Maklumat

B1. Pengikatan Ligan Tunggal - Biologi

B1. Pengikatan Ligan Tunggal - Biologi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Derivasi dan graf berikut diterbitkan daripada persamaan untuk ketepuan pecahan (Y = [L]/(K_d + [L])). Begitu juga, pertimbangkan ralat berterusan dalam L

Kesesuaian Hiperbolik

Untuk keseimbangan:

[ M + L ightleftharpoons ML,]

dengan

[ [ML] = dfrac{[M_o][L]}{K_d+ [L]} ]

atau dinyatakan dalam sebutan ketepuan pecahan (Y)

[ Y = dfrac{[L]}{K_d+ [L]}.]

Plot (Y) lwn. (L) memberikan hiperbola, seperti yang ditunjukkan dalam rajah di bawah.

Rajah: Hiperbola

Ambil perhatian bahawa bar ralat malar ditunjukkan pada rajah juga. Ingat, anda tidak boleh dengan mudah menentukan Kd daripada padanan hiperbolik (Kd = L pada separuh tepu) melainkan anda telah benar-benar mencapai ketepuan. Cara yang lebih baik untuk menentukan Kd daripada data pengikatan hiperbolik adalah dengan benar-benar menyesuaikan semua data kepada persamaan untuk hiperbola menggunakan program regresi bukan linear, seperti yang terdapat dalam Mathcad. Ingat, bagaimanapun, data yang buruk masih boleh dimuatkan.

Mathcad 8 - Kesesuaian Hiperbolik Tak Linear. A: Mo dan Kd | B: Kd

PLOT BERGANDA TALI: FIT TO PERSAMAAN REGRESI LINEAR.

[ dfrac{1}{Y} = dfrac{K_d + L}{L} = dfrac{K_d}{L} + 1]

Plot dua salingan ini ialah bentuk (y = mx + b), dengan (y = 1/Y), m = (K_d), x = 1/L dan (b = 1 ).

Rajah: plot timbal balik berganda

Perhatikan dalam hal ini bahawa ralat tidak tetap. Ini mudah ditunjukkan oleh contoh berikut.

  • Jika Y = 1 +/- 0.02 (seperti dalam contoh di atas), maka Y boleh berbeza dari 0.98 - 1.02 (julat 0.04). 1/Y berbeza daripada 1/1.02 - 1/0.98 atau 0.98 - 1.02. (julat 0.04)
  • Jika, Y = 0.1 +/- 0.02, maka Y boleh berubah daripada 0.08 -0.12, julat sekali lagi 0.04. Tetapi sekarang, 1/Y akan berbeza daripada 1/0.12 - 1/0.08, atau 8.33 - 12.5, (julat 4.17! Perhatikan bahawa apabila Y lebih kecil, I/Y menjadi lebih besar dan ralat "sampul surat" menjadi lebih besar.

Anda tidak boleh menggunakan analisis regresi linear secara sah pada plot salingan berganda garis lurus, kerana ralat pada setiap titik tidak tetap. Anda boleh menggunakan analisis LR untuk menentukan cerun jika anda boleh menimbang setiap titik secara berbeza. Jelas sekali dalam kes ini, nilai Y yang lebih tinggi atau nilai 1/Y yang lebih rendah akan ditimbang lebih. Memandangkan ketersediaan atur cara komputer untuk memasang persamaan bukan linear, plot salingan berganda linear tidak selalu digunakan untuk mengekstrak nilai terbaik Kd. Walau bagaimanapun, ia amat berguna dalam mendapatkan anggaran Kd yang kemudiannya boleh digunakan dalam padanan tidak linear seperti yang diterangkan dalam A. Selain itu, ia masih mempunyai penggunaan meluas dalam analisis visual keluk ikatan berbilang tanpa kehadiran dan kehadiran kepekatan berbeza perencat pengikatan. Kita akan melihat penggunaan ini kemudian apabila kita mengkaji kinetik enzim.

Plot Scatchard

[ frac{Y}{K_d + L} = L ]

atau

[ dfrac{Y}{K_d}+ YL = L ]

atau

[ Y,K_d = L - YL = L (1 - Y) ]

yang memberi

[ dfrac{Y}{L} = dfrac{1-Y}{K_d} = dfrac{-Y}{K_d} + dfrac{1}{K_d}]

Persamaan ini, dikenali sebagai persamaan Scatchard, adalah dalam bentuk (y = mx + b),

dengan

  • (y = dfrac{Y}{L}),
  • (x = Y),
  • (m = dfrac{-1}{K_d}), dan
  • (b = dfrac{1}{K_d}).

Rajah: Persamaan Scatchard

Jika kita menganggap seperti di atas terdapat ralat dalam Y (atau istilah B terikat) dan bukan L, maka kedua-dua paksi mesti mempunyai ralat yang boleh dikaitkan dengan istilah Y. Perihalan analisis ralat berikut dalam plot Scatchard dan graf di atas telah disumbangkan oleh George Dombi di Universiti Rhode Island. "Satu-satunya kepekatan yang mempunyai bar ralat menegak ialah kepekatan bebas sifar. Bar ralat harus berjalan pada garis yang terpancar dari asal melalui titik yang diplot itu sendiri (titik biru dalam graf di atas). Garis ini semakin mendatar pada tahap Ligand bebas yang lebih tinggi. Inilah yang menjadikan penggunaan plot Scatchard menjadi masalah apabila cuba membedah dua atau lebih garis pengikat tunggal daripada data secara visual." Kaedah pemasangan ini adalah salah satu yang paling disalahgunakan.

Perhatikan bahawa Y/L nampaknya pergi ke 0/0 apabila L menghampiri 0. Nilai had sebenar ini boleh ditentukan daripada peraturan l'Hopital: nisbah had diberikan oleh had terbitan pengangka (Y) dibahagikan dengan terbitan penyebut (L). Nilai ini ialah 1/Kd.

Plot Scatchard Curvilinear sering diperhatikan. Ini boleh disebabkan oleh beberapa sebab, termasuk:

  • campuran dua M yang berbeza, dengan Kd yang berbeza
  • M mengikat lebih daripada 1 ligan dengan Kd yang berbeza
  • M mengikat lebih daripada 1 ligan di mana pengikatan yang pertama mengurangkan Kd untuk kedua (kerjasama positif) atau sebaliknya (kerjasama negatif).

PLOT SEPARUH LOG:

Cara terbaik untuk memvisualisasikan sama ada ketepuan dicapai adalah dengan memplot Y vs log L memandangkan plot naik curam dan dataran tinggi dengan cepat berbanding plot hiperbolik yang dataran tinggi perlahan-lahan.

Rajah: Y lwn log L

Kedua, adalah logik untuk memplot Y vs log L kerana tahap pengikatan ditentukan oleh potensi kimia L dan M, dan potensi kimia L adalah berkadar dengan log L. Walaupun anda mendapat kesesuaian bukan linear yang baik untuk hiperbola (seperti dalam A di atas), anda harus melakukan plot Y vs log L untuk melihat sejauh mana anda hampir dengan ketepuan.

Kita boleh memikirkan sifat plot Y vs log L dengan membandingkannya dengan keputusan yang kami peroleh menggunakan persamaan Henderson-Hasselbach. Daripada persamaan itu, kita boleh mengira, memandangkan pH, keadaan protonasi asid. Kami menentukan bahawa jika pH adalah 2 unit di bawah pKa, nisbah [HA]/[A-] = 100/1 atau kira-kira 100% asid telah terprotonasi. Begitu juga, jika pH adalah 2 unit di atas pKa, nisbah [HA]/[A-] = 1/100 atau kira-kira 100% asid telah terdeprotonasi. Jika pH = pKa, 50% asid telah terprotonasi. Dalam contoh ini kita benar-benar melihat ketepuan pecahan asid (iaitu berapa banyak yang terikat kepada proton) sebagai fungsi log L di mana L ialah [H3O+].

Sekarang mari gunakan ini pada keseimbangan (M + L ightleftharpoons ML). Kami ingin mengetahui berapa banyak yang terikat, atau ketepuan pecahan, sebagai fungsi log L. Pertimbangkan tiga contoh.

  1. L = 0.01 (K_d)(iaitu L << Kd), yang membayangkan bahawa (K_d)= 100L. Kemudian Y = L/[Kd+L] = L/[100L + L] ≈1/100. Ini membayangkan bahawa tanpa mengira [L] sebenar, jika L = 0.01 (K_d), maka Y ≈0.01.
  2. L = 100 (K_d)(iaitu L >> Kd), yang membayangkan bahawa (K_d)= L/100. Kemudian Y = L/[Kd+L] = L/[(L/100) + L] = 100L/101L ≈ 1. Ini menunjukkan bahawa tanpa mengira [L] sebenar, jika L = 100 (K_d), maka Y ≈1.
  3. L = (K_d), kemudian Y = 0.5

Senario ini menunjukkan bahawa jika L berubah melebihi 4 tertib magnitud (0.01Kd < (K_d) < 100Kd), atau, dalam istilah log, daripada -2 + log (K_d)< log (K_d)< 2 + log Kd), tanpa mengira magnitud (K_d), bahawa Y berbeza dari kira-kira 0 - 1. Dalam erti kata lain, Y berbeza dari 0-1 apabila L berbeza daripada log (K_d) dengan +2. Oleh itu, plot Y vs log L untuk satu siri tindak balas pengikatan yang semakin tinggi (K_d)(perkaitan yang lebih rendah) akan mendedahkan satu siri lengkung sigmoid yang sama beralih secara progresif ke kanan. Ini ditunjukkan dalam rajah di bawah.

Rajah: Y lwn Log L, nilai Kd yang berbeza

Pemain CDF Wolfram Mathematica - Graf Interaktif Y lwn log L pada nilai Kd berbeza (pemalam percuma diperlukan)

NOTA: Saya telah memperoleh persamaan dan plot di atas menggunakan pembolehubah Y dan L. Ingat, Y = ML/Mo. Saya boleh dengan mudah menggantikan ML/Mo ialah semua persamaan di atas, dan mendapatkan plot menggunakan ML dan L. Mo, pemalar, kemudiannya akan difaktorkan ke dalam sebutan cerun dan memintas.


Pembedahan molekul tunggal ligan yang mengikat protein dengan dinamik intrinsik

Dinamik protein telah dicadangkan mempunyai peranan penting dalam pengecaman biomolekul, tetapi mekanisme molekul yang tepat masih tidak jelas. Di sini, kami melakukan pengukuran pemindahan tenaga resonans pendarfluor molekul tunggal untuk protein pengikat maltosa jenis liar (MBP) dan variannya untuk menunjukkan interaksi dinamik konformasi dan pengiktirafan molekul. Analisis kinetik memberikan bukti langsung bahawa MBP mengiktiraf ligan melalui mekanisme 'induced-fit', bukan melalui mekanisme pemilihan umum yang dicadangkan untuk protein dengan dinamik konformasi seperti MBP. Keputusan kami menunjukkan bahawa kehadiran dinamik intrinsik semata-mata tidak mencukupi untuk mekanisme 'pemilihan'. Analisis bertenaga bagi pengikatan ligan melibatkan peranan kritikal dinamik konformasi dalam memudahkan perubahan struktur yang berlaku apabila pengikatan ligan.


Keputusan

Kestabilan Mekanikal NuG2 Dipertingkatkan Dengan Pengikatan hFc.

NuG2 ialah mutan GB1 yang direka secara pengiraan oleh kumpulan David Baker (University of Washington, Seattle, WA), dan struktur tiga dimensinya sangat serupa dengan jenis liar (wt)-GB1 (24). Walaupun struktur tiga dimensi kompleks NuG2/hFc tidak diketahui, adalah dijangkakan bahawa struktur NuG2/hFc akan sangat serupa dengan wt-GB1/Fc. Untuk mencirikan kestabilan mekanikal NuG2, kami membina poliprotein (NuG2)8, yang terdiri daripada lapan ulangan tandem yang sama bagi domain NuG2. Meregangkan poliprotein (NuG2)8 menghasilkan perhubungan daya-sambungan bagi penampilan corak gigi gergaji ciri, di mana puncak gigi gergaji individu sepadan dengan peristiwa terungkap mekanikal berurutan bagi domain NuG2 individu dalam rantai poliprotein (Rajah 1). A). Puncak daya terungkap adalah sama jaraknya. Kesesuaian model rantai seperti cacing (WLC) keanjalan polimer (25) pada puncak daya terbentang berturut-turut (garis merah) mengukur kenaikan panjang kontur (ΔLc) daripada ≈18.0 nm untuk pembukaan mekanikal NuG2, dalam persetujuan yang baik dengan nilai jangkaan untuk pembukaan mekanikal NuG2. ΔLc ialah sifat struktur intrinsik bagi protein tertentu (7) dan berfungsi sebagai cap jari untuk kita mengenal pasti pembukaan mekanikal NuG2. Oleh kerana domain NuG2 dalam rantai poliprotein adalah sama antara satu sama lain, pembukaan mekanikal domain NuG2 berlaku pada daya yang sama. Purata daya terungkap domain NuG2 ialah 105 ± 20 pN (purata ± SD, n = 1,773) pada kelajuan tarikan 400 nm/s (Rajah 2 A).

Kestabilan mekanikal NuG2 ialah wartawan berfungsi untuk pengikatan hFc. (A) Poliprotein regangan (NuG2)8 menghasilkan lengkung sambungan daya seperti gigi gergaji biasa yang dicirikan oleh daya terungkap ≈105 pN dan kenaikan panjang kontur ΔLc daripada ≈18 nm. Setiap puncak daya individu sepadan dengan pembukaan mekanikal domain NuG2 individu dalam poliprotein. Semua domain NuG2 terungkap pada daya yang sama ≈105 pN, seperti yang ditunjukkan oleh garis putus-putus. Garis merah sepadan dengan WLC yang sesuai dengan lengkung sambungan daya dengan ΔLc daripada 17.6 nm. (B) Kestabilan mekanikal NuG2 dipertingkatkan dengan pengikatan hFc. Apabila praequilibrated dengan 33.3 μM hFc, majoriti domain NuG2 terbentang pada daya yang lebih tinggi iaitu ≈210 pN, menunjukkan bahawa daya terungkap NuG2 boleh digunakan sebagai penunjuk untuk melaporkan pengikatan hFc yang berkesan kepada NuG2. Garis merah sepadan dengan WLC yang sesuai dengan lengkung sambungan daya dengan ΔLc daripada 18.2 nm. (C) Lengkung pelanjutan daya NuG2 pada kepekatan perantaraan hFc mengenal pasti secara langsung bentuk NuG2 terikat hFc dan bebas hFc pada tahap molekul tunggal. Apabila praequilibrated dengan 17.8 μM hFc, daya terungkap NuG2 berlaku pada dua tahap yang berbeza (seperti yang ditunjukkan oleh garis putus-putus): empat peristiwa terungkap pertama berlaku pada ≈105 pN dan boleh dikaitkan dengan terungkapnya NuG2 bebas hFc yang terakhir. empat peristiwa terungkap berlaku pada ≈210 pN, yang sepadan dengan terungkapnya NuG2 terikat hFc. Garis merah sepadan dengan WLC yang sesuai dengan data eksperimen. (Sisipan) Ilustrasi skematik regangan (NuG2)8 poliprotein antara hujung AFM dan substrat kaca jika tiada atau kehadiran hFc. Keadaan fungsi domain NuG2 dalam poliprotein juga ditunjukkan.

Histogram daya terungkap NuG2 dengan kehadiran hFc mendedahkan dua populasi NuG2 yang berbeza (bentuk bebas hFc dan terikat hFc). (A) Histogram daya terungkap NuG2 jika tiada hFc. Garis pepejal adalah kesesuaian Gaussian dengan data eksperimen. (B–G) Histogram daya terbentang NuG2 dipraiseimbangkan dengan kepekatan hFc yang berbeza. Histogram daya terungkap NuG2 menunjukkan dua puncak berasingan yang jelas dengan kehadiran hFc: satu berada pada 105 pN, yang sepadan dengan terungkapnya NuG2 bebas hFc, dan satu lagi adalah pada 210 pN, yang sepadan dengan terungkapnya NuG2 dalam kompleks dengan hFc. Kepekatan awal hFc untuk setiap histogram ditunjukkan di sebelah kanan. Setiap histogram daya terungkap telah dipasang dengan dua fungsi Gaussian (garisan pepejal), dan kawasan relatif di bawah Gaussian sesuai secara langsung mengukur pecahan bebas hFc dan terikat hFc NuG2.

Walaupun pengikatan hFc kepada NuG2 tidak memperkenalkan perubahan struktur utama kepada NuG2, ia meningkatkan kestabilan mekanikal NuG2 dengan ketara. Regangan (NuG2)8 yang telah diseimbangkan dengan 33 μM hFc menghasilkan lengkung sambungan daya seperti gigi gergaji. WLC sesuai dengan ukuran puncak daya berturut-turut ΔLc daripada ≈18 nm, menunjukkan bahawa daya terungkap memuncak hasil daripada pembukaan mekanikal domain NuG2. Walau bagaimanapun, majoriti domain NuG2 terungkap pada daya purata yang lebih tinggi iaitu 210 ± 20 pN (n = 223) daripada NuG2 jika tiada hFc (Rajah 1 B). Oleh kerana sebahagian besar domain NuG2 terikat kepada Fc pada kepekatan hFc ini, kami mengaitkan daya terungkap yang lebih tinggi iaitu 210 pN kepada pembukaan mekanikal bentuk terikat hFc NuG2. Eksperimen kawalan menolak kemungkinan puncak daya yang lebih tinggi disebabkan oleh sama ada pembukaan mekanikal domain Ig bagi hFc (SI Rajah 5) atau penimbal Tris/azide yang digunakan untuk hFc (SI Rajah 6). Keputusan ini menunjukkan dengan kuat bahawa pengikatan hFc ke NuG2 dengan ketara mengukuhkan rintangan mekanikal NuG2 kepada pembentangan yang disebabkan oleh daya, walaupun perubahan struktur kecil yang ketara disebabkan oleh pengikatan hFc.

Kestabilan Mekanikal NuG2 Berfungsi sebagai Pelapor Berfungsi untuk Pengikatan hFc kepada NuG2.

Oleh kerana bentuk NuG2 terikat hFc berbeza secara mekanikal daripada bentuk NuG2 bebas hFc, ia menjadi mungkin untuk menggunakan kestabilan mekanikal NuG2 sebagai wartawan berfungsi untuk melaporkan secara langsung keadaan mengikat domain NuG2 satu molekul pada satu masa dan tentukan populasi relatif kedua-dua bentuk NuG2 dengan kehadiran hFc. Sesungguhnya, apabila menjalankan eksperimen AFM molekul tunggal NuG2 pada pelbagai kepekatan hFc, kami memerhatikan dua populasi NuG2 yang berbeza. Contohnya, regangan (NuG2)8 praequilibrated dengan 17.8 μM hFc menghasilkan lengkung lanjutan daya dengan puncak daya terbentang yang sama jarak tetapi dengan dua tahap daya terungkap yang berbeza, satu terletak pada ≈105 pN dan tahap kedua pada ≈210 pN. Lengkung daya-sambungan tipikal ditunjukkan dalam Rajah 1 C, di mana empat kejadian berlaku pada ≈105 pN dan empat lagi berlaku pada ≈210 pN. Histogram daya terungkap (Rajah 2 E) menunjukkan dua puncak daya terbentang yang jelas berasingan berpusat pada 105 pN dan 210 pN, masing-masing. Kita boleh dengan mudah mengenal pasti domain NuG2 yang terbentang pada ≈105 pN sebagai bentuk bebas hFc NuG2, manakala domain NuG2 terungkap pada ≈210 pN sebagai bentuk NuG2 terikat hFc. Dengan mengira bilangan peristiwa terungkap NuG2 yang berlaku pada daya rendah dan tinggi, kita boleh dengan mudah menentukan taburan NuG2 antara dua populasi berbeza: bentuk NuG2 yang terikat hFc dan bebas hFc.

Dengan mengubah kepekatan hFc, kami menyiasat perubahan taburan dua bentuk NuG2. Histogram daya terungkap NuG2 di bawah kepekatan hFc yang berbeza ditunjukkan dalam Rajah 2. Jelaslah bahawa, dengan kehadiran hFc, histogram daya terungkap NuG2 menunjukkan taburan bimodal, dengan satu puncak pada ≈105 pN dan yang kedua pada ≈210 pN. Seperti yang dijangkakan, apabila meningkatkan kepekatan hFc, lebih banyak peristiwa terungkap berlaku pada ≈210 pN dan lebih sedikit peristiwa terungkap berlaku pada ≈105 pN. Dan akhirnya peristiwa yang berlaku pada ≈210 pN menjadi dominan. Keputusan ini jelas menunjukkan bahawa NuG2 bebas hFc ditukar kepada bentuk terikat hFc NuG2 apabila meningkatkan kepekatan hFc. Kedudukan kedua-dua puncak daya terungkap dalam histogram kekal tidak berubah pada kepekatan hFc yang berbeza, menunjukkan bahawa kestabilan mekanikal NuG2 terikat hFc dan bebas hFc tidak bergantung pada kepekatan hFc, dan oleh itu dua populasi NuG2 yang diperhatikan mencerminkan dua keadaan fungsi intrinsik NuG2 yang disebabkan oleh pengikatan khusus hFc kepada NuG2.

Mengukur Pemalar Pemisahan hFc kepada NuG2 pada Tahap Molekul Tunggal.

Pecahan NuG2 terikat hFc dan bebas hFc ditentukan terus daripada kawasan relatif di bawah puncak pada 105 pN dan 210 pN, masing-masing (Rajah 2). Pecahan NuG2 terikat hFc diplot terhadap kepekatan hFc (Rajah 3, segi empat sama). Oleh kerana domain NuG2 dalam poliprotein mengikat hFc secara bebas, seperti yang ditentukan oleh teknik resonans plasmon permukaan (data tidak ditunjukkan), kami memasang isoterma pengikat kepada model pengikatan tapak tunggal, yang mengambil kira semua spesies yang ada, dan mengukur pemalar pemisahan K d sebanyak 12.6 ± 0.9 μM untuk pengikatan hFc kepada NuG2.

Penentuan tepat pemalar pemisahan K d menggunakan ujian pengikatan molekul tunggal berasaskan spektroskopi daya. Pecahan NuG2 dan wt-GB1 terikat hFc diplotkan terhadap kepekatan awal ligan hFc dalam isoterma pengikat (segi empat sama, segi tiga NuG2/hFc, wt-GB1/hFc). Garis pepejal sesuai dengan isoterma pengikat menggunakan model tapak pengikat tunggal yang mengambil kira semua spesies yang terdapat dalam larutan (garis hitam, garis kelabu NuG2/hFc, wt-GB1/hFc). Yang diukur K d ialah 12.6 ± 0.9 μM untuk pengikatan hFc kepada NuG2 dan 2.2 ± 0.4 μM untuk pengikatan hFc kepada wt-GB1.

Untuk menguji sensitiviti kaedah ini, kami juga mengkaji pengikatan hFc kepada wt-GB1. Sama seperti NuG2, kestabilan mekanikal GB1 meningkat dengan ketara apabila mengikat hFc. Daya terungkap GB1 meningkat daripada 180 pN kepada 265 pN (data tidak ditunjukkan). Mengikuti prosedur yang sama, kami mengukur pecahan terikat hFc GB1 sebagai fungsi kepekatan hFc (Rajah 3, segi tiga) dan ditentukan K d sebanyak 2.2 ± 0.4 μM untuk pengikatan GB1 kepada hFc. Walaupun K d untuk NuG2 dan GB1 hanya berbeza sebanyak enam kali, ujian pengikatan molekul tunggal berasaskan spektroskopi mudah mengesan perbezaan ini, menunjukkan kepekaan tinggi ujian pengikatan berasaskan spektroskopi daya molekul tunggal. Perlu diperhatikan bahawa, walaupun K d NuG2 kepada hFc adalah kira-kira enam kali lebih tinggi daripada GB1 kepada hFc, kesan penstabilan pada kestabilan mekanikal apabila ligan mengikat adalah serupa dalam kedua-dua kes. Oleh itu, kepekaan spektroskopi daya tidak bergantung kepada kekuatan ikatan antara protein dan ligannya.

Walau bagaimanapun, perlu diperhatikan bahawa kepekaan dan ketepatan metodologi ini bergantung kepada perbezaan kestabilan mekanikal antara bentuk protein terikat ligan dan bebas ligan. Jika pengikatan ligan tidak menghasilkan perbezaan yang boleh diukur dalam kestabilan mekanikal (26, 27), seperti pengikatan ligan E9 kepada protein Im9 (26), penggunaan metodologi semasa mungkin menjadi terhad.


Pengikatan molekul CO kedua diperhatikan

IMEJ: Kofaktor besi-vanadium (FeV) dalam nitrogenase bergantung kepada vanadium dibuat untuk bertindak balas dengan karbon monoksida (CO) dan kemudian digas di bawah tekanan, membolehkan dua molekul substrat divisualisasikan. lihat lebih lanjut

Kredit: Grafik: Oliver Einsle

Melalui penetapan biologi unsur nitrogen oleh enzim nitrogenase, organisma mendapat akses kepada nitrogen molekul (N2) dalam atmosfera Bumi, yang penting untuk membina struktur selular. Selain itu, varian nitrogenase yang bergantung kepada vanadium boleh mengurangkan gas toksik karbon monoksida (CO) kepada hidrokarbon. Pengurangan N2 dan CO ini adalah antara proses terpenting dalam kimia industri, kerana ia digunakan untuk menghasilkan kedua-dua baja dan bahan api sintetik. Walau bagaimanapun, penyelidik masih belum dapat menguraikan laluan berbeza dari dua tindak balas. Dr Michael Rohde daripada pasukan Prof. Dr. Oliver Einsle di Institut Biokimia di Universiti Freiburg, dengan kerjasama dua kumpulan penyelidikan di Freie Universität Berlin, kini telah dapat menunjukkan bagaimana tapak aktif vanadium- nitrogenase bergantung mampu mengikat dua molekul CO secara serentak, dengan itu mewujudkan asas untuk menggabungkan atom karbon bersebelahan ruang kedua-dua molekul dalam proses reduktif. Para penyelidik baru-baru ini membentangkan hasil mereka dalam jurnal Kemajuan Sains.

Pengurangan industri N2 dan CO - masing-masing dikenali sebagai proses Haber-Bosch dan Fischer-Tropsch - memerlukan suhu dan tekanan yang tinggi. Walaupun pengurangan N2 membawa kepada ammonium produk bioavailable (NH4+), sekurang-kurangnya dua atom karbon bergabung semasa penukaran CO. Hasil tindak balas utama ialah etilena (etena, C2H4), gas tidak berwarna yang memainkan peranan penting bukan sahaja dalam bahan api tetapi juga dalam pengeluaran plastik. Walaupun belahan ikatan N-N dalam penetapan nitrogen secara kimia agak asasnya berbeza daripada pembentukan ikatan C-C dalam pengurangan CO, saintis sebelum ini mengesyaki bahawa nitrogenase menggunakan prinsip mekanistik asas yang sama untuk kedua-dua tindak balas.

Dalam kerja sebelumnya, pasukan yang diketuai oleh Rohde dan Einsle menggunakan nitrogenase untuk bertindak balas dengan gas CO, menghasilkan pengikatan khusus bagi satu molekul. Dalam kajian semasa mereka, yang membina kerja ini, para penyelidik menunjukkan bahawa mereka mengeluarkan gas kristal keadaan pertama ini dengan CO di bawah tekanan dan kemudian menundukkannya kepada analisis kristalografi sinar-X. Ini membolehkan mereka memerhatikan secara langsung bagaimana molekul CO kedua mengikat. "Bentuk nitrogenase yang diperoleh dengan cara ini, dengan dua molekul CO di tapak aktif, mungkin mewakili keadaan yang disekat, " Rohde menjelaskan, "tetapi ia memberikan petunjuk langsung kepada mekanisme enzim." Hasilnya, pasukan Einsle kini boleh menggariskan mekanisme terperinci pengurangan CO melalui nitrogenase.

Oliver Einsle berkhidmat sebagai profesor di Institut Biokimia Universiti Freiburg dan merupakan ahli Pusat BIOSS untuk Kajian Isyarat Biologi Universiti Freiburg.

Penerbitan asal:
Rohde, M., Laun, K., Zebger, I., Stripp, S. T., Einsle, O. (2021): Dua tapak pengikat ligan dalam CO-mengurangkan vanadium nitrogenase mendedahkan prinsip mekanistik umum. Dalam: Kemajuan Sains, Jld. 7, No. 22. DOI: 10.1126/sciadv.abg4474

Penafian: AAAS dan EurekAlert! tidak bertanggungjawab terhadap ketepatan siaran berita yang disiarkan ke EurekAlert! dengan institusi penyumbang atau untuk penggunaan sebarang maklumat melalui sistem EurekAlert.


Titik Kuantum Terkonjugasi Halo-Ligand padat untuk Pengimejan Molekul Tunggal Berbilang Warna bagi Protein GPCR yang Sesak pada Membran Sel

Untuk mengesan molekul tunggal dalam had pembelauan optik (< ca. 200 nm), teknik pengimejan pelbagai warna dibangunkan menggunakan titik kuantum terkonjugasi Halo-ligan (Halo-QDs <6 nm diameter). Menggunakan tiga jenis Halo-QD, pengimejan pendarfluor molekul tunggal pelbagai warna bagi protein GPCR dalam Dictyostelium sel tercapai.

Sebagai perkhidmatan kepada penulis dan pembaca kami, jurnal ini menyediakan maklumat sokongan yang dibekalkan oleh penulis. Bahan tersebut disemak rakan sebaya dan mungkin disusun semula untuk penghantaran dalam talian, tetapi tidak disunting salinan atau set taip. Isu sokongan teknikal yang timbul daripada maklumat sokongan (selain fail yang hilang) harus ditujukan kepada pengarang.

Nama fail Penerangan
smll201402508-sup-0001-S1.pdf841.5 KB Tambahan
smll201402508-sup-0002-S2.qt4.5 MB Tambahan
smll201402508-sup-0003-S3.qt5.9 MB Tambahan

Sila ambil perhatian: Penerbit tidak bertanggungjawab ke atas kandungan atau kefungsian sebarang maklumat sokongan yang dibekalkan oleh pengarang. Sebarang pertanyaan (selain kandungan yang tiada) hendaklah ditujukan kepada pengarang yang sepadan untuk artikel tersebut.


Robert Batey

Riboswitch ialah kelas unsur RNA bukan pengekodan yang biasa ditemui dalam 5'-UTR mRNA bakteria yang mengawal ekspresi dalam fesyen cis berdasarkan keupayaannya untuk berinteraksi secara langsung dengan metabolit selular tertentu. Pengiktirafan ligan efektor oleh mRNA dicapai oleh reseptor, yang dikenali sebagai domain aptamer, yang seni bina tertiari kompleksnya membentuk poket pengikat yang membentuk kompleks pertalian tinggi yang sangat spesifik dengan metabolit. Pengikatan efektor dikomunikasikan kepada domain kawal selia hiliran, biasanya dipanggil platform ekspresi, yang membentuk satu daripada dua struktur sekunder yang saling eksklusif yang berfungsi sebagai isyarat untuk menghidupkan atau mematikan ekspresi. Taburan luas riboswitch dalam kerajaan bakteria, termasuk banyak patogen penting dari segi perubatan seperti Staphylococcus aureus dan spesies Streptococcus, menyerlahkan kepentingan biologi mekanisme pengawalseliaan ini. Oleh kerana riboswitch sering mengawal gen metabolik penting, mereka telah menjadi sasaran minat dalam usaha untuk sebatian antimikrob baru. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, kejayaan telah dicapai ke arah mengenal pasti dan mengesahkan kelas riboswitch baharu dan menentukan cara domain aptamer mereka mengenali ligan pelbagai struktur.

Memahami pengecaman molekul kecil oleh RNA biologi

Penghabluran sinar-X ialah alat paling berkuasa yang kami sediakan untuk menjana hipotesis tentang struktur dan fungsi riboswitch. Dengan memfokuskan pada domain aptamer, reseptor untuk pengesan molekul kecil riboswitch, kami telah menentukan struktur beberapa aptamer yang berbeza termasuk purin, SAM-I, SAM-II, lisin dan SAH (lihat tab "Struktur" untuk maklumat lanjut maklumat). Sebagai tambahan kepada kompleks RNA-ligan ini, kami telah dapat menentukan struktur tidak terikat beberapa riboswitch ini untuk mula memahami sifat perubahan konformasi yang disebabkan ligan dalam aptamer. Akhirnya, kami terus mengusahakan setiap RNA ini melalui penyiasatan berterusan kompleksnya dengan molekul kecil yang lain. Struktur ini mendedahkan aspek kekhususan RNA untuk efektor serumpunnya dan keplastikan poket pengikat.

Ini membolehkan kita mendapatkan gambar tahap atom bagi riboswitch yang terikat pada effectornya yang menghasilkan pandangan baharu ke dalam kedua-dua pengiktirafan molekul kecil oleh RNA serta mekanisme riboregulation. Contoh terbaru ialah struktur riboswitch pengesan cobalamin yang merangkumi kedua-dua domain aptamer dan platform ekspresi (Nature 2012):

Sebagai tambahan kepada kerja kami tentang riboswitch, kami juga terus membangunkan alat yang memudahkan penentuan struktur RNA dengan kerjasama Prof. Jeff Kieft dari Pusat Sains Kesihatan Universiti Colorado Denver. Satu alat yang telah kami bangunkan ialah sistem penulenan RNA asli menggunakan tag tangkapan pertalian (lihat di bawah, kiri). Mengikuti transkripsi in vitro RNAP T7 standard, protein tangkapan (penyatuan lapisan His6-MBP-MS2) diikat pada tag pertalian 3' dan melepasi lajur nikel. RNA yang diminati dielusi dengan menambahkan glukosamin-6-fosfat, yang mengaktifkan ribozim GlmS. Alat kedua yang telah kami bangunkan ialah modul fasa "G-U", motif kecil yang boleh ditambah dalam heliks bentuk A yang merekrut iridium hexammine ke tapak. Modul ini (kanan) sangat penting untuk menyelesaikan pelbagai RNA oleh kumpulan kami dan yang lain.

Memahami Mekanisme Kawal Selia

Walaupun kristalografi sinar-X mampu menghasilkan model RNA yang berguna dan kompleksnya dengan protein dan molekul kecil, ia hanya mewakili gambaran dalam kehidupan mRNA. Kami menggunakan pelbagai pendekatan biofizikal dan biokimia untuk mendedahkan sifat perubahan konformasi yang disebabkan ligan dalam RNA dan bagaimana ini mempengaruhi struktur suis struktur sekunder hiliran dalam platform ekspresi.
Contoh satu pendekatan ialah teknik probing kimia yang dipanggil "SHAPE". Teknik ini menggunakan reagen yang bertindak balas dengan kumpulan 2'-hidroksil konformasi dinamik dalam tulang belakang RNA. Tindak balas reagen dengan gula membawa kepada pengubahsuaian yang boleh didedahkan sebagai hentian transkripase terbalik pada gel penjujukan. Yang penting, kita boleh menyiasat kompleks RNA atau RNA-ligan pada julat suhu yang luas untuk memantau perkembangannya dengan resolusi nukleotida. Pendekatan ini, digunakan pada riboswitch purin, mendedahkan bahawa ligan menstabilkan struktur terutamanya dalam satu kawasan bercantum yang bertindak sebagai "tudung" fleksibel yang membungkus nukleobase dalam RNA.
Yang penting, kajian ini menunjukkan bahawa pembentukan struktur tertiari yang melibatkan jujukan pensuisan digandingkan dengan ketat kepada pengikatan ligan. Ini menyediakan hubungan fizikal antara pengikatan effector dan suis pengawalseliaan hiliran.

Aplikasi riboswitch dalam biologi sintetik

Peranti yang terdiri daripada RNA muncul sebagai alat penting dalam biologi sintetik untuk aplikasi termasuk pengesanan in vivo molekul kecil dengan biosensor yang boleh dikodkan secara genetik dan elemen pengawalseliaan kejuruteraan untuk mengawal ekspresi gen. Sebahagiannya, ini adalah kerana keupayaan untuk memilih asid nukleik dengan aktiviti yang diingini menggunakan kaedah evolusi in vitro (SELEX) yang mantap. Kaedah ini tertakluk kepada kumpulan permulaan jujukan rawak kepada beberapa pusingan tekanan pemilihan dan replikasi yang terselamat. Hasilnya, apabila tekanan pemilihan adalah untuk mengikat, adalah aptamer yang mampu mengikat molekul sasaran dengan pertalian dan kekhususan yang tinggi. Dalam tempoh 20 tahun sejak pembangunannya, SELEX telah menghasilkan RNA yang mampu mengikat pelbagai jenis sebatian kimia, mendedahkan bahawa aptamer untuk hampir mana-mana molekul yang dikehendaki boleh diperolehi. Untuk kebanyakan aplikasi, aptamer mesti digandingkan dengan modul bacaan yang mengubah peristiwa pengikatan menjadi isyarat yang boleh dikesan, halangan penting dalam kejuruteraan peranti praktikal.

Sumber potensi domain bacaan modular ditemui dalam peranti kawalan genetik semulajadi yang dipanggil riboswitch. kami telah menunjukkan modulariti platform ekspresi riboswitch terpilih yang mengawal ekspresi gen pada tahap transkrip. Riboswitch chimeric ini yang terdiri daripada gabungan baru domain aptamer riboswitch dan platform ekspresi mengekalkan sifat pengawalseliaan jujukan biologi. Yang penting untuk biologi sintetik, kami mendapati bahawa suis struktur sekunder platform ekspresi ini boleh diarahkan oleh aptamer sintetik. Strategi kejuruteraan yang kami gunakan untuk menggandingkan aptamer dengan platform ekspresi modular ini secara konsepnya mudah dan memerlukan penapisan minimum bagi varian untuk mencari riboswitch yang berkesan. Suis ini berfungsi dalam kedua-dua ujian transkripsi in vitro asas dan sebagai elemen pengawalseliaan yang mengawal ekspresi gen wartawan dalam E. coli.

Contoh "campur-dan-padan" yang mudah ialah penciptaan chimera antara domain aptamer pengikat guanin (xpt daripada B. subtilis) dan platform ekspresi daripada riboswitch pengesan SAM (metE daripada B. subtilis) . Gel mewakili ujian transkripsi baca lalu pusing ganti tunggal sebagai fungsi kepekatan effector (SAM atau guanin). Ini adalah suis "OFF" di mana efektor menggalakkan pembentukan produk (T) yang ditamatkan. Data boleh dikira untuk menghasilkan kepekatan effector yang diperlukan untuk mendapatkan tindak balas pengawalseliaan separuh maksimum.

Lebih penting lagi, kami boleh melampirkan aptamer sintetik pada platform ekspresi modular metE untuk menghasilkan riboswitch chimeric yang berfungsi kedua-dua in vitro dan in vivo. Di bawah menunjukkan data untuk chimera antara aptamer teofilin terbitan SELEX dan beberapa suis RNA biologi yang berbeza.

Kami terus membangunkan alat ini dan alat lain untuk penciptaan penderia RNA yang mudah untuk aplikasi berasaskan sel serta bekerjasama dengan kumpulan lain untuk menggunakan biosensor novel ini kepada aplikasi biologi sintetik dunia sebenar.


Abstrak

Latar belakang— Walaupun sistem renin-angiotensin dan β-adrenergik saling berkaitan, interaksi langsung antara reseptor β-adrenergik (βAR) dan reseptor jenis 1 angiotensin II (AT).1Rs) belum dikenal pasti.

Kaedah dan Keputusan— Di sini, kami menyediakan bukti untuk interaksi fungsional dan fisiologi antara reseptor berganding protein 2 G: βAR dan AT1R. Sekatan terpilih βAR dalam kardiomiosit tetikus menghalang penguncupan yang disebabkan oleh angiotensin dengan IC50 yang serupa dengan perencatan penguncupan pengantara isoproterenol. Tambahan pula, pemberian valsartan penghalang reseptor angiotensin kepada tikus utuh menghasilkan pengurangan ketara dalam tindak balas maksimum terhadap peningkatan kadar denyutan jantung yang disebabkan oleh katekolamin. Mekanisme untuk kesan transinhibitori penyekat β dan penyekat reseptor angiotensin ini adalah melalui penyingkiran protein reseptor-G iaitu, penyekat β mengganggu AT.1R-Gq gandingan, dan valsartan mengganggu βAR-Gs gandingan. Akhirnya, kami menunjukkan bahawa AT1Rs dan βARs membentuk kompleks konstitutif yang tidak dipengaruhi oleh rangsangan ligan. Hasil daripada interaksi ini, antagonis reseptor tunggal secara berkesan menghalang isyarat hiliran dan pemerdagangan kedua-dua reseptor secara serentak.

Kesimpulan— Kami menunjukkan bahawa interaksi langsung antara βAR dan AT1Rs mungkin mempunyai akibat yang mendalam terhadap tindak balas keseluruhan terhadap ubat-ubatan yang menentang reseptor ini.

Kegagalan jantung adalah gangguan progresif yang melibatkan disfungsi sistem renin-angiotensin dan sistem saraf adrenergik. 1,2 Pemacu adrenergik yang berterusan selepas kecederaan pada jantung mengakibatkan keabnormalan isyarat reseptor β-adrenergik (βAR) (menurun regulasi β1AR dan pembongkaran kedua-dua β1 dan β2AR daripada protein G 3,4 ), serta bilangan reseptor jenis 1 angiotensin II (Ang II) (AT) yang berkurangan1Rs). 1 Walaupun terdapat bukti untuk peraturan maklum balas positif antara sistem renin-angiotensin dan sistem βAR, 5 sehingga kini tiada bukti cakap silang langsung pada tahap reseptor antara reseptor β-adrenergik dan angiotensin.

Kedua-dua βAR dan AT1Rs tergolong dalam superfamili G protein-coupled receptors (GPCRs), yang, setelah diaktifkan, berinteraksi dengan molekul effector melalui gandingan kepada protein G. AT1Rs menterjemahkan tindakan agonis Ang II dengan menggabungkan kepada heterotrimerik Gq/11 keluarga protein G dan pengaktifan fosfolipase Cβ (PLCβ), manakala βAR mengantara tindakan norepinephrine melalui Gs-pengaktifan bergantung kepada adenylyl cyclase. Walaupun reseptor dalam superfamili GPCR pada mulanya dipercayai berfungsi sebagai entiti monomerik, bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa mereka wujud sebagai homodimer atau heterodimer. 6

Dalam kajian ini, kami menunjukkan kewujudan interaksi langsung antara AT1Rs dan βARs dan menunjukkan bahawa mengganggu secara khusus dengan isyarat satu reseptor (iaitu, sama ada βAR atau AT1R) mengakibatkan pembongkaran dan perencatan isyarat oleh reseptor yang saling berinteraksi.

Kaedah

Penyediaan Miosit Jantung Dewasa dan Kajian Kekontratan

Tikus yang digunakan dalam kajian ini adalah tikus C57BL/6 jenis liar dewasa betina, berumur 3 hingga 6 bulan dan seberat 30 hingga 40 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Haiwan dikendalikan mengikut protokol yang diluluskan dan peraturan kebajikan haiwan Lembaga Kajian Institusi di Pusat Perubatan Universiti Duke. Myocytes telah diasingkan seperti yang diterangkan sebelum ini 7 dan digambarkan dengan mikroskop terbalik (Nikon Eclipse TE 300). Penguncupan sel tunggal diukur dengan pengesanan tepi video, dan rakaman dibuat di bawah keadaan asas dan selepas pentadbiran agen yang berbeza, seperti yang diterangkan dalam legenda angka.

Kultur dan Transfeksi Sel

COS-7 dan buah pinggang embrio manusia (HEK) 293 sel telah ditanam dalam DMEM atau medium Eagle yang diubah suai, masing-masing. Sel endothelial vena umbilical manusia (HUVECs) telah dibiakkan dalam medium lengkap EGM-2. Tikus Ang II jenis 1A-protein pendarfluor hijau (AT1R-GFP) dan AT berteg HA1R cDNA adalah hadiah murah hati daripada Dr Larry Barak (Duke University, Durham, NC), dan BENDERA-β manusia2AR ialah hadiah murah hati daripada Dr Robert Lefkowitz (Universiti Duke, Durham, NC). Transfeksi sementara dilakukan pada 60% hingga 80% monolayers konfluen dalam hidangan 100-mm dengan menggunakan FUGENE6 (Roche Molecular Biochemicals). Rangsangan agonis dilakukan pada 37 ° C dalam media bebas serum selepas prainkubasi dengan perencat yang ditunjukkan.

Immunoblotting

HUVECs atau sel COS-7 telah kebuluran serum selama 2 jam sebelum rangsangan.Reaksi telah ditamatkan dengan cepat, dan sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE, dipindahkan ke membran nitroselulosa, dan disiasat untuk kinase terkawal isyarat ekstraselular fosforilasi (ERK) menggunakan antibodi spesifik fosfo-ERK1/2 arnab poliklonal (Teknologi Isyarat Sel). Blots telah divisualisasikan dengan electrochemiluminescence (Amersham Pharmacia), dan autoradiograf dikira dengan menggunakan Fluor-S MultiImager (Bio-Rad). Tompok kemudiannya dilucutkan dan disapu dengan antibodi anti-ERK1/2 (Upstate Biotechnology, Inc) untuk menormalkan tahap ERK terfosforilasi kepada jumlah ERK.

Kajian Pengikat Ligan

Sel COS-7 disalut ke dalam pinggan 24 perigi dan dibenarkan untuk mencapai pertemuan. Tindak balas pengikatan dilakukan dalam penimbal pengikat 0.25 mL seperti yang diterangkan sebelum ini. 8 125 I-label angiotensin 0.5 nmol/L atau 125 I-labeled cyanopindolol (CYP) 125 pmol/L dan pelbagai kepekatan ligan bersaing yang tidak berlabel telah ditambah, kemudian plat diinkubasi di atas ais selama 4 jam. Pengikatan tidak spesifik ditentukan dengan penambahan 100 μmol/L Ang II atau propranolol yang tidak berlabel, masing-masing. Untuk kajian internalisasi, sel-sel COS-7 telah kebuluran serum selama 2 jam dan dirangsang dengan agen yang berbeza, seperti yang ditunjukkan dalam legenda angka. Kepekatan protein ditentukan dengan ujian Bradford (Bio-Rad). Data dianalisis menggunakan Prism 3.0 (GraphPad).

Pengukuran Inositol Fosfat

Sel COS-7 ditanam dalam 12 perigi dan diinkubasi dengan 2 μCi/well myo-[3 H]-inositol (76 Ci/mmol, Amersham) dalam medium bebas serum selama 24 jam. Sampel telah diinkubasi dengan propranolol selama 30 minit sebelum rangsangan dengan Ang II selama 60 minit lagi. Tahap inositol fosfat diukur dengan tepat seperti yang diterangkan sebelum ini. 8

Penyediaan Membran Jantung

Membran jantung kasar disediakan daripada jantung yang dipotong seperti yang diterangkan sebelum ini. 9

Kajian Pengikat GTPγS

[35 S]-berlabel GTPγS yang mengikat pada membran jantung terpencil telah diuji dalam jumlah isipadu tindak balas 50 μL seperti yang diterangkan sebelum ini. 10

Mikroskopi Konfokal

HEK 293 sel mengekspresikan AT1R-GFP atau HA-AT1R disalut pada piring kultur berdasar kaca 35 mm dan dibiarkan serum selama 3 jam sebelum rangsangan. Sel hidup telah dirawat dengan agen yang berbeza seperti yang diterangkan dalam legenda angka. Penetapan dan pewarnaan dwi sel telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini. 11 Imej dikumpulkan dengan menggunakan mikroskop confocal pengimbasan laser Olympus 1×70.

Kadar Jantung dan Pengukuran Tekanan Darah dalam Tikus Utuh

Tikus telah dibius dengan ketamin (100 mg/kg) dan xylazine (2.5 mg/kg) dan menjalani vagotomy dua hala sebelum kateterisasi untuk mengelakkan perencatan refleks dalam kadar jantung seperti yang diterangkan sebelum ini. 9 Arteri axillary kiri dikanulasi untuk rakaman berterusan tekanan darah dan kadar denyutan jantung. Dadah diberikan melalui vena jugular luaran yang betul. Haiwan kawalan disuntik dengan kenderaan, diikuti dengan dos gred isoproterenol (ISO 50 hingga 10 000 pg). Dua kumpulan haiwan lain telah disuntik dengan satu dos valsartan (250 μg) atau propranolol (1 μg) sebelum pentadbiran ISO.

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai min±SEM. Kepentingan statistik ditentukan oleh ANOVA 1 hala atau ANOVA ukuran berulang 2 hala apabila sesuai. Analisis post hoc dilakukan dengan ujian multicomparison Tukey-Kramer atau ujian Newman-Keuls apabila sesuai. Nilai daripada P<0.05 dianggap penting.

Keputusan

Untuk menguji kewujudan kemungkinan peraturan silang antara AT1Rs dan βARs di dalam hati, kami mengukur kesan penyekat β pada penguncupan Ang II-pengantara kardiomiosit tetikus yang baru diasingkan. Di bawah keadaan asas, rangsangan sel dengan Ang II mengakibatkan peningkatan ketara dalam pemendekan sel dan kadar pemendekan sel (-dL/dt) (Rajah 1, A dan B), sama dengan tindak balas yang diperhatikan oleh rangsangan dengan agonis βAR. ISO. 7 Hebatnya, penggunaan bersama propranolol penyekat β bukan selektif bersama-sama dengan Ang II memansuhkan kesan Ang II, menunjukkan tindakan langsung penyekat β pada tindak balas kontraktil pengantara Ang II (Rajah 1, A dan B). Kerana β1AR ialah subjenis utama βAR dalam hati, kami menguji kesan β terpilih1AR inhibitor metoprolol pada peningkatan penguncupan yang dimediasi Ang II. Seperti yang digambarkan dalam Rajah 1B, metoprolol juga memansuhkan tindak balas pengantara Ang II. Kedua-dua penyekat β tidak mempunyai sebarang kesan ke atas tahap pengecutan basal. Untuk mengesahkan bahawa tindakan penyekat β pada AT1R adalah pengantara reseptor, kami menguji kesan propranolol pada pembesaran bukan pengantara reseptor dalam kontraksi miosit yang disebabkan oleh perencat Na + / K + -ATPase ouabain. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, ouabain menyebabkan peningkatan ketara dalam pengecutan yang tidak terjejas dengan ketara oleh kehadiran penyekat β.

Rajah 1. β-Blockers menghalang penguncupan myocyte-mediated Ang II. A, Pengesanan perwakilan sel tunggal menunjukkan perubahan dalam panjang sel (atas) dan terbitan pertamanya (-dL/dt) (bawah) di bawah keadaan asas di mana sel dirangsang medan pada 0.5 Hz dan selepas pentadbiran 1 μmol/L propranolol (Prop), 10 μmol/L Ang II (AngII) atau kedua-duanya. B, Ringkasan % pemendekan selular dan kadar pemendekan sel (−dL/dt) daripada 5 jantung individu (10 hingga 15 miosit dari setiap jantung) pada peringkat awal dan selepas rangsangan dengan agen berbeza: 1 μmol/L Prop, 1 μmol/L metoprolol (Met), dan 100 μmol/L ouabain (Ouab). *P<0.05 lwn basal. C, Ringkasan kesan tindak balas dos propranolol pada pemendekan sel pengantara ISO- (○) dan Ang II– (•) daripada 5 jantung individu. KAD PENGENALAN50 ISO=3.0×10 −7 mol/L, IC50 Ang II=5.3×10 −7 mol/L. D, Kesan tindak balas dos propranolol pada ISO- (○) dan Ang II– (•) dimediasi −dL/dt daripada 5 hati individu. KAD PENGENALAN50 ISO=2.41×10 −7 mol/L, IC50 Ang II=4.45×10 −7 mol/L.

Untuk mendiskriminasi antara kesan pengantara βAR propranolol berbanding tindakan bebas βAR (cth, antagonis langsung reseptor angiotensin atau kesan tidak spesifik pada kecairan membran), kami mengukur IC50 untuk menghalang pengecutan dipertingkatkan ISO- dan Ang II oleh propranolol. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1C, peningkatan kepekatan propranolol menghasilkan perencatan setanding kedua-dua penguncupan pengantara ISO- dan Ang II. Tambahan pula, IC50 nilai untuk perencatan propranolol kesan ISO dan Ang II tidak berbeza secara signifikan (masing-masing 3.0×10 -7 dan 5.3×10 −7 mol/L, P=NS). Keputusan yang sama diperolehi untuk perencatan dalam kadar pengecutan dengan kehadiran β-blocker (Rajah 1D). Keupayaan penyekat β untuk menghalang pengecutan myocyte yang dirangsang Ang II dan ISO dalam julat kepekatan yang sama menyokong hipotesis kami bahawa propranolol memberikan kesannya pada isyarat angiotensin melalui βAR dan bukan melalui pengikatan kepada reseptor angiotensin.

Untuk mengecualikan secara langsung kemungkinan bahawa penyekat β menghalang isyarat pengantara Ang dengan mengganggu pengikatan Ang II kepada reseptornya, kami melakukan analisis pengikatan radioligan kompetitif dalam sel COS-7 yang utuh. Sel COS mengekspresikan β2AR dan AT1Rs pada tahap yang setanding, dengan sedikit ungkapan β1AR. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, peningkatan kepekatan Ang II yang tidak berlabel berkesan menyesarkan 125 I-Ang II mengikat. Sebaliknya, kedua-dua propranolol dan β2Antagonis AR ICI-118,551 (ICI) tidak dapat bersaing dengan ligan berlabel, menunjukkan bahawa penyekat β tidak mengganggu pengikatan Ang II ke AT1R. Dengan cara yang sama, kami mendapati bahawa penghalang reseptor Ang II valsartan, yang mengikat secara khusus kepada AT.1R, 12 tidak menyesarkan β2Antagonis AR 125 I-cyanopindolol daripada β yang dinyatakan secara endogen2AR (Rajah 2B). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahawa propranolol dan valsartan mengikat secara khusus kepada βAR dan AT1R, masing-masing, dan bahawa kesan transinhibitory pada laluan timbal balik mereka dikenakan melalui sekatan tertentu pada titik yang distal kepada ligan mengikat.

Rajah 2. trans-Rencatan aktiviti reseptor tidak dimediasi melalui pengikatan ligan kompetitif (A). Pengikatan kompetitif 125 I-Ang II dengan Ang II (○), Prop (•), dan ICI 118,551 (▴). Nilai mewakili min daripada 5 eksperimen individu untuk setiap ligan. B, Pengikatan kompetitif 125 I-CYP kepada sel COS-7. (○) ICI dan (•) valsartan. Nilai mewakili data purata daripada 5 eksperimen individu untuk setiap ligan.

Untuk menguji sama ada antagonis selektif untuk satu reseptor dapat melepaskan reseptor timbal balik daripada mengikat kepada protein G serumpunnya, kami menilai gandingan protein reseptor-G dalam membran jantung tetikus. Seperti yang digambarkan dalam Rajah 3A, rangsangan dengan Ang II meningkatkan AT1R–Gq gandingan, seperti yang ditentukan oleh [35 S]GTPγS pemuatan Gq. Walau bagaimanapun, prainkubasi membran dengan propranolol sepenuhnya menghalang AT1R–Gq gandingan. Selaras dengan pelepasan reseptor, pembentukan inositol fosfat selepas rangsangan Ang II dalam sel COS-7 telah dimansuhkan dengan kehadiran sama ada propranolol (Rajah 3B) atau ICI (tidak ditunjukkan). Untuk menguji sama ada sekatan AT1R menyebabkan kesan yang sama pada gandingan βAR kepada Gs, membran jantung telah dirangsang dengan ISO jika tiada atau kehadiran valsartan. Gandingan βAR yang disebabkan oleh ISO kepada Gs, yang mengakibatkan peningkatan ketara dalam [35 S] pemuatan GTPγS, telah disekat sepenuhnya dengan kehadiran valsartan (Rajah 3C). Selaras dengan βAR–Gs uncoupling, penjanaan pengantara ISO bagi kem utusan kedua telah terjejas dengan kehadiran valsartan dalam sel COS-7 secara endogen mengekspresikan kedua-dua reseptor (Rajah 3D).

Rajah 3. Sekatan satu reseptor menimbulkan pemisahan fungsi trans-reseptor daripada protein G serumpunnya. A, Propranolol mengganggu AT1R–Gq gandingan. Ang II-dirangsang [35 S]GTPγS mengikat kepada Gαq dalam membran kardiomiosit tanpa kehadiran atau kehadiran 10 μmol/L propranolol. Ditunjukkan ialah data daripada 6 percubaan berasingan yang dilakukan dalam tiga kali ganda. *P<0.01 lwn basal. B, Ang II-dirangsang peningkatan dalam pembentukan inositol fosfat (IP) dalam sel COS-7 tanpa kehadiran atau kehadiran 10 μmol/L Prop. Ditunjukkan ialah min±SEM daripada 6 eksperimen berasingan yang dilakukan dalam tiga kali ganda. *P<0.05 lwn basal. C, Valsartan mengganggu βAR-Gs gandingan. Ang II-dirangsang [35 S]GTPγS mengikat Gαs dalam membran kardiomiosit tanpa kehadiran atau kehadiran 10 μmol/L valsartan (Val). Ditunjukkan ialah min daripada 5 eksperimen berasingan yang dilakukan dalam tiga kali ganda. *P<0.05 lwn basal. D, Valsartan menghalang pengeluaran cAMP selepas rangsangan ISO. Peningkatan yang dirangsang oleh ISO dalam pengeluaran cAMP dengan kehadiran atau ketiadaan 10 μmol/L valsartan. Ditunjukkan ialah min±SEM daripada 5 eksperimen berasingan yang dilakukan dalam tiga kali ganda. *P<0.01 lwn basal.

Untuk menguji sama ada transinhibisi reseptor, sama ada oleh penyekat reseptor Ang II atau penyekat β, mempengaruhi isyarat hiliran oleh β2AR dan AT1Rs, kami mengukur pengaktifan kinase protein diaktifkan mitogen ERK dalam sel COS-7 utuh yang secara endogen mengekspresikan kedua-dua reseptor. Rangsangan sel dengan sama ada ISO atau Ang II mendorong peningkatan ketara dalam fosforilasi ERK (Rajah 4, A dan B) dalam cara yang bergantung kepada dos dan masa (tidak ditunjukkan), mengesahkan kewujudan kedua-dua reseptor dalam sel ini. Sama seperti pemerhatian yang dibuat dalam kajian kontraktiliti, prarawatan sel dengan propranolol memansuhkan pengaktifan Ang II-pengantara ERK (Rajah 4B, kiri). Secara timbal balik, rangsangan sel dengan ISO dengan kehadiran valsartan membatalkan pengaktifan pengantara ISO bagi laluan ERK (Rajah 4A). Seperti yang dijangkakan, β1Metoprolol antagonis selektif AR tidak mempunyai kesan ke atas pengaktifan ERK sama ada oleh ISO atau Ang II (Rajah 4A, kanan), selaras dengan fakta bahawa sel COS-7 tidak secara endogen menyatakan tahap β yang boleh dikesan1AR. Kehadiran terutamanya β2AR dalam sel COS-7 telah disahkan lagi oleh pemerhatian bahawa β2Agonis songsang AR-selektif ICI menyekat tindak balas Ang II (Rajah 4B). Data ini mengesahkan bahawa kesan penyekat β pada isyarat pengantara Ang II adalah khusus kepada subjenis reseptor yang dinyatakan dalam tisu yang dikaji.

Rajah 4. trans- Perencatan isyarat reseptor hiliran antara βAR dan AT1Rs. A, Immunoblot perwakilan yang menunjukkan pengumpulan fosfo-ERK selepas rawatan dengan 10 μmol/L ISO atau 1 μmol/L Ang II selama 5 minit berbanding dengan kawalan (CN): 10 μmol/L Prop, ICI, Val, atau Met telah ditambah 30 minit sebelum rangsangan agonis. B, Graf ringkasan mewakili data kuantitatif daripada 4 hingga 5 eksperimen bebas. *P<0.01 lwn kawalan. C, Immunoblot perwakilan menunjukkan pengumpulan p-ERK selepas rawatan HUVEC dengan 10 μmol/L ISO atau 1 μmol/L Ang II selama 5 minit tanpa kehadiran atau kehadiran 10 μmol/L Prop atau Val.

Keupayaan antagonis yang digunakan dalam kajian ini untuk menghalang isyarat reseptor timbal balik didapati bergantung terutamanya pada tahap ekspresi kedua-dua reseptor. Sebagai contoh, rangsangan HUVEC dengan ISO menghasilkan peningkatan fosforilasi ERK yang ketara (Rajah 4C). Walau bagaimanapun, sel-sel ini tidak bertindak balas terhadap rangsangan oleh Ang II, dan pengaktifan ERK yang disebabkan oleh ISO tidak sensitif terhadap rawatan dengan valsartan. Kajian pengikatan pelengkap menunjukkan bahawa berbanding dengan jantung, HUVEC mengekspresikan βAR dan AT1Rs pada nisbah ≈46:1 (masing-masing 79 berbanding 1.7 fmol/mg protein).

Penemuan bahawa sekatan farmakologi sama ada βAR atau AT1R menghasilkan pemisahan fungsional reseptor timbal balik kepada protein G yang serumpun membawa kita untuk membuat postulat bahawa kesan ini dimediasi melalui interaksi langsung antara AT1R dan βAR. Untuk menentukan sama ada AT1Rs dan βARs membentuk kompleks yang stabil, kami menggunakan strategi penandaan epitope pembezaan dan coimmunoprecipitation terpilih. 6 FLAG-epitope-tag β2AR dan AT berteg HA1Rs dinyatakan secara bersendirian atau bersama-sama, pada tahap ekspresi rendah yang sama, dan sel-sel terdedah kepada Ang II, ISO, atau propranolol. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A, imunopresipitasi FLAG-β2AR menghasilkan coimmunoprecipitation HA-AT1Rs jika tiada ligan (jalur 3). Tambahan pula, jumlah kompleks yang dimendakan tidak terjejas oleh kehadiran sama ada agonis reseptor atau antagonis (lorong 4 hingga 6), menunjukkan bahawa reseptor ini dipasang sebagai oligomer sebelum penyetempatan mereka pada membran plasma. 13

Rajah 5. βAR dan AT1Rs membentuk kompleks yang stabil. A, sel COS-7 ditransfeksi secara sementara dengan sama ada FLAG- β2AR (lorong 1 dan 7), HA-AT1R (lorong 2 dan 8), atau kedua-duanya (lorong 3 hingga 6) dirawat selama 30 minit dengan 1 μmol/L Ang II (lorong 4), 10 μmol/L ISO (lorong 5), atau 10 μmol/L propranolol ( Prop) (lorong 6). Protein imunoprecipitated (IP) telah diselesaikan oleh SDS-PAGE dan immunoblotted (IB) untuk FLAG-β2AR dan HA-AT1R menggunakan monoklonal M2 anti-FLAG-affinity agarose atau monoclonal Affinity matrix HA-11, masing-masing. Kemunculan populasi heterogen reseptor adalah kerana glikosilasi berubah-ubah dan/atau pembentukan kompleks dengan berat molekul yang lebih tinggi. B, sel HEK 293 dengan ekspresi endogen βAR telah ditransfeksi secara sementara dengan AT1R-GFP di bawah keadaan yang menghasilkan tahap yang sama bagi kedua-dua reseptor (protein 10 hingga 40 fmol/mg). Sel telah dirawat dengan 10 μmol/L Ang II (kiri) atau prarawatan dengan 10 μmol/L propranolol selama 15 hingga 20 minit sebelum rangsangan dengan Ang II (kanan). Anak panah menunjukkan vesikel dalaman yang terbentuk selepas rangsangan. Imej confocal mewakili 4 eksperimen bebas. C, Imej perwakilan sel HEK 293 dengan ekspresi endogen βAR dan overexpression HA-AT1R. Sel telah diprainkubasi tanpa kehadiran atau kehadiran 10 μmol/L H-89 selama 20 minit sebelum rangsangan dengan 10 μmol/L ISO selama 12 minit. D, Penyertaan AT endogen1R selepas rangsangan agonis. Sel COS-7 yang kebuluran serum dirawat dengan 1 μmol/L Ang II atau 10 μmol/L ISO selama 30 minit. Prainkubasi dengan 10 μmol/L H-89 dilakukan 20 minit sebelum rangsangan. Nilai mewakili min±SEM daripada 5 eksperimen berasingan yang dilakukan dalam tiga kali ganda. *P<0.01 lwn basal. E, Imej perwakilan sel HEK 293 yang menyatakan AT1R-GFP (hijau) dan FLAG-β2AR (merah) prarawatan dengan 10 μmol/L Val selama 20 minit sebelum rangsangan dengan 10 μmol/L ISO. Anak panah menunjukkan rupa β2AR dalam vesikel endositik, yang diperhatikan hanya dalam sel yang tidak mempunyai AT1R.

Untuk menentukan lagi sama ada terdapat interaksi langsung antara βAR dan AT1Rs, kami memeriksa sama ada rangsangan atau sekatan 1 reseptor menjejaskan keupayaan reseptor lain untuk menjalani proses internalisasi selepas rangsangan agonis. 14,15 HEK 293 sel yang menyatakan tahap βAR endogen yang sama dan AT bertag GFP yang ditransfeksi1Rs telah dirangsang dengan Ang II jika tiada atau kehadiran propranolol. Pengintegrasian GFP-AT1R telah divisualisasikan dalam bentuk agregat reseptor di bawah mikroskop confocal pengimbasan laser. Seperti yang dijangkakan, GFP-AT1Rs mengalami internalisasi yang ketara selepas rangsangan Ang II (Rajah 5B, kiri). Walau bagaimanapun, prarawatan βAR endogen dengan propranolol menghalang GFP-AT yang disebabkan oleh Ang II1R internalisasi, dan reseptor kekal pada permukaan membran plasma (Rajah 5B, kanan).

Analisis AT1R internalisasi menunjukkan bahawa AT1Rs dihayati oleh sama ada Ang II atau rangsangan ISO (Rajah 5, C dan D). Yang penting, hanya 30% hingga 40% daripada AT1Rs diinternalisasi sebagai tindak balas kepada ISO, berbanding dengan ≈80% sebagai tindak balas kepada Ang II. Kerana βAR dan AT1Rs memaparkan corak internalisasi yang berbeza berdasarkan keupayaan mereka untuk mengikat β-arrestin, 16 kehadiran AT1Dimer R–βAR boleh mengubah sifat kitar semula AT1R kepada βAR.

Oleh kerana endositosis GPCRs didahului oleh fosforilasi reseptor, ada kemungkinan pengaktifan PKA yang dimediasi βAR boleh menggalakkan fosforilasi, penyahpekaan, dan internalisasi melalui penyahpekaan heterolog. 17 Untuk menguji kemungkinan ini, kami meneliti kesan perencat selektif PKA H-89 ke atas internalisasi AT yang disebabkan oleh ISO.1R. Seperti yang dilihat oleh kedua-dua mikroskop confocal (Rajah 5C) dan kajian pengikatan ligan (Rajah 5D), perencatan PKA tidak menghalang penghayatan AT1R sebagai tindak balas kepada ISO, menyokong idea bahawa interaksi langsung antara 2 reseptor, dan bukannya rangsangan aktiviti protein kinase, bertanggungjawab terhadap kesan ke atas pemerdagangan reseptor.

Kesan valsartan pada internalisasi βAR dinilai dalam sel HEK 293, yang tidak menunjukkan tahap AT yang dapat dikesan1Rs dengan pengikatan ligan. Sel ditransfeksi dengan sama ada FLAG-β2AR sahaja atau dengan kedua-dua FLAG-β2AR dan GFP-AT1R telah dirangsang dengan ISO dengan kehadiran valsartan. Sel yang menyatakan hanya β2AR (merah) menunjukkan internalisasi yang ketara selepas rangsangan ISO (Rajah 5E, anak panah putih). Walau bagaimanapun, internalisasi dalam sel yang menyatakan kedua-dua βAR (merah) dan GFP-AT1Rs (hijau) sebagai tindak balas kepada ISO telah terjejas dengan ketara dengan kehadiran valsartan.

Untuk menentukan sama ada penemuan in vitro kami boleh diterjemahkan ke dalam konteks in vivo, kami menguji kesan dos tunggal valsartan pada peningkatan kadar denyutan jantung yang dirangsang ISO dalam tikus jenis liar yang utuh, vagotomized. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6A, peningkatan dos ISO menghasilkan peningkatan yang ketara dalam kadar denyutan jantung, dengan separuh daripada tindak balas maksimum berlaku pada dos 1 ng setiap tetikus. Prarawatan dengan satu dos propranolol menghasilkan anjakan ketara keluk tindak balas ISO ke kanan, seperti yang dijangkakan daripada antagonis β kompetitif klasik. Sebaliknya, satu dos valsartan menghasilkan pengurangan 25% yang ketara dalam kadar denyutan jantung, dengan separuh tindak balas maksimum berlaku pada dos 1.4 ng setiap tetikus. Keupayaan valsartan untuk melemahkan kadar jantung yang dirangsang ISO tanpa mengubah tindak balas separuh maksimum menunjukkan penurunan dalam keberkesanan agonis tanpa kesan ke atas potensi agonis. Pentadbiran valsartan atau propranolol tidak mempunyai kesan ke atas tekanan darah periferi berbanding dengan kumpulan kawalan, mencadangkan kesan langsung valsartan pada jantung (Rajah 6B).

Rajah 6. Valsartan mengurangkan peningkatan kadar degupan jantung yang dirangsang ISO. A, Penilaian in vivo perubahan dalam kadar denyutan jantung sebagai tindak balas kepada peningkatan dos ISO (○, n=12) selepas pentadbiran akut 250 μg valsartan (•, n=15) atau 1 μg propranolol (♦, n=6). Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA pengukuran berulang. Ujian post hoc dilakukan dengan ujian Newman-Keuls (*P<0.005 valsartan lwn kawalan, †P<0.0005 prop vs kawalan). Kesan utama antara kumpulan yang ketara sebagai tindak balas kepada kedua-dua ubat didapati (P<0.001). Corak perubahan antara kumpulan juga berbeza secara statistik (P<0.00001). B, Perubahan dalam tekanan darah sebagai tindak balas kepada peningkatan dos ISO (○, n=12) dengan kehadiran 250 μg valsartan (•, n=15) atau 1 μg propranolol (♦, n=6).

Perbincangan

Penemuan utama kajian ini ialah AT1Rs boleh berinteraksi secara langsung dengan kedua-dua subtipe βAR dan bahawa interaksi ini menimbulkan fenomena di mana sekatan βAR terpilih menghalang isyarat AT1Rs, manakala AT terpilih1Sekatan R menghalang isyarat hiliran βAR. Lebih-lebih lagi, mekanisme untuk perencatan dwi 2 reseptor bebas oleh antagonis tunggal adalah melalui penyingkiran fungsi reseptor isyarat daripada protein G serumpunnya.

Paradigma yang diterima untuk isyarat GPCR adalah bahawa reseptor ini berfungsi sebagai unit tunggal (monomer), secara bebas mampu bergandingan dengan protein G dan mengaktifkan/menghalang molekul effector. Berdasarkan keputusan kami dan keputusan yang diperoleh untuk GPCR lain, 8 kami mencadangkan peralihan dalam paradigma ini dengan mencadangkan bahawa lebih daripada 1 reseptor mungkin terlibat dalam gandingan protein reseptor-G yang cekap, sekali gus menyediakan peranan baru untuk oligomerisasi in vivo GPCR. Oleh kerana salah satu reseptor dalam kompleks (reseptor "tidak memberi isyarat") harus bebas daripada antagonis untuk membenarkan gandingan dan isyarat reseptor yang diaktifkan ligan, ia mungkin mempunyai peranan dalam menstabilkan interaksi reseptor yang diaktifkan dengan G serumpunnya. protein. 18 Oleh itu, ada kemungkinan bahawa sekatan sama ada βAR atau AT1Rs mendorong perubahan konformasi yang tidak lagi menguntungkan untuk menyokong interaksi reseptor lain dengan protein Gnya (iaitu, AT1R–Gq atau βARs–Gs). Sifat perubahan konformasi dengan kehadiran sama ada agonis atau antagonis dan kesannya pada reseptor timbal balik sedang disiasat.

Bukti terkumpul menunjukkan bahawa pembentukan oligomer oleh GPCR menambah tahap kerumitan kepada isyarat mereka. Di sini, kami menunjukkan interaksi antara AT1Rs dan βARs dan mengemukakan bukti bahawa hasil daripada interaksi ini, antagonis reseptor tunggal secara serentak menyekat isyarat dan pemerdagangan kedua-dua reseptor. Penemuan ini disokong oleh pemerhatian baru-baru ini yang dibuat dalam sel-sel kanser prostat, di mana sekatan sama ada reseptor bradikinin jenis 1 atau reseptor bradikinin jenis 2 mengakibatkan gandingan dan isyarat terjejas oleh reseptor timbal balik tanpa mengganggu pengikatan ligan. 8 Oleh kerana data kami, serta kajian lain, 19 menunjukkan bahawa dimerisasi ialah proses konstitutif, tindak balas keseluruhan organ kepada agonis atau antagonis kemungkinan besar akan bergantung pada tahap dan gabungan kompleks GPCR yang diungkapkannya. Dalam hal ini, baru-baru ini telah ditunjukkan bahawa AT1Dimer reseptor R-bradikinin meningkatkan keberkesanan dan potensi Ang II 20 dan bahawa peningkatan bilangan dimer ini menjadi pengantara hipersensitiviti yang disebabkan oleh Ang II dalam preeklampsia. 21 Di sini, kami juga menunjukkan bahawa walaupun βAR sensitif terhadap valsartan di dalam hati, mereka tidak terjejas oleh ubat ini dalam sel endothelial, yang menyatakan nisbah βAR yang jauh lebih besar kepada AT.1Rs. Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan bahawa tahap ekspresi reseptor yang berbeza mempunyai kesan kritikal terhadap tindak balas keseluruhan tisu tertentu kepada antagonis reseptor terpilih.

Sekatan terpilih angiotensin dan laluan isyarat adrenergik pada pesakit dengan kegagalan jantung sederhana dan teruk telah ditunjukkan untuk meningkatkan kelangsungan hidup dan kualiti hidup. 22–25 Oleh kerana beberapa ciri jantung yang gagal adalah keabnormalan yang berbeza dalam sistem βAR, pada masa ini dipercayai bahawa banyak kesan berfaedah penyekat β adalah hasil daripada antagonisme kesan sitotoksik katekolamin yang beredar dan normalisasi. Isyarat βAR. 2 Memandangkan data in vitro dan in vivo kami, kami mencadangkan bahawa penyekat β mungkin mempunyai peranan baru tambahan dalam menyekat terus laluan pengantara Ang II, dengan itu mendapat kawalan ke atas 2 laluan isyarat yang memainkan peranan penting dalam fungsi jantung dan sangat terlibat dalam patofisiologi jantung yang gagal.

Walaupun terdapat sedikit bukti fizikal langsung untuk AT1Dimerisasi R-βAR dalam hati, kami percaya bahawa data kami sangat menyokong kewujudan cakap silang reseptor langsung dalam vivo. Oleh itu, kemungkinan transinhibisi isyarat reseptor mempunyai potensi implikasi yang luas apabila penggunaan AT1Antagonis R dan βAR dipertimbangkan dalam rawatan keadaan penyakit seperti kegagalan jantung, terutamanya kerana penggunaan 1 antagonis boleh menyekat lebih daripada 1 laluan isyarat. Walaupun berhati-hati adalah wajar berkenaan dengan terjemahan data in vitro kepada hasil ujian klinikal, data kami mungkin memberikan penjelasan biologi untuk penemuan yang tidak dijangka daripada kajian valsartan dalam pesakit kegagalan jantung (percubaan klinikal Val-Heft 6), dalam rawatan pesakit dengan gabungan penyekat β, valsartan, dan perencat ACE mengakibatkan peningkatan dalam kejadian buruk. 26 Jika memang AT1Interaksi R-βAR berlaku dalam vivo, seperti yang dicadangkan oleh data kami, penyekat β bersama-sama dengan valsartan akan menghasilkan perencatan hampir lengkap kedua-dua laluan isyarat reseptor, kerana setiap antagonis menyekat bukan sahaja reseptornya sendiri tetapi juga isyarat reseptor timbal balik oleh mekanisme transinhibisi. Penambahan perencat ACE akan menurunkan tahap peredaran Ang II dan norepinefrin melalui perencatan sistem renin-angiotensin dan sistem saraf simpatetik. 27 Oleh itu, gabungan kesemua 3 ubat mungkin bertindak bersama-sama untuk menekan teruk 2 sistem isyarat melebihi titik kritikal yang diperlukan untuk mengekalkan homeostasis.

Kesimpulannya, kajian ini menunjukkan bahawa interaksi langsung antara βAR dan AT1Rs in vivo mempunyai peranan yang mendalam dalam menentukan tindak balas keseluruhan terhadap ubat-ubatan yang direka untuk menyekat reseptor ini. Oleh itu, pemahaman yang lebih baik tentang interaksi kompleks antara GPCR yang berbeza dalam vivo mungkin mempunyai implikasi penting untuk pembangunan rawatan farmakologi yang sangat spesifik untuk pelbagai gangguan kardiovaskular.

Artikel ini pada asalnya muncul dalam talian pada 8 September 2003 (Peredaran. 2003108:r79–r86).

Kerja ini disokong oleh sebahagiannya oleh geran Institut Kesihatan Nasional HL-56687 dan Dana Wellcome Burroughs (kedua-duanya kepada Dr Rockman). Dr Rockman ialah penerima Anugerah Saintis Klinikal Dana Burroughs Wellcome dalam Penyelidikan Translasi. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kristine Hesser Porter, Dr Lan Mao, dan Weili Zou untuk bantuan teknikal yang sangat baik.


Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Mike Stubbington untuk perbincangan yang bermanfaat mengenai topik meramalkan kekhususan sel T. D.S.F. mengiktiraf sokongan daripada persekutuan Yayasan Penyelidikan Jerman (DFG) melalui Sekolah Siswazah Biosains Kuantitatif Munich (QBM) [GSC 1006 hingga D.S.F.] dan oleh Joachim Herz Stiftung. B.S. mengiktiraf sokongan kewangan daripada Program Fellowship Pascadoktoral Helmholtz Zentrum München. F.J.T. mengiktiraf sokongan kewangan daripada Sekolah Siswazah QBM, Yayasan Penyelidikan Jerman (DFG) dalam Pusat Penyelidikan Kolaboratif 1243, Subprojek A17, oleh Persatuan Helmholtz (Geran Inkubator sparse2big, geran #ZT-I-0007), oleh geran BMBF #01IS18036A , dan geran #01IS18053A dan oleh Chan Zuckerberg Initiative DAF (dana nasihat Yayasan Komuniti Silicon Valley, 182835). Kami berterima kasih kepada Pusat Perkhidmatan Maklumat dan Pengkomputeran Berprestasi Tinggi (ZIH) di TU Dresden atas peruntukan masa komputer yang banyak.

DSF dan YW melaksanakan mod dan melakukan analisis. DSF, BS, dan FJT menulis manuskrip.


B1. Pengikatan Ligan Tunggal - Biologi

Bakul anda kosong pada masa ini. i <p>Apabila menyemak imbas protein UniProt yang berbeza, anda boleh menggunakan 'bakul' untuk menyimpannya, supaya anda boleh kembali untuk mencari atau menganalisisnya kemudian.<p><a href='/help/basket' target='_top'> Lagi. </a></p>

Pilih item dan klik pada "Tambah ke bakul" untuk mencipta koleksi anda sendiri di sini
(maksimum 400 penyertaan)

Tapak pengikat

Terakhir diubah suai pada 21 Mei 2019

Subseksyen bahagian Fungsi ini menerangkan interaksi antara asid amino tunggal dan entiti kimia yang lain. Keutamaan diberikan kepada anotasi ligan fisiologi.

Sekumpulan residu pengikat ligan yang dipisahkan oleh tidak lebih daripada tiga residu ditunjukkan sebagai 'Wilayah'

Sifat umum ligan (substrat, karbohidrat dll.) ditunjukkan dalam medan 'Penerangan. Jika ditakrifkan, komposisi kimia yang tepat juga disediakan.
Contoh: P83790

Apabila entiti kimia yang mengikat asid amino adalah logam, maklumat ini disimpan dalam subseksyen 'Metal binding'.
Contoh: P24146

Secara lalai, interaksi melibatkan rantai sisi asid amino. Untuk interaksi yang dimediasi melalui atom nitrogen rantai sisi histidin, kami menunjukkan, apabila diketahui, nitrogen yang terlibat: Kelebihan ialah istilah yang digunakan untuk atom nitrogen yang paling hampir dengan alfa-karbon, dan tele untuk yang lain.
Contoh: Q57I19, P73925

Interaksi yang berlaku melalui oksigen atau nitrogen tulang belakang juga dinyatakan.
Contoh: Q8CFV9

Interaksi dianggap sebagai bukan kovalen secara lalai. Apabila bahan terikat secara kovalen dengan kofaktor atau kumpulan prostetik, ini ditunjukkan dengan menggunakan 'kovalen' yang memenuhi syarat.
Contoh: P81280

Untuk sisa enzim yang mengikat kedua-dua substrat dan hasil tindak balas yang telah kami pilih untuk menunjukkan pengikatan kepada substrat.
Contoh: P08019

Subseksyen ini melengkapkan maklumat tentang pengikatan kovalen yang diterangkan dalam subseksyen 'Sisa diubahsuai', 'Glikosilasi' dan 'Lipidasi' serta maklumat dalam subseksyen 'Tapak aktif' berkenaan perantaraan tindak balas yang tidak stabil.


Rujukan

Hynes RO: Integrins: Dwiarah, mesin isyarat alosterik. sel. 2002, 110: 673-687. 10.1016/S0092-8674(02)00971-6.

DeMali KA, Wennerberg K, Burridge K: Integrin memberi isyarat kepada sitoskeleton aktin. Biol Sel Opin Curr. 2003, 15: 572-582. 10.1016/S0955-0674(03)00109-1.

Schwartz MA, Assoian RK: Integrin dan percambahan sel: pengawalan kinase yang bergantung kepada cyclin melalui laluan isyarat sitoplasma. J Sel Sci. 2001, 114: 2553-2560.

Ginsberg MH, Partridge A, Shattil SJ: Peraturan Integrin. Biol Sel Opin Curr. 2005, 17: 509-516. 10.1016/j.ceb.2005.08.010.

Acuan AP, Humphries MJ: Pengawalseliaan fungsi integrin melalui kerumitan konformasi: bukan sekadar tindak balas lutut?. Biol Sel Opin Curr. 2004, 16: 544-551. 10.1016/j.ceb.2004.07.003.

Springer TA, Wang JH: Struktur tiga dimensi integrin dan ligannya, dan peraturan konformasi lekatan sel. Adv Protein Chem. 2004, 68: 29-63.

Brower DL, Brower SM, Hayward DC, Ball EE: Evolusi molekul integrin: Gen mengekod subunit integrin β daripada karang dan span. Proc Nat Acad Sci USA. 1997, 94: 9182-9187. 10.1073/pnas.94.17.9182.

Ewan R, Huxley-Jones J, Mold AP, Humphries MJ, Robertson DL, Boot-Handford RP: The integrins of the urochordate Ciona intestinalis memberikan pandangan baru tentang evolusi molekul keluarga integrin vertebrata. BMC Evol Biol. 2005, 5: 31-10.1186/1471-2148-5-31.

Fassler R, Meyer M: Akibat kekurangan ekspresi gen integrin β1 pada tikus. Genes Dev. 1995, 9: 1896-1908.

Stephens LE, Sutherland AE, Klimanskaya IV, Andrieux A, Meneses J, Pedersen RA, Damsky CH: Pemadaman integrin β1 dalam tikus mengakibatkan kegagalan jisim sel dalam dan kematian peri-implantasi. Genes Dev. 1995, 9: 1883-1895.

Brakebusch C, Fässler R: fungsi integrin β1 dalam vivo: lekatan, penghijrahan dan banyak lagi. Metastasis Kanser Rev. 2005, 24: 403-411. 10.1007/s10555-005-5132-5.

Danen EHJ, Sonnenberg A: Integrin dalam pengawalan perkembangan dan fungsi tisu. J Laluan. 2003, 201: 632-641. 10.1002/path.1472.

Xiong JP, Stehle T, Diefenbach B, Zhang R, Dunker R, Scott DL, Joachimiak A, Goodman SL, Arnaout MA: Struktur kristal segmen ekstraselular integrin αVβ3. Sains. 2001, 294: 339-345. 10.1126/sains.1064535.

Xiao T, Takagi J, Coller BS, Wang JH, Springer TA: Asas struktur untuk alosteri dalam integrin dan mengikat kepada terapeutik fibrinogen-mimetik. alam semula jadi. 2004, 432: 59-67. 10.1038/alam02976.

Shi M, Sundramurthy K, Liu B, Tan SM, Law SK, Lescar J: Struktur kristal domain plexin-semaphorin-integrin/domain hibrid/I-EGF1 segmen daripada subunit integrin manusia β2 pada resolusi 1.8Å. J Biol Chem. 2005, 280: 30586-30593. 10.1074/jbc.M502525200.

Tuckwell DS, Humphries MJ: Ramalan struktur untuk kawasan pengikat ligan subunit integrin β: bukti untuk kehadiran domain faktor von Willebrand A. FEBS Lett. 1997, 400: 297-303. 10.1016/S0014-5793(96)01368-3.

Takagi J, Kamata T, Meredith J, Puzon-McLaughlin W, Takada Y: Mengubah kekhususan ligan bagi integrin αvβ1 dan αvβ3 dengan menukar jujukan pelbagai pendek subunit β. J Biol Chem. 1997, 272: 19794-19800. 10.1074/jbc.272.32.19794.

Lin EC, Ratnikov BI, Tsai PM, Carron CP, Myers DM, Barbas CF, Smith JW: Pengenalpastian rantau dalam subunit integrin β3 yang memberikan kekhususan mengikat ligan. J Biol Chem. 1997, 272: 23912-23920. 10.1074/jbc.272.38.23912.

Takagi J, DeBottis DP, Erickson HP, Springer TA: Peranan gelung penentu kekhususan domain integrin β subunit I seperti dalam ekspresi autonomi, persatuan dengan subunit α, dan pengikatan ligan. Biokimia. 2002, 41: 4339-4347. 10.1021/bi016047u.

Acuan AP, Barton SJ, Askari JA, Craig SE, Humphries MJ: Peranan tapak pengikat kation ADMIDAS dalam pengecaman ligan oleh integrin α5β1. J Biol Chem. 2003, 278: 51622-51629. 10.1074/jbc.M306655200.

Chen J, Salas A, Springer TA: Regulasi bistable kelekatan integrin oleh gugusan ion logam bipolar. Nat Struct Biol. 2003, 10: 995-1001. 10.1038/nsb1011.

Acuan AP, Barton SJ, Askari JA, McEwan PA, Buckley PA, Craig SE, Humphries MJ: Perubahan konformasi dalam domain integrin β A menyediakan mekanisme untuk transduksi isyarat melalui pergerakan domain hibrid. J Biol Chem. 2003, 278: 17028-17035. 10.1074/jbc.M213139200.

Hughes PE, Diaz-Gonzalez F, Leong L, Wu C, McDonald JA, Shattil SJ, Ginsberg MH: Memecahkan engsel integrin. Kekangan struktur yang ditentukan mengawal isyarat integrin. J Biol Chem. 1996, 271: 6571-6574. 10.1074/jbc.271.12.6571.

Kiema T, Lad Y, Jiang P, Oxley CL, Baldassarre M, Wegener KL, Campbell ID, Ylanne J, Calderwood DA: Asas molekul filamin yang mengikat integrin dan persaingan dengan talin. Sel Mol. 2006, 21: 337-347. 10.1016/j.molcel.2006.01.011.

Nasevicius A, Ekker SC: 'Ketukan' gen sasaran yang berkesan dalam ikan zebra. Nat Genet. 2000, 26: 216-220. 10.1038/79951.

Wienholds E, Schulte-Merker S, Walderich, Plasterk RH: Penyahaktifan gen rag1 ikan zebra yang dipilih sasaran. Sains. 2002, 297: 99-102. 10.1126/sains.1071762.

Berghmans S, Jette C, Langenau D, Hsu K, Stewart R, Look T, Kanki JP: Membuat gelombang dalam penyelidikan kanser: model baharu dalam ikan zebra. Bioteknik. 2005, 39: 227-237.

Zon LI, Peterson RT: Penemuan dadah in vivo dalam ikan zebra. Nat Rev Drug Discov. 2005, 4: 35-44. 10.1038/nrd1606.

Wehrle-Haller B, Imhof BA: Patologi yang bergantung kepada Integrin. J Pathol. 2003, 200: 481-487. 10.1002/path.1399.

Sheppard D: Fungsi in vivo integrin: pengajaran daripada mutasi nol pada tikus. Matriks Biol. 2000, 19: 203-209. 10.1016/S0945-053X(00)00065-2.

Bouvard D, Brakebusch C, Gustafsson E, Aszodi A, Bengtsson T, Berna A, Fassler R: Akibat fungsional mutasi gen integrin pada tikus. Circ Res. 2001, 89: 211-223.

Qian Y, Noya M, Ainsworth AJ: Pencirian molekul dan pengedaran leukosit bagi molekul integrin β1 teleost. Doktor haiwan Immunol Immunopathol. 2000, 76: 61-74. 10.1016/S0165-2427(00)00200-2.

Yamanouchi J, Hato T, Tamura T, Fujita S: Pengenalpastian sisa kritikal untuk pengikatan ligan dalam integrin β3 I-domain oleh mutagenesis terarah tapak. Thromb Haemost. 2002, 87: 756-762.

Jaillon O, Aury JM, Brunet F, Petit JL, Stange-Thomann N, Mauceli E, Bouneau L, Fischer C, Ozouf-Costaz C, Bernot A, Nicaud S, Jaffe D, Fisher S, Lutfalla G, Dossat C, Segurens B, Dasilva C, Salanoubat M, Levy M, Boudet N, Castellano S, Anthouard V, Jubin C, Castelli V, Katinka M, Vacherie B, Biemont C, Skalli Z, Cattolico L, Poulain J, De Berardinis V, Cruaud C , Duprat S, Brottier P, Coutanceau JP, Gouzy J, Parra G, Lardier G, Chapple C, McKernan KJ, McEwan P, Bosak S, Kellis M, Volff JN, Guigo R, Zody MC, Mesirov J, Lindblad-Toh K , Birren B, Nusbaum C, Kahn D, Robinson-Rechavi M, Laudet V, Schachter V, Quetier F, Saurin W, Scarpelli C, Wincker P, Lander ES, Weissenbach J, Roest Crollius H: Penduaan genom dalam ikan teleost Tetraodon nigroviridis mendedahkan proto-karyotype vertebrata awal. alam semula jadi. 2004, 431: 946-57. 10.1038/alam03025.

Meyer A, Van de Peer Y: Dari 2R hingga 3R: bukti untuk duplikasi genom khusus ikan (FSGD). Bioessay. 2005, 27: 937-945. 10.1002/bies.20293.

Christoffels A, Koh EG, Chia JM, Brenner S, Aparicio S, Venkatesh B: Analisis genom Fugu menyediakan bukti untuk penduaan genom keseluruhan awal semasa evolusi ikan bersirip sinar. Mol Biol Evol. 2004, 21: 1146-1151. 10.1093/molbev/msh114.

Postlethwait J, Amores A, Cresko W, Penyanyi A, Yan Y-L: Pembahagian subfungsi, sinaran teleost dan anotasi genom manusia. Trend Genet. 2004, 20: 481-490. 10.1016/j.tig.2004.08.001.

Huhtala M, Heino J, Casciari D, de Luise A, Johnson MS: Evolusi Integrin: cerapan daripada genom ikan ascidian dan teleost. Matriks Biol. 2005, 24: 83-95. 10.1016/j.matbio.2005.01.003.

Ohno S: Evolusi oleh pertindihan gen. 1970, Springer, New York

Yan YL, Willoughby J, Liu D, Crump JG, Wilson C, Miller CT, Penyanyi A, Kimmel C, Westerfield M, Postlethwait JH: Sepasang Sox: fungsi yang berbeza dan bertindih bagi co-ortholog zebrafish sox9 dalam sirip kraniofasial dan pektoral pembangunan. Pembangunan. 2005, 132: 1069-1083. 10.1242/dev.01674.

Lister JA, Close J, Raible DW: Gen mitf pendua dalam ikan zebra: Ekspresi pelengkap dan pemuliharaan potensi melanogenik. Dev Biol. 2001, 237: 333-344. 10.1006/dbio.2001.0379.

Stupack DG, Puente XS, Boutsaboualoy S, Storgard CM, Cheresh DA: Apoptosis sel yang melekat dengan pengambilan caspase-8 kepada integrin tidak terikat. J Sel Biol. 2001, 155: 459-470. 10.1083/jcb.200106070.

Kendall RL, Wang G, Thomas KA: Pengenalpastian bentuk larut semula jadi reseptor faktor pertumbuhan endothelial vaskular, FLT-1, dan heterodimerisasinya dengan KDR. Biochem Biophys Res Komuniti. 1996, 226: 324-328. 10.1006/bbrc.1996.1355.

Root LL, Shippley GD: Fibroblas manusia biasa menghasilkan isoform FGFR-1 yang terikat membran dan larut. Sel Mol Biol Res Commun. 2000, 3: 87-97. 10.1006/mcbr.2000.0199.

Arend WP: Antagonis reseptor Interleukin 1. Ahli baru keluarga interleukin 1. J Clin Invest. 1991, 88: 1445-1451.

Djaffar I, Chen YP, Creminon C, Maclouf J, Cieutat AM, Gayet O, Rosa JP: Transkrip alternatif baharu mengekod bentuk integrin β3 terpotong 60 kDa. Biochem J. 1994, 300: 69-74.

Coe AP, Askari JA, Kline AD, Robinson MK, Kirby H, Stephens PE, Humphries MJ: Penjanaan serpihan integrin-Fc minimum α5β1. J Biol Chem. 2001, 276: 35854-35866. 10.1074/jbc.M103639200.

Boot-Handford RP, Tuckwell DS: Kolagen fibrillar: kunci kepada evolusi vertebrata? Kisah sumbang mahram molekul. Bioessay. 2003, 25: 142-151. 10.1002/bies.10230.

Taylor JS, Braasch I, Frickey T, Meyer A, Van de Peer Y: Penduaan genom, sifat yang dikongsi oleh 22000 spesies ikan bersirip sinar. Genome Res. 2003, 13: 382-390. 10.1101/gr.640303.

Venkatesh B: Evolusi dan kepelbagaian genom ikan. Curr Opin Genet Dev. 2003, 13: 588-592. 10.1016/j.gde.2003.09.001.

Loh YH, Christoffels A, Brenner S, Hunziker W, Venkatesh B: Pengembangan meluas keluarga gen claudin dalam ikan teleost, Fugu rubripes. Genome Res. 2004, 14: 1248-1257. 10.1101/gr.2400004.

Steinke D, Salzburger W, Braasch I, Meyer A: Banyak gen dalam ikan mempunyai kadar asimetri spesifik spesies evolusi molekul. BMC Genomics. 2006, 7: 20-10.1186/1471-2164-7-20.

Altschul SF, Madden T, Schaffer A, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ: Gapped BLAST dan PSI-BLAST: generasi baharu program carian pangkalan data protein. Asid Nukleik Res. 1997, 25: 3389-3402. 10.1093 / nar / 25.17.3389.

Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG: Antara muka tingkap ClustalX: strategi fleksibel untuk penjajaran jujukan berbilang dibantu oleh alat analisis kualiti. Penyelidikan Asid Nukleik. 1997, 24: 4877-4882.

Felsenstein J: PHYLIP (Analisis Filogenetik Menggunakan Parsimony). Diedarkan oleh pengarang: Jabatan Genetik, Universiti Washington, Seattle, Amerika Syarikat. 1993

Strimmer K, von Haesler A: Pemetaan kemungkinan: kaedah mudah untuk kandungan filogenetik visual bagi penjajaran jujukan. Proc Nat Acad Sci USA. 1996, 94: 6815-6819. 10.1073/pnas.94.13.6815.

Huelsenbeck JP: MrBayes: Bayesian inferens filogeni. Diedarkan oleh pengarang: Jabatan Biologi, Universiti Rochester, Amerika Syarikat. 2000

Takagi J, Beglova N, Yalamanchili P, Blacklow SC, Springer TA: Definisi seperti EGF, modul berinteraksi rapat yang mengandungi epitop pengaktifan dalam subunit integrin β. Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98: 11175-11180. 10.1073/pnas.201420198.


Tonton videonya: Senyawa Koordinasi part 1. - Ion Kompleks, Ligan, Hibridisasi, Bentuk Molekul (Disember 2022).