menggunakan teknik immunoaffinity seperti immunoprecipitation dan co-imunoprecipitation (masing-masing IP dan co-IP), dan kit komersil tersedia untuk mengalih keluar ini dan lain-lain protein berlimpah tinggi daripada sampel. Kelemahan yang ketara kepada pendekatan ini, bagaimanapun, ialah protein yang banyak sering mengikat kepada protein lain, yang boleh mengakibatkan pengurangan kompleks dengan protein yang rendah.

Pengayaan protein merangkumi pelbagai teknik untuk mengasingkan subkelas protein selular berdasarkan aktiviti biokimia yang unik, pengubahsuaian pasca translasi (PTM) atau penyetempatan ruang dalam sel. Pengubahsuaian selepas translasi seperti fosforilasi dan glikosilasi boleh diperkaya menggunakan ligan afiniti seperti kromatografi pertalian ion-logam (IMAC) atau lektin tidak bergerak, masing-masing. Di samping itu, antibodi khusus PTM telah digunakan. Teknik lain memerlukan penggabungan metabolik atau enzimatik asid amino atau PTM yang diubah suai untuk memperkenalkan kimia protein unik yang boleh digunakan untuk pengayaan. Akhirnya, protein juga boleh diperkaya menggunakan pelbagai sebatian khusus kelas enzim atau reagen pelabelan tak telap sel yang secara selektif melabelkan protein permukaan sel.

Pengasingan pecahan subselular yang berbeza ialah satu lagi kaedah pengayaan dan boleh dicapai melalui pengoptimuman teliti teknik gangguan fizikal, larutan detergen-penampan dan kaedah kecerunan ketumpatan. Contohnya, dengan detergen pemisah fasa, protein membran hidrofobik boleh dilarutkan dan diekstrak daripada protein hidrofilik. Density gradient centrifugation is another technique and can be used to isolate intact nuclei, mitochondria and other organelles before protein solubilization.

Dialysis and desalting

Whether they are simple or complex, samples often need to be processed in several ways to ensure they are compatible and optimized for digestion and analysis by mass spectrometry. For example, because MS measures charged ions, salts—especially sodium and phosphate salts—should be removed prior to MS to minimize their detection.

Dialysis and desalting products allow buffer exchange, desalting, or small molecule removal to prevent interference with downstream processes. Protein assays help monitor protein concentration for consistent control of experimental loading or yield.


Tonton videonya: 05 SDS PAGE Gel Disassembly (November 2022).